酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）1 實(shí)驗(yàn)原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材

2.1實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配制2.1.1包被緩沖液（PH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液）：

Na2CO3（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1.59g

NaHCO3（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）2.93g

加蒸餾水至 1000ml2.1.2洗滌緩沖液(PH7.4PBS)：0.15M

KH2PO4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 0.2g

Na2HPO4·12H2O（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 2.9g

NaCl（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 8.0g

KCl（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 0.2gTween-20（上海生工生物工程有限公司）0.05％ 0.5ml加蒸餾水至 1000ml

2.1.3稀釋液/封閉液：Tween-20（上海生工生物工程有限公司）0.3% 0.3ml1XPBS 100ml

2.1.4終止液(2MH2SO4)：

蒸餾水178.3ml，逐滴加入98％濃硫酸(無錫龍吉化工有限公司) 2.1.5底物緩沖液(PH5.0磷酸檸檬酸)：

0.2MNa2HPO4(28.4g／L)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 51.5ml 0.1M檸檬酸(19.2g／L)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 48.5ml

混合置于4°℃。

2.1.6TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液：

TMB(5mg／5ml無水乙醇)（上海生工生物工程有限公司） 1ml

底物緩沖液(PH5.0) 9ml

30％H2O2 10μl

2.1.7抗原、抗體、酶標(biāo)記抗體（中杉金橋羊抗兔二抗）和陰性對照血清。2.2實(shí)驗(yàn)器材：

2.2.196孔聚苯乙烯塑料板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，ELISA檢測儀（ThermoscientificFC），10μl單道移液器（eppendorf），30-300ul多道移液器（eppendorf），100μl、1000μl單道移液器（Gilson），塑料滴頭、小毛巾、卷紙、保鮮膜、燒杯、試管（0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、50ml）、吸管、量筒、玻璃棒（國產(chǎn)）。

2.1.24℃冰箱（青島海爾股份有限公司），37℃孵育箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9070A3 實(shí)驗(yàn)操作步驟

3.1用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml(初次測定可分別用1ug/ml，10ug/ml以確定抗原最佳濃度，一般濃度為5ug/ml)，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日PBS洗滌1次,0.22ml3.2加入0.35ml封閉液，室溫孵育1小時(shí)或4℃3.3加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml（稀釋倍數(shù)1:1000以上，可以2倍或10倍的形式做梯度）于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),PBS洗滌4次,每次0.22ml，最后一遍停留1min。(同時(shí)做空白、陰性孔對照3.4于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體0.1ml（初次使用二抗也需先做稀釋濃度比例的測試），37℃孵育60分鐘，PBS洗滌5次,每次0.22ml。第4次和第5次停留1min3.5加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨用前配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃15～303.6終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。3.7置于酶標(biāo)儀中檢測OD值。4 結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。5 注意事項(xiàng)

5.1正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

5.2在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括：

5.2.1固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

5.2.2包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。

5.2.3酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

5.2.4酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些