《乳制品中乳糖的測定——核磁共振波譜法》行業(yè)標準編制說明一、工作簡況1.任務來源根據《工業(yè)和信息化部辦公廳關于印發(fā)2020年第三批行業(yè)標準制修訂和外文版項目計劃的通知》（工信廳科〔2020〕263號），《乳制品中乳糖的測定——核磁共振波譜法》列入行業(yè)標準計劃項目，項目計劃號為2020-1733T-QB，由全國特殊膳食標準化技術委員會歸口。2.主要工作過程起草階段標準任務下達后，研究院于2020年6月-2021年3月標準起草工作組查閱大量國內外核磁共振定量檢測技術方法與標準，通過對各方法的原理及特點進行對比分析，選擇外標法進行乳制品中乳糖含量的測定，對樣品的處理方法、水峰壓制、檢測條件等進行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過穩(wěn)定性、準確性等一系列了研究，建立了一維核磁共振氫譜法測定乳制品中乳糖含量分析方法。2021年4月，召開了《乳制品中乳糖的測定--核磁共振波譜法》行業(yè)標準起草啟動會議，對基于核磁共振波譜法測定乳制品中的乳糖的可行性、準確性等方面進行充分討論。2021年4月-2022年5月本方法經過中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、中國科學化學研究所、首都師范大學、北京大學、信陽師范學院、武漢中科牛津波譜技術有限公司、中國科學技術大學7家實驗室進行了方法驗證，結果符合要求。征求意見階段2022年6月，全國食品發(fā)酵標準化中心對《乳制品中乳糖的測定--核磁共振波譜法》征求意見稿面向社會進行公開征求意見。3.主要參加單位及工作組成員所做工作本標準由中輕技術創(chuàng)新中心有限公司、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、中輕檢驗認證有限公司、中國科學化學研究所、北京大學、信陽師范學院、武漢中科牛津波譜技術有限公司、中國科學技術大學、首都師范大學等單位共同起草。起草成員：略工作內容：組織標準起草及實驗室方法可行性驗證；制定研究方案、撰寫標準文本和編制說明；負責分析方法優(yōu)化建立與驗證、樣品檢驗分析；收集、整理國內外相關標準和技術資料，組織、協(xié)調、審核等工作；協(xié)助提供技術資料，參與樣品檢測及數(shù)據整理；對本標準涵蓋的全部內容提出編寫和修改意見。二、標準編制原則和主要內容標準編制原則本標準為首次制定，通過綜合分析各類乳制品樣品的特點和核磁共振波譜各種檢測方法的特點及市場發(fā)展需求，以實際乳制品樣品檢測數(shù)據為依據，經過科學研究而制定。本標準的制定充分考慮乳制品行業(yè)發(fā)展需求，促進乳制品行業(yè)提高產品質量，增強企業(yè)的市場競爭力，保護消費者權益，確保標準的科學性、先進性、可操作性。所以本標準的制定符合產業(yè)發(fā)展的原則，本著先進性、科學性、合理性和可操作性的原則，以標準的目標性、統(tǒng)一性、協(xié)調性、適用性、一致性和規(guī)范性原則來進行本標準的制定工作。本標準按照GB/T1.1-2009等給出的規(guī)則起草。標準主要內容的說明范圍本文件規(guī)定了乳制品中乳糖的測定方法。本文件適用于牛奶、發(fā)酵乳、奶片、奶酪、奶粉中乳糖的測定。方法檢出限及定量限：固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，牛奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法JY/T0578—2020超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測試方法通則JJF1448—2014超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀校準規(guī)范原理脈沖寬度定量（PulseLengthBasedConcentrationDetermination，PULCON）外標法是基于信號強度互易原理，即給定線圈中樣品化合物的NMR信號強度與90°脈沖寬度成反比。通過介電特性（離子強度）在樣品間的變化來補償因線圈靈敏度損失的信號強度，將外部參考樣品的校準轉移到實際樣品中。每次定量前，需測定具有已知濃度的用于校準的外部參考樣品（如2g/L檸檬酸樣品），計算定量因子。樣品定量公式如下：（1）式中：C——分析物濃度(g/L)；A——信號積分面積；MW——分析物的相對分子質量；NH——質子數(shù)；NS——掃描次數(shù)；P1——1H90°脈沖寬度；T——檢測溫度（K）；CF——校正因子；Quantref——外部參考樣品；Sample——待測分析物。結果計算方法校正因子是在NMR波譜儀和測量條件等因素相互影響情況下對樣品定量結果的校正，如校正水信號的壓制對測量過程的影響等。校正因子的計算：乳糖標準品質量與溶液體積之比為縱坐標，外標法所得的質量與溶液體積之比為橫坐標，建立線性回歸方程y=ɑx+β，ɑ即校正因子（CF）。乳糖系列標準工作溶液上機樣品質量濃度按照公式（1）計算:………………（1）式中：CQ——外標檸檬酸溶液上機樣品質量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；MWQ——檸檬酸摩爾質量，單位為克每摩爾（g/mol）；AS——上機樣品中乳糖定量峰積分面積；AQ——外標檸檬酸溶液上機樣品中檸檬酸定量峰積分面積；nHQ——外標檸檬酸溶液上機樣品中檸檬酸積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量；nHS——上機樣品中乳糖積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量；NSQ——外標檸檬酸溶液上機樣品掃描次數(shù)；NSS——上機樣品掃描次數(shù)；PS——上機樣品1H90°脈沖寬度；PQ——外標檸檬酸溶液上機樣品1H90°脈沖寬度；TS——上機樣品檢測溫度，單位為開爾文（K）；TQ——外標檸檬酸溶液上機樣品檢測溫度，單位為開爾文（K）；MWS——乳糖摩爾質量，單位為克每摩爾（g/mol）?；貧w方程繪制：由公式（1）計算得到的乳糖系列標準工作溶液上機樣品質量濃度為橫坐標，乳糖系列標準工作溶液上機樣品質量濃度為縱坐標，建立線性回歸方程y=ɑx+β，校正因子（CF）為線性回歸方程的斜率ɑ。固體樣品結果計算固體樣品中乳糖的含量按照公式（2）計算:………（2）式中：CS-S——固體樣品中乳糖的含量，單位為克每千克（g/kg）；CS——由公式（1）計算所得固體樣品母液中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；V——固體樣品用水定容后的體積，單位為毫升（mL）；ms——稱取的固體樣品質量，單位為克（g）；CF——校正因子，線性回歸方程的斜率ɑ。計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，小數(shù)點后保留一位數(shù)字。液體樣品結果計算：液體樣品中乳糖的含量按照公式（3）計算:………………（3）式中：CS-L——液體樣品中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；CS——由公式（1）計算所得液體樣品母液中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；CF——校正因子，線性回歸方程的斜率ɑ；計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，小數(shù)點后保留一位數(shù)字。(5)精密度分析選取一份牛奶樣品，采用1HNMR方法，同一天內重復測定5次，分析該方法的日內精密度；重復測定5天，測定結果取每日測定量的平均值，進行日間精密度分析，結果如表1所示。由表1可知，以檸檬酸作為PULCON的外標參考物，方法的日內和日間精密度相對標準偏差（RSD）分別為0.58%和0.56%。外標方法的日內和日間RSD均小于1%；由表2可知，方法的日內和日間精密度相對標準偏差（RSD）分別為0.42%和0.94%。外標方法的日內和日間RSD均小于1%。采用T檢驗法分析日內與日間同一牛奶樣品中乳糖測定結果的差異性，統(tǒng)計結果表明日內與日間檢測結果無顯著性差異（p>0.05），以上表明1HNMR牛奶乳糖檢測方法滿足精密度的要求。表1檸檬酸作為外標方法日間與日內精密度（n=5）類型乳糖測定值（g/L）均值（g/L）RSD（%）12345日內33.733.533.833.333.533.60.58%日間33.633.333.30.56%在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不超過算術平均值的10%。(6)檢出限及定量限固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，純奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。3、解決的主要問題本標準的制定解決了國內現(xiàn)行GB5413.5-2016，即萊因—埃農氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法等。萊茵-埃農氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對操作人員的操作技能要求較高，耗時長、操作繁瑣，滴定終點肉眼不易判斷，易產生誤差，結果不太準確。直接滴定法應用于復雜乳制品基質中存在多種還原糖的情況下，測定結果在一定程度上會受到干擾，測定結果準確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對于檢測的干擾，但其顯著缺點是耗時長、分析成本較高、示差折光檢測器的選擇性、重復性和穩(wěn)定性不足，尤其對于乳制品復雜基質中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對檢測條件的要求比較嚴格，樣品需在堿性條件下起顯色反應，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點是測定時間長，時效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預測模型，建立模型過程比較復雜，費時費力，且操作人員需要具備較強的數(shù)據分析建模能力；此外，由于水分子對紅外具有較強的吸收，會在一定程度上干擾液體樣品的檢測，測定結果準確性不足。本標準的制定充分考慮乳制品行業(yè)發(fā)展需求，促進乳制品行業(yè)提高產品質量，增強企業(yè)的市場競爭力，保護消費者權益，確保標準的科學性、先進性、可操作性。三、主要試驗（或驗證）情況分析針對核磁共振波譜技術測定乳制品中乳糖的含量方法進行了系統(tǒng)研究，詳細的研究數(shù)據見附件一。（1）方法線性關系：以檸檬酸為定量外標，在0.05~51.2g/L濃度范圍內，相關系數(shù)R2大于0.997，線性關系良好。（2）方法穩(wěn)定性：日內與日間RSD分別為0.42%和0.94%；檸檬酸外標法日內與日間RSD分別為0.58%和0.56%；（3）方法加標回收率：檸檬酸外標法的回收率在74%~90.3%之間；RSD在0.03%~0.61%范圍之間，說明該該方法做了回收率實驗及和國標方法的對比實驗，準確性良好。四、標準中涉及的專利本標準不涉及專利問題。五、產業(yè)化情況、推廣應用論證和預期達到的經濟效果等情況1）乳糖的功效乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖縮合而成的一種雙糖，其甜度約為蔗糖的17%。乳糖可以促進新陳代謝，有助于腸道內的乳酸菌繁殖增長以及腸道內礦物質的吸收，抑制腸內有害細菌的繁殖增長，防止齲齒。2）產業(yè)現(xiàn)狀近些年來，隨著我國乳業(yè)的快速發(fā)展，乳制品質量也暴露出各種隱患，其中牛乳中摻假尤為嚴重，快速、準確的測定乳制品所包含的成分對保證乳制品品質、防止摻假以及保障人民身體健康具有重要的意義。由于乳糖在牛乳中含量比較穩(wěn)定，通常為4.5%～5.0%，摻假物的添加容易使乳糖的含量發(fā)生較為明顯的變化，因此，原料乳中是否存在摻假行為可以通過測定牛乳中乳糖含量進行初步判斷。此外，根據低乳糖牛奶工藝研究發(fā)現(xiàn)，我國成人腸道缺乏乳糖酶人群占比大于90%，他們無法將乳制品中的乳糖轉化為半乳糖和葡萄糖，飲用正常乳糖含量乳制品后，會引起一系列胃脹氣、痙攣、消化不良和腹痛腹瀉等一系列不適癥狀（即乳糖不耐癥）。為滿足眾多乳糖不耐癥消費者的需求，低乳糖乳制品開始深受廣大消費者和食品市場歡迎，低乳糖產品未來具有十足的市場發(fā)展空間。3）檢測方法比對目前乳品中乳糖含量的檢測主要采用國標GB5413.5-2010，即萊因—埃農氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法等。萊茵-埃農氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對操作人員的操作技能要求較高，耗時長、操作繁瑣，滴定終點肉眼不易判斷，易產生誤差，結果不太準確。直接滴定法應用于復雜乳制品基質中存在多種還原糖的情況下，測定結果在一定程度上會受到干擾，測定結果準確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對于檢測的干擾，但其顯著缺點是耗時長、分析成本較高、示差折光檢測器的選擇性、重復性和穩(wěn)定性不足，尤其對于乳制品復雜基質中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對檢測條件的要求比較嚴格，樣品需在堿性條件下起顯色反應，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點是測定時間長，時效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預測模型，建立模型過程比較復雜，費時費力，且操作人員需要具備較強的數(shù)據分析建模能力；此外，由于水分子對紅外具有較強的吸收，會在一定程度上干擾液體樣品的檢測，測定結果準確性不足。綜上所述：亟需開發(fā)一種能夠實現(xiàn)對乳制品中乳糖含量進行快速、準確且高效的定量方法。4）預期達到的社會效益本標準的實施，將解決目前乳制品中乳糖含量測定方法標準不足的問題，規(guī)范了乳制品行業(yè)生產，為國內外銷售及開展對外技術、經濟交流提供檢測依據。同時，有利于消費者選擇適合的產品，保障我國乳制品保持健康有序的發(fā)展。在推動和指導乳制品開發(fā)、產業(yè)升級發(fā)展方面具有重要社會和經濟效益。六、與國際、國外對比情況本標準沒有采用國際標準。本標準制定過程中未查到同類國際、國外標準。本標準制定過程中未測試國外的樣品、樣機。本標準從乳糖行業(yè)的實際情況出發(fā)，參考了國內外相關資料，體現(xiàn)了科學性、先進性和可操作性原則，在制定過程中充分考慮國內相關的法規(guī)要求，結合乳糖行業(yè)的特點；與相關標準法規(guī)標準協(xié)調一致。因此，綜合評價本標準水平達到國內領先水平。在標準體系中的位置，與現(xiàn)行相關法律、法規(guī)、規(guī)章及相關標準，特別是強制性標準的協(xié)調性本專業(yè)領域的標準體系框架如圖。本標準在工業(yè)發(fā)酵技術標準體系中屬于“14食品”-“11-特殊膳食食品”-“99其他”。本標準與現(xiàn)行相關法律、法規(guī)、規(guī)章及相關標準協(xié)調一致。八、重大分歧意見的處理經過和依據無重大分歧意見。九、標準性質的建議說明建議本標準的性質為推薦性行業(yè)標準。十、貫徹標準的要求和措施建議在本標準通過審核、批準發(fā)布之后，由相關部門組織力量對本標準進行宣貫，在行業(yè)內進行推廣。建議本標準自發(fā)布6個月之后開始實施。十一、廢止現(xiàn)行相關標準的建議無。十二、其它應予說明的事項無。附件一乳制品中乳糖的測定—核磁共振波譜法方法學驗證研究背景核磁共振（NuclearMagneticResonance，NMR）波譜技術不僅是一種有機化合物結構解析的代表性分析方法，還在1963年首次應用于定量分析，確定了26種純有機物質中的分子內質子比率。近年來，NMR波譜定量技術已經在藥物分析、代謝組學、食品分析鑒別等領域得到了較為廣泛的運用。與氣相色譜法、高效液相色譜法等傳統(tǒng)分析方法相比，NMR法僅需要很少的樣品量，便可直接地測定啤酒，果汁，葡萄酒，嬰兒配方奶粉等不同食品基質中的多種化合物，而無需預先將復雜混合物中的待測物質分離，具有同時測定被測樣品中多種成分含量等優(yōu)點。乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖縮合而成的一種雙糖，其甜度約為蔗糖的17%。乳糖可以促進新陳代謝，有助于腸道內的乳酸菌繁殖增長以及腸道內礦物質的吸收，抑制腸內有害細菌的繁殖增長，防止齲齒。近些年來，隨著我國乳業(yè)的快速發(fā)展，乳制品質量也暴露出各種隱患，其中牛乳中摻假尤為嚴重，快速、準確的測定乳制品所包含的成分對保證乳制品品質、防止摻假以及保障人民身體健康具有重要的意義。由于乳糖在牛乳中含量比較穩(wěn)定，通常為4.5%～5.0%，摻假物的添加容易使乳糖的含量發(fā)生較為明顯的變化，因此，原料乳中是否存在摻假行為可以通過測定牛乳中乳糖含量進行初步判斷。此外，根據低乳糖牛奶工藝研究發(fā)現(xiàn)，我國成人腸道缺乏乳糖酶人群占比大于90%，他們無法將乳制品中的乳糖轉化為半乳糖和葡萄糖，飲用正常乳糖含量乳制品后，會引起一系列胃脹氣、痙攣、消化不良和腹痛腹瀉等一系列不適癥狀（即乳糖不耐癥）。為滿足眾多乳糖不耐癥消費者的需求，低乳糖乳制品開始深受廣大消費者和食品市場歡迎，低乳糖產品未來具有十足的市場發(fā)展空間。國標GB28050-2011《預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》明確規(guī)定：低乳糖，乳糖含量≤2g/100g(mL)；無乳糖，乳糖含量≤0.5g/100g(mL)，但是目前市場上存在虛假聲稱的低乳糖和無乳糖奶制品，損害了消費者的合法權益，嚴重阻礙了中國乳業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。目前乳品中乳糖含量的檢測主要采用國標GB5413.5-2010，即萊因—埃農氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法]等。萊茵-埃農氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對操作人員的操作技能要求較高，耗時長、操作繁瑣，滴定終點肉眼不易判斷，易產生誤差，結果不太準確。直接滴定法應用于復雜乳制品基質中存在多種還原糖的情況下，測定結果在一定程度上會受到干擾，測定結果準確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對于檢測的干擾，但其顯著缺點是耗時長、分析成本較高、示差折光檢測器的選擇性、重復性和穩(wěn)定性不足，尤其對于乳制品復雜基質中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對檢測條件的要求比較嚴格，樣品需在堿性條件下起顯色反應，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點是測定時間長，時效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預測模型，建立模型過程比較復雜，費時費力，且操作人員需要具備較強的數(shù)據分析建模能力；此外，由于水分子對紅外具有較強的吸收，會在一定程度上干擾液體樣品的檢測，測定結果準確性不足。綜上所述：亟需開發(fā)一種能夠實現(xiàn)對乳制品中乳糖含量進行快速、準確且高效的定量方法。2材料與方法2.1材料與試劑乳糖標準品（D-Lactose，≥99.5%，Sigma，USA；疊氮化鈉（高純，NaN3，Biotopped），CIL；3-（三甲基硅烷基）氘代丙酸鈉（Sodium-3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4，TSP，98%），CIL；重水（D2O，99.9%），青島騰龍微波科技有限公司；檸檬酸（99%），Vetec；市售乳制品（樣品編號為1-5號，其中1-2號為不同品牌的液體乳制品，3-5號為不同品牌的固體乳制品，均購于某電商平臺）。2.2儀器與設備BrukerAvanceIIIHD400MHz波譜儀，德國BrukerBiospin公司；Bruker自動進樣器(SampleJet)，德國BrukerBiospin公司；BrukerSampleJet5mm高通量核磁管，德國BrukerBiospin公司；渦旋混合器(MX-S)，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司。中佳高速離心機離心機，安徽中佳科學儀器有限公司,KQ2200DE型數(shù)控超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。2.3方法2.3.1乳糖標準儲備液乳糖標準儲備液：用天平精確稱取0.512g乳糖標準品于10mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻后得到51.2g/L乳糖標準儲備液。2.3.2外標溶液的配制外標溶液：用天平精確稱取0.2g檸檬酸標準品于100mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻后得到2.0g/L檸檬酸標準溶液。2.3.3緩沖溶液的配制TSP溶液（10.0g/L）：用天平精確稱取0.5gTSP標準品于50mL容量瓶，再加入5mg疊氮化鈉，用重水定容，搖勻后得到10.0g/LTSP標準溶液。2.3.4上機樣品制備牛奶準確稱取10g（精確至1mg)牛奶樣品于50ml的燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，再搖勻之后，用稀鹽酸調pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過濾，準確量取900μL濾液，100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測。發(fā)酵乳準確稱取10g（精確至1mg)發(fā)酵乳樣品于50ml的燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，再搖勻之后，用稀鹽酸調pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過濾，準確量取900μL濾液，100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測。奶粉準確稱取1g奶粉樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過濾，準確量取900μL濾液，100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測。奶片將奶片研磨成粉末，再準確稱取1g樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過濾，準確量取900μL濾液，100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測。奶酪將奶酪研磨，再準確稱取1g樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過濾，準確量取900μL濾液，100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測。2.3.51HNMR采樣參數(shù)實驗所采用的1HNMR的共振頻率為400.13MHz；檢測溫度300K（±0.1）；空掃次數(shù)（DS）為4次；掃描次數(shù)（NS）為64次；譜寬（SW）為20.5524；采樣點數(shù)（TD）為65536；接收增益（RG）為16；弛豫延遲（D1）為4s。以3-（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP，δ=0）作為化學位移的零點。標準的脈沖序列（NOESYGPPR）用于水（δ=4.8）的信號抑制，有效的減弱了水峰對檢測的干擾。2.3.6標準曲線的繪制準確吸取一定體積的乳糖標準儲備液，用蒸餾水逐級稀釋，配制成濃度分別為51.2g/L、25.6g/L、12.8g/L、6.4g/L、3.2g/L、1.6g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L乳糖標準溶液，并取少量蒸餾水作為空白對照。分別加入100μL質量分數(shù)為1%的TSP重水溶液。2.3.7精密度分析本文選取其中一個樣品溶液，同一天內連續(xù)測定5次，取平均值，分析方法的日內精密度；連續(xù)測定5天，每天測定5次并取平均值，分析方法的日間精密度。2.3.8回收率實驗平行稱取25份1號樣品，用蒸餾水溶解并轉移至容量瓶定容。其中5份作為對照組，其余20份由低至高，分別加入四個不同濃度水平的乳糖標準品溶液，每個水平重復5次，測定其1HNMR譜圖，計算回收率和相對標準偏差。2.3.9方法對比將核磁共振定量法、高效液相色譜行業(yè)標準方法GB5413.5—2010和樣品標簽標注的乳糖的含量進行對比分析，驗證分析方法的準確性。3結果與分析3.1外標法定量脈沖寬度定量（PulseLengthBasedConcentrationDetermination，PULCON）外標法是基于信號強度互易原理，即給定線圈中樣品化合物的NMR信號強度與90°脈沖寬度成反比。通過介電特性（離子強度）在樣品間的變化來補償因線圈靈敏度損失的信號強度，將外部參考樣品的校準轉移到實際樣品中。每次定量前，需測定具有已知濃度的用于校準的外部參考樣品（如2g/L檸檬酸樣品），計算定量因子。樣品定量公式如下： （1）式中：C為分析物濃度(mg/L)；A為信號積分面積；MW為分析物的相對分子質量；NH為質子數(shù)；NS為掃描次數(shù)；P1為1H90°脈沖寬度；T為檢測溫度（K）；CF為校正因子；Quantref為外部參考樣品；Sample為待測分析物。3.2校正因子（CF）校正因子是在NMR波譜儀和測量條件等因素相互影響情況下對樣品定量結果的校正，如校正水信號的壓制對測量過程的影響等。3.3校正因子的計算乳糖標準品質量與溶液體積之比為縱坐標，外標法所得的質量與溶液體積之比為橫坐標，建立線性回歸方程y=ɑx+β，ɑ即校正因子（CF）。3.4乳糖1HNMR譜中乳糖特征峰確認、定量峰以及外標物的選擇乳糖（D-Lactose）是一種雙糖，由一分子β-D-半乳糖和一分子α-D-葡萄糖在β-1,4-位形成糖苷鍵相連，乳糖在D2O中存在α和β兩種構型，化學結構如圖1所示，其中A代表β-乳糖，B代表α-乳糖。根據乳糖結構（見圖1），乳糖中葡萄糖基的端基質子存在α和β兩種構型，且在D2O中可相互轉化，不宜用于定量；α-D-半乳糖基的端基質子特征信號峰（δH4.45ppm）與樣品中其它成分信號峰無重疊，僅裂分為雙重峰，峰形尖銳，適合定量。但由于α-D-半乳糖基的端基質子特征信號峰（δH4.45ppm）與基質水特征信號峰（δH4.70ppm）距離比較近，考慮到水峰壓制可能對準確定量結果產生的影響，本研究采用校正因子（CF）來校正水峰信號的壓制對定量結果的準確性，與國內外文獻報道一致；此外，YuliaB.Monakhova等人也是選取α-D-半乳糖基的端基質子特征信號峰（δH4.45ppm）作為乳糖定量特征峰，基于核磁共振技術實現(xiàn)了普通牛奶和脫乳制品中乳糖含量的準確定量，因此，綜合考慮后選取α-D-半乳糖基的端基質子特征信號峰（δH4.45ppm）作為乳制品中乳糖含量定量特征峰。圖1乳糖1HNMR譜圖圖2乳糖在水中構型PULCON外標法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準轉移到實際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號重疊，具有較高的精確度和準確度[27]。此外，采用PULCON外標法成本相對較低，可重復多次利用，進一步降低了核磁共振的檢測成本，簡化了前處理操作。檸檬酸結構簡單，根據1HNMR譜顯示，其僅在δH2.65和δH2.52處存在兩組雙峰，且兩組雙峰對稱，易于辨認，用于定量分析結果準確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物。3.5實際乳糖樣品1HNMR譜圖按照2.3.4的條件下測定得到乳糖食品的1HNMR譜圖（見圖3），上、中、下分別代表的是發(fā)酵乳樣品（a）、奶粉樣品（b）和奶酪樣品（c）的1HNMR檢測圖，由圖3可知，δ4.44特征信號峰與周圍質子信號峰未發(fā)生重疊現(xiàn)象。（a）（b）（c）圖3乳糖樣品1HNMR特征峰3.6方法學考察3.6.1線性關系以乳糖標準品質量與溶液體積之比為縱坐標，外標法所得的質量與溶液體積之比為橫坐標。檸檬酸作為定量外標，乳糖標準品在0.05~51.20g/L濃度范圍內，外標法乳糖回歸方程為y=1.0441x+0.1365，R2=0.9997，說明該方法線性關系良好。3.6.2精密度分析（日內日間精密度）選取一份牛奶樣品，采用1HNMR方法，同一天內重復測定5次，分析該方法的日內精密度；重復測定5天，測定結果取每日測定量的平均值，進行日間精密度分析，結果如表1所示。由表1可知，以檸檬酸作為PULCON的外標參考物，方法的日內和日間精密度相對標準偏差（RSD）分別為0.58%和0.56%。外標方法的日內和日間RSD均小于1%；由表2可知，方法的日內和日間精密度相對標準偏差（RSD）分別為0.42%和0.94%。外標方法的日內和日間RSD均小于1%。采用T檢驗法分析日內與日間同一牛奶樣品中乳糖測定結果的差異性，統(tǒng)計結果表明日內與日間檢測結果無顯著性差異（p>0.05），以上表明1HNMR牛奶乳糖檢測方法滿足精密度的要求。表1檸檬酸作為外標方法日間與日內精密度（n=5）類型乳糖測定值（g/L）均值（g/L）RSD（%）12345日內33.733.533.833.333.533.60.58%日間33.633.333.30.56%3.6.3回收率實驗在同一份液體樣品中分別加入7.5g/L、25.0g/L、50.0g/L、100.0g/L四份不同濃度水平的乳糖標準品溶液，同一份奶片及奶酪品中分別加入40.0g/kg、130.0g/kg、250.0g/kg、500.0g/kg四份不同濃度水平的乳糖標準品溶液，同一份奶粉中分別加入50.0g/kg、170.0g/kg、340.0g/kg、680.0g/kg四份不同濃度水平的乳糖標準品溶液，每個濃度水平平行重復5次，采用PULCON檸檬酸外標法進行定量分析，定量結果取5次重復測定的平均值，如表2至表5所示。外標法的回收率在74%~90.3%之間，結果表明以檸檬酸作為PULCON外標參考物的外標法，精確度良好，能夠滿足牛奶中乳糖含量的準確定量測定要求。表2外標法液體樣品方法回收率（n=5)基質乳糖含量（g/L）加標量（g/L）測定值（g/L）回收率（%）RSD（%）平均回收率（%）牛奶41.37.547.988.00.2081.825.161.078.50.1550.882.480.90.10100.0121.079.70.12發(fā)酵乳30.17.637.790.30.6181.925.650.882.70.5750.767.674.00.56100.9110.580.40.09表3外標法固體樣品方法回收率（n=5)基質乳糖含量（g/kg）加標量（g/kg）測定值（g/kg）回收率（%）RSD（%）平均回收率（%）奶片273.537.2304.382.70.2478.9127.4372.677.80.21249.8468.878.20.12497.563奶粉479.449.9524.490.70.2182.6167.8606.777.40.28336.3753.981.60.16670.51020.680.70.06奶酪48.437.37982.10.2083.9127.29249.525883.90.23497.5466.284.00.043.6.4檢出限與定量限固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，純奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。3.6.5方法對比應用上述已經建立的1HNMR外標定量方法和國標GB5413.5—2010高效液相色譜法分別對市售5個不同種類乳制品樣品基質中的乳糖含量進行檢測，每個樣品平行前處理兩次，每個樣品重復測定2次，定量測定結果取平均值，結果如表5所示，進一步統(tǒng)計分析1HNMR法與國標法檢測結果的差異。以國標高效液相色譜法測定結果為橫坐標，以1HNMR檸檬酸外標的定量結果為縱坐標做線性回歸，其線性回歸關系R2為0.98，結果表明1HNMR與國標GB5413.5—2010高效液相色譜法測定結果誤差在±5%以內，滿足方法的可行性驗證要求，研究結果表明1HNMR定量法可以廣泛用于市售不同種類牛奶中乳糖的含量的準確測定。表3核