T/CVMA169—2024禽腺病毒4型間接ELISA抗體檢測(cè)方法Indirectenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofantibodiesagainstfowladenovirusserotype42024-7-4發(fā)布2024-7-4實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I疫病預(yù)防控制中心、四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、北京市動(dòng)物疫病預(yù)12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范板上包被禽腺病毒4型重組Fiber-2蛋白抗原后，如果待檢血清中存在禽腺病毒4型抗體，就會(huì)與包被的Fiber-2蛋白發(fā)生反應(yīng)，并繼續(xù)和相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgY抗體結(jié)合形成復(fù)合物。加入酶呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。通過酶標(biāo)儀讀數(shù)的方式判定待檢雞血清中是否有禽腺病毒4型抗體。5.5酶標(biāo)記物：商品化的辣根過氧化物26設(shè)備及耗材6.52℃~8℃冰箱、-20℃冰箱。6.10一次性注射器（5mL～10mL）。采集靜脈血時(shí)，每只雞使用一個(gè)注射器。宜進(jìn)行靜脈采血，不少于2mL。室溫靜置于斜面，待血液自然凝固后，置2℃~8℃冰箱中放置不少于2h，4000血清樣品若在一周內(nèi)檢測(cè)，可置2℃~8℃條件下保存；若超過一周檢測(cè)，應(yīng)置于-20℃以下冷凍保存。樣品的保存與運(yùn)輸應(yīng)符合NY/T541的規(guī)定，樣品的生物安全標(biāo)識(shí)符合《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技3使用包被緩沖液將禽腺病毒4型重組Fiber-2蛋白稀釋至1.5μg/mL。每孔加入100μL稀釋后毒4型重組Fiber-2蛋白包被酶標(biāo)板，置于2℃~8℃包被16h。包被結(jié)束后，棄去包被緩沖液，每孔加入300μL洗滌液，重復(fù)洗板5次，每次洗滌后應(yīng)將包被板置于25℃干燥2h。裝入鋁箔袋，放入干燥劑，抽真空，置于2℃~8℃保存?zhèn)溆?。用樣品稀釋液將待檢樣品按1:41進(jìn)行稀μL。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15min。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入300記物。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15min。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入300μL洗滌液，重復(fù)洗板5次，每次每孔分別加入50μL顯色液A和50μL顯色液B。37℃恒酶標(biāo)儀測(cè)量并且記錄樣品和對(duì)照在450nm處的吸光值（OD450），9結(jié)果判定9.1成立標(biāo)準(zhǔn)按式（1）和式（2）計(jì)算陰性對(duì)照OD450nm值平均值和陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值平均值：NC=(NC1+NC2)/2（1）NC——陰性對(duì)照OD450nm值平均值；NC1、NC2——陰性對(duì)照孔1、孔2的OD4PC=(PC1+PC2)/2（2）PC1、PC2——陽(yáng)性對(duì)照孔1、孔2的OD450nm值。9.2判定標(biāo)準(zhǔn)9.2.1臨界值的計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照平均值+0.05（若陰性對(duì)照的OD450nm值小于0.05，按0.05計(jì)5ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTCCGAAAACGGGAAGCCCGAGACCGAAGCGGCTTCCCCGGCTCCAATCAAGCGCGCCAAACGCATGGTGAGAGCATCCCAGCTTGACCTGGTTTATCCTTTCGATTACGTGGCCGACCCCGTCGGAGGGCTCAACCCGCCTTTTTTGGGAGGCTCAGGACCCCTAGTGGACCAGGGCGGACAGCTTACGCTCAACGTCACCGATCCCATCATCATCAAGAACAGATCGGTGGACTTGGCCCACGACCCCAGTCTCGATGTCAACGCCCAAGGTCAACTGGCGGTGGCCGTTGACCCCGAAGGGGCCCTGGACATCACCCCCGATGGACTGGACGTCAAGGTCGACGGAGTGACCGTAATGGTCAACGATGACTGGGAACTGGCCGTAAAAGTCGACCCGTCCGGCGGATTGGATTCCACCGCGGGTGGACTGGGGGTCAGCGTGGACGACACCTTGCTCGTGGATCAGGGAGAACTGGGCGTACACCTCAACCAACAAGGACCCATCACTGCCGATAGCAGTGGTATCGACCTCGAGATCAATCCTAACATGTTCACGGTCAACACCTCGACCGGAAGCGGAGTGCTGGAACTCAACCTAAAAGCGCAGGGAGGCATCCAAGCCGACAGTTCGGGAGTGGGCGTTTCCGTGGATGAAAGCCTACAGATTGTCAACAACACTCTGGAAGTGAAACCGGATCCCAGCGGACCGCTTACGGTCTCCGCCAATGGCCTAGGGCTGAAGTACGACACTAATACCCTAGCGGTGACCGCGGGCGCTTTAACCGTGGTCGGAGGGGGGAGCGTCTCCACACCCATCGCTACTTTTGTCTCGGGAAGTCCCAGCCTCAACACCTACAATGCCACGACCGTCAATTCCAGCGCGAACGCCTTCTCTTGCGCCTACTACCTTCAACAGTGGAACATACAGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTCTACTTGAAATTGGACAGCGCCACCATGGGGAATCGCCCTGGGGACCTCAACTCCGCCAATGCCAAATGGTTCACCTTTTGGGTGTCCGCCTATCTCCAGCAATGCAACCCCCGGGATTCAAGCGGGAACGGTCAGCCCCTCCACCGCCACCCTCACGGACTTTGAACCCATATAGGAGCGTGACCAGCCCATGGACGTACTCGGCCAATGGATACTATGAACCATCCATCGGGGAATTCCAAGTGTTCAGCCCGGTGGTAACAGGTGCCTGGAACCCGGGAAACATAGGGATCCGCGTCCTCCCCGTGCCGGTTTCGGCCTCCGGAGAGCGATACACCCTTCTATGCTATAGTCTGCAGTGCACGAACGCGAGCATTTTTAATCCAAACAACAGCGGAACCATGATCGTGGGACCCGTGCTCTACGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGA.3.1重組載體的構(gòu)建提取禽腺病毒4型HB1501株的DNA，用A.2引物擴(kuò)增Fiber-2基因，瓊脂糖凝膠電泳并純化回收相應(yīng)的擴(kuò)增片段，片段大小為1440bp。純化后的基因片段和pET-32a原核表達(dá)載體分別用EcoRV和HindIII限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)連接酶連接并轉(zhuǎn)化于Trans109感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組陽(yáng)性質(zhì)粒株BL21（DE3）-Fiber-2。6將BL21（DE3）-Fiber2種子中，置于37℃搖床200r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.6mmol/mL后，置于30℃恒溫?fù)u床200r/min振蕩培養(yǎng)5h。收集菌液，8000r/min室溫離心5min，棄去管中液體，用PBS重懸菌體，離心洗滌2次，棄上清，加入原菌液體積10%的PBS上述在裂解物4℃下12000r/min離心20min，收集沉淀，用與上清液同等體積的PBS重懸，然后使用His-tag包涵體蛋白純化試劑盒純化目的蛋白。純化后的Fiber-2蛋白放入即用型透析袋中，浸于含有6mol/L尿素的PBS溶液中，4℃透析12h。更換溶液為含4mol/L尿素的PBS溶液，7將禽腺病毒4型陰性對(duì)照血清用樣品稀釋液按1:41進(jìn)行稀釋，即為陰性對(duì)佐劑乳化后作為免疫原經(jīng)頸部皮下免疫21日齡SPF雞20只，0.5mL/只。免疫免疫。二次免疫后21d，對(duì)免疫雞心臟采血，分離血清。取中和效價(jià)（1:3201:640）的血清均勻8mL，調(diào)pH值9.6～9.8，2℃~8℃保存。定容至1000mL，調(diào)pH值7.2～7.4，2℃~8℃保存。水定容至1