動(dòng)物疫病診斷技術(shù)α皰疹病毒范圍本文件規(guī)定了豬偽狂犬病，雞馬立克氏病，牛傳染性鼻氣管炎和馬鼻肺炎的流行特點(diǎn)和診斷方法。本文件適用于豬、雞、牛、馬、驢α皰疹病毒的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。流行特點(diǎn)豬偽狂犬病由豬偽狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，PRV）感染豬引起的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，患病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類(lèi)為主要傳染源。本病主要通過(guò)空氣傳播，同時(shí)，在豬群中也存在鼻分泌物傳播的現(xiàn)象。該病呈季節(jié)性流行，常發(fā)生在寒冷的季節(jié)。雞馬立克氏病由雞皰疹病毒2型（GallidAlphaherpesvirus2，GaHV-2），即馬立克氏病病毒（Marek’sdiseasevirus，MDV）感染雞引起的一種淋巴細(xì)胞增生性疾病。病雞和帶毒雞是主要傳染源。本病主要通過(guò)空氣傳播，另外，污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動(dòng)也可傳播該病。2月齡～5月齡的雞常發(fā)。牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，BoHV-1）感染牛引起的一種接觸性傳染病。病牛和帶毒牛是主要傳染源，該病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，另外，也可通過(guò)生殖道黏膜、眼結(jié)膜傳播。常發(fā)生于秋、冬寒冷季節(jié)。馬鼻肺炎由馬皰疹病毒1型、4型或8型（Equineherpesvirustype，EHV-1/4/8）感染馬屬動(dòng)物引起的一種急性、熱性傳染病。病馬或驢和恢復(fù)后帶毒的馬或驢是主要傳染源。該病主要通過(guò)呼吸道傳播，另外，部分帶毒的公馬或驢可通過(guò)交配傳播。該病多發(fā)生于秋冬和早春。診斷臨床診斷豬偽狂犬病潛伏期一般為2?天～6?天，剛配種的母豬發(fā)病時(shí)易出現(xiàn)隱形流產(chǎn)；母豬發(fā)病早期無(wú)顯著癥狀，妊娠母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕，且出現(xiàn)早產(chǎn)，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或弱胎；公豬出現(xiàn)睪丸萎縮，陰囊腫大，精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱，抽搐，震顫和共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。雞馬立克氏病潛伏期一般3周～4周，根據(jù)皰疹病毒侵害部位不同，分為四種類(lèi)型。神經(jīng)型：患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn)，呈“劈叉”姿勢(shì)，翅膀下垂，低頭或斜頸等為典型癥狀。內(nèi)臟型：常見(jiàn)于50日齡～70日齡的雞，病雞精神萎頓，食欲減退，消瘦，羽毛松亂，雞冠蒼白或黑紫色、皺縮，伴有黃白色或黃綠色下痢，常因脫水導(dǎo)致死亡。眼型：病雞出現(xiàn)瞳孔縮小，虹膜邊緣不整齊，顏色常為灰白色。輕者對(duì)光線(xiàn)強(qiáng)度的反應(yīng)遲鈍，重者失明。皮膚型：病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結(jié)節(jié)。牛傳染性鼻氣管炎潛伏期7?天左右，根據(jù)皰疹病毒侵害部位不同，分為四種類(lèi)型。呼吸道型：病牛體溫升至40?℃以上，鼻黏膜充血，出現(xiàn)散發(fā)性小膿皰，伴隨咳嗽、呼吸困難、咽下障礙。結(jié)膜角膜炎型：病牛出現(xiàn)結(jié)膜和角膜充血，眼瞼腫大，流淚，角膜渾濁，有壞死性斑點(diǎn)。生殖器型：病母牛體溫升高，精神沉郁，食欲廢絕，外陰腫脹有小膿皰；出現(xiàn)子宮炎導(dǎo)致流產(chǎn)，產(chǎn)死胎。公牛感染出現(xiàn)傳染性膿皰型包皮龜頭炎，喪失配種能力。腦膜炎型：以6月齡以?xún)?nèi)的犢牛易發(fā)，體溫升高，出現(xiàn)驚厥，共濟(jì)失調(diào)，角弓反張等現(xiàn)象。馬鼻肺炎潛伏期2?天～10?天，馬屬動(dòng)物出現(xiàn)鼻肺炎，孕畜流產(chǎn)，以及神經(jīng)癥狀等?；疾〕跗隗w溫升高，流鼻液，鼻黏膜，眼結(jié)膜充血，下頜淋巴結(jié)腫大，同時(shí)血液中白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，感染嚴(yán)重者因呼吸困難而死亡。孕馬或孕驢出現(xiàn)流產(chǎn)，或驢駒死亡。以1歲～2歲馬或驢多發(fā)，3歲后呈隱性感染。實(shí)驗(yàn)室診斷豬偽狂犬病樣品采集按照NY/T541規(guī)定，采集患病豬的鼻拭子、血液、肺臟、淋巴結(jié)、腦和扁桃體等組織。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)與電泳分析鑒于PRV的檢測(cè)需要鑒別是野毒感染還是疫苗毒，取200?μL鼻拭子或病料組織的上清液借助商品化試劑盒制備DNA，以DNA為模板，借助特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見(jiàn)表1，其中g(shù)E引物用于野毒鑒別，gB引物用于常規(guī)檢測(cè)），具體操作步驟按照附錄A規(guī)定執(zhí)行。目的片段大小為368bp或480bp。普通PCR引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小PRV-gE-FTTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG368?bpPRV-gE-RTTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCAPRV-gB-FAGGTGTCGTTGGTGGTGT480?bpPRV-gB-RACGGCGACCTGGACG實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)鑒于PRV的檢測(cè)需要區(qū)分野毒感染還是由疫苗免疫造成，以5.2.1.2純化的DNA為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行PCR檢測(cè)（引物序列見(jiàn)表2，gE引物用于鑒別野毒，gB引物用于常規(guī)檢測(cè)），qRT-PCR具體操作步驟按照附錄B規(guī)定執(zhí)行。熒光定量PCR引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小qPRV-gE-FCTGTACGTGCTCGTGATGAC96?bpqPRV-gE-RCTCCTTGRTGACCGTGACGqPRV-gB-FGTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT95?bpqPRV-gB-RACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC野毒分離與檢測(cè)分析核酸電泳結(jié)果，或qRT-PCR結(jié)果，選取判定為豬偽狂犬病毒陽(yáng)性的腦，肺臟或淋巴結(jié)等病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5?000?rpm離心10?min。收集上清借助0.22?μm濾膜除菌后，接種至豬腎細(xì)胞（PK-15）中，同時(shí)添加1?000?IU/mL青霉素和1?000?μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37?℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM，放置培養(yǎng)箱3?天～5?天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析將PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小分別為368bp或480bp符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可確診為豬偽狂犬病毒感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為陽(yáng)性。若PK-15細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。雞馬立克氏病采集病料樣品采集患病雞的血液、淋巴組織、脾臟組織或腫瘤細(xì)胞或羽髓勻漿等，參考NY/T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)與電泳分析將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA，作為模板，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表3）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%的核酸膠進(jìn)行電泳分析，目的片段大小為360?bp。qRT-PCR檢測(cè)以5.2.2.2純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進(jìn)qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表3），qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTCT360?bpMDV073-RGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCqMDV073-FGTTTCTCCAGATTCCACCTC213?bpqMDV073-RTGCAACAATGCGTTCTTAT野毒分離與檢測(cè)分析核酸電泳結(jié)果，或qRT-PCR結(jié)果，選取判定為雞皰疹病毒2型陽(yáng)性的病料組織借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5?000?rpm離心10?min。收集上清借助0.22?μm濾膜除菌后，接種至鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）中，同時(shí)添加1?000?IU/mL青霉素和1?000?μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37?℃吸附后1?h，換成3%FBSDMEM，放置培養(yǎng)箱3?天～5?天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%核酸膠電泳分析后，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段為360?bp，大小符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可確診為雞皰疹病毒2型感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35，且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為陰性，Ct值小于35，且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為雞皰疹病毒2型感染陽(yáng)性。若DEF細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。牛傳染性鼻氣管炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，流產(chǎn)胎兒肺臟，生殖道分泌物等病料，按NY/T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA，作為模板，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表4）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析，目的片段大小為479?bp。qRT-PCR檢測(cè)以5.2.3.2純化的DNA為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表4），qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小BoHV-1gB-FTACGACTCGTTCGCGCTCTC479bpBoHV-1gB-RGGTACGTCTCCAAGCTGCCCqBoHV-1gB-FCTGGCACACGACGGACGATG97bpqBoHV-1gB-FCGCCTCCACTTCTTCCACGATG野毒分離與檢測(cè)分析核酸電泳結(jié)果，或qRT-PCR結(jié)果，選取判定為牛皰疹病毒1型陽(yáng)性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5?000?rpm離心10?min。取上清用0.22?μm濾膜除菌后，接種至牛腎細(xì)胞（MDBK）中，同時(shí)加入1?000?IU/mL青霉素和1?000?μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37?℃吸附后1?h，換成3%FBSDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3?天～5?天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小為479?bp，符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可確診為牛皰疹病毒1型感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35，且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為陰性，Ct值小于35，且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為牛皰疹病毒1型感染陽(yáng)性。若MDBK細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，作為模板，借助上述特異性引物進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。馬鼻肺炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，馬或驢的流產(chǎn)胎盤(pán)，肺臟和腦等病料組織，按NY/T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模板，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表5）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析，目的片段大小為792bp，482bp或316

bp。PCR引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小EHV-1gB-FGAACCTCAGCCAACCCA792?bpEHV-1gB-RGCACTTTGCGGACGAACEHV-4gB-FTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAG482?bpEHV-4gB-FCTTAATCGCATTTAGACCGAEHV-8gG-FTCAGACTGTCACTCGTGGGA316?bpEHV-8gG-RCCTGAAGGCCGTTTAACACAqRT-PCR檢測(cè)以5.2.4.2純化的DNA為模板，利用特異性引物分別進(jìn)qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表6），qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。qRT-PCR引物信息名稱(chēng)序列（5’→3’）片段大小qEHV-1gB-FGCCATACGTCCCTGTCCGACAA302?bpqEHV-1gB-RCCTCCACCTCCTCGACGATGCqEHV-4gB-FCGCAGAGGATGGAGACTTTTACA78?bpqEHV-4gB-FCATGACCGTGGGGGTTCAAqEHV-8gG-FGACGCGTAACGTTGGATGTG178?bpqEHV-8gG-RAATGTAACGTTTGCCCACGC野毒分離與檢測(cè)分析核酸電泳結(jié)果，或qRT-PCR結(jié)果，選取判定為馬皰疹病毒（EHV-1/4/8）陽(yáng)性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5?000?rpm離心10?min。取上清用0.22μm濾膜除菌后，接種至兔腎細(xì)胞（RK-13）中，同時(shí)加入1?000?IU/mL青霉素和1?000?μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37?℃吸附后1?h，換成3%FBSMEM，放置培養(yǎng)箱3?天～5?天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小為792?bp，482?bp或316?bp，符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可確診為馬皰疹病毒1型，馬皰疹病毒4型或馬皰疹病毒8型感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35，且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為陰性，Ct值小于35，且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)判定為馬皰疹病毒1型，馬皰疹病毒4型或馬皰疹病毒8型感染陽(yáng)性。若RK-13細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，作為模板，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。綜合判定若患病動(dòng)物（豬，雞，牛，馬或驢）出現(xiàn)呼吸困難，流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等，則可判定為疑似α皰疹病毒感染，需借助PCR，熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，最后結(jié)合病原分離和測(cè)序等方法進(jìn)行確診。

（規(guī)范性）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)與分析方法命名聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR），又稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR。原理體外聚合酶促合成特異DNA片段的一種分子生物方法，主要由高溫變性（95?℃）、低溫退火（55?℃）和適溫延伸（72?℃）等3個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。體系包含DNA聚合酶，引物，模板等，常設(shè)定為30個(gè)循環(huán)。試劑或材料商品化Taqpremix酶。對(duì)應(yīng)靶基因的特異性引物。實(shí)驗(yàn)室用水參考GB/T6682。不同病原DNA模板。0.2?mL透明PCR管。AgaroseX脂糖。標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量maker。儀器設(shè)備普通PCR儀器。核酸電泳儀。試驗(yàn)步驟配制PCR體系參照表A.1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（以水為模板，參照GB/T6682執(zhí)行）。反應(yīng)條件：95?℃預(yù)變性3?min；95?℃60?s，55?℃30?s，72?℃60?s，30個(gè)循環(huán)。72?℃延伸10?min，4?℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%核酸膠進(jìn)行分析，待電泳結(jié)束，借助凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。PCR體系配制反應(yīng)體系組分體積μL2×PCRMix10上游引物（10?μM）1下游引物（10?μM）1模板2去離子水6總體積20

（規(guī)范性）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)命名實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitativerealtimepolymerasechainreaction，qRT-PCR）稱(chēng)定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理qRT-PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)驗(yàn)試劑與耗材該實(shí)驗(yàn)所需耗材：商品化SYBRGreenqPCRMix酶，對(duì)應(yīng)靶基因的特異性引物，實(shí)驗(yàn)室用水參考GB/T6682，不同病原DNA模板，透明八聯(lián)管。該實(shí)驗(yàn)所需要的儀器：熒光定量PCR儀。實(shí)驗(yàn)步驟配制PCR體系參照表B.1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（以水為模板，參照GB/T6682執(zhí)行）。反應(yīng)條件：95?℃預(yù)變性30?s；95?℃10?s，60?℃30?s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)：95?℃15?s，60?℃60?s，95?℃15?s，借助定量PCR儀分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。qRT-PCR體系配制反應(yīng)體系組分體積μLSYBRGreenqPCRMix10上游引物（10?μM）1下游引物（10?μM）1DNA模板1去離子水7總體積20

（資料性）

PCR和qRT-PCR目的基因序列豬偽狂犬病毒gE基因PCR參考序列（大小為368bp）TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCG豬偽狂犬病毒gE基因qRT-PCR參考序列（大小為96bp）（用于鑒別野毒）CTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCAYCAAGGAG豬偽狂犬病毒gB基因參考序列（大小為480bp）（用于常規(guī)檢測(cè)）AGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGATCTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGCGAGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCGGTCGCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGCCGT豬偽狂犬病毒gB基因qRT-PCR引物參考序列（大小為95bp）（用于常規(guī)檢測(cè)）GTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGT禽皰疹病毒2型MDV073基因PCR參考序列（大小為360bp）ATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGGTCGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAATGTACAACAGC禽皰疹病毒2型MDV073基因qRT-PCR參考序列（大小為213bp）GTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCA牛皰疹病毒1型gB基因PCR參考序列（大小為479bp）TACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGAGCACACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGTCTCGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGCGCGAGGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCACACCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTACAACGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGTACC牛皰疹病毒1型gB基因qRT-PCR參考序列（大小為97bp）CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGTGGAAGAAGTGGAGGCG馬皰疹病毒1型gB基因PCR參考序列（大小為792bp）GAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCAGGTACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATACGATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAACGAAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCCCGTAACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCAAAGTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGAGGTGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGTTTT馬皰疹病毒1型gB基因qRT-PCR參考序列（大小為302bp）GCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGGAAAATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACTACACGTCAACGTCTGTC