ICS11.220CCSB4121IDB21/T3787—2023前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 5生物安全基本要求 6方法原理 7設(shè)備、試劑和材料 28檢測(cè)步驟 2附錄A（規(guī)范性）溶液制備 4DB21/T3787—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心、中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責(zé)任公司。本文件主要起草人：蘭德松、于本良、顧貴波、曹際娟、周維、趙培、葛忠源、張雅為、孫世宇、楊作豐、劉賀、楊國(guó)麗、張春姝。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門(mén)通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話(huà)文件起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽(yáng)市沈北新區(qū)人和街95號(hào)），聯(lián)系電話(huà)1DB21/T3787—2023非洲豬瘟病毒LAMP目視檢測(cè)方法本文件規(guī)定了非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）LAMP目視檢測(cè)方法的生物安全基本要求，方法原理，設(shè)備、試劑和材料，檢測(cè)步驟等技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于非洲豬瘟的診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬全血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓、拭子等樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。ASFV：非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）Bst：嗜熱硬脂芽孢桿菌（BacillusStearothermophilus)DEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二鈉（EthyleneDiaminetetraaceticAcidDisodium）LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermalAmplification）RM：反應(yīng)液（ReactionMaterial）5生物安全基本要求進(jìn)行ASFV檢測(cè)活動(dòng)時(shí)，應(yīng)按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。6方法原理針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，并引入環(huán)引物加快反應(yīng)，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶等在60℃~65℃進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，15min～60min左右即可實(shí)現(xiàn)109倍～1010倍的核酸擴(kuò)增。在DNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，經(jīng)鈣黃綠素染色，呈現(xiàn)綠色肉眼可見(jiàn)的沉淀物。2DB21/T3787—20237設(shè)備、試劑和材料7.1設(shè)備二級(jí)生物安全柜、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、組織研磨儀、冰箱（2℃~8℃和-20℃以下）、金屬浴或恒溫水浴鍋（25℃~100℃)、微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μ7.2試劑ASFVLAMP擴(kuò)增用引物、2×反應(yīng)液（RM）、Bst2.0DNA聚合酶、熒光染料、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、DEPC處理水。試劑的溶液制備見(jiàn)附錄A。7.3材料核酸提取試劑盒、離心管（15mL、1.5mL）、0.2mLPCR反應(yīng)管、移液器吸頭（10μL、200μ8檢測(cè)步驟8.1樣品采集準(zhǔn)備8.1.1采樣人員符合NY/T541-2016中的規(guī)定。8.1.2采樣工具和器材符合NY/T541-2016中的規(guī)定。8.2樣品采集8.2.1血液樣品：按照NY/T541-2016中第6.1條中豬血液樣品采集的要求進(jìn)行，將采集的血液注入含1/10體積4%EDTA-2Na溶液的無(wú)菌容器中，充分混勻，編號(hào)備檢。8.2.2臟器、組織樣品：按照NY/T541-2016中第6.2條和6.3條中的要求進(jìn)行，將采集的病死豬或剖殺豬主要臟器（脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟等）、骨髓等樣品使用組織研磨儀或研缽在二級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行研磨處理后用于核酸提取。8.2.3拭子樣品：按照NY/T541-2016中相關(guān)要求進(jìn)行。8.3樣品保存、包裝和廢棄物處理按照NY/T541-2016執(zhí)行。8.4樣品運(yùn)輸按照NY/T541-2016執(zhí)行。8.5DNA提取DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)進(jìn)行，采用商品化核酸提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取樣本核酸，樣本核酸在-20℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?DB21/T3787—20238.6LAMP擴(kuò)增反應(yīng)8.6.1體系的配制和分裝在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=待測(cè)樣品數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照）。按n+1計(jì)算好各試劑的使用量，按表1配制，加入1.5mL離心管中，充分混勻后，按23μL/管分裝至PCR管并編號(hào)。表1每個(gè)反應(yīng)體系配制表8.6.2加樣向上述編號(hào)的PCR管中分別加入制備的陰性對(duì)照核酸、陽(yáng)性對(duì)照核酸和樣本核酸各2μL，扣緊混勻后，采用1s×3次的方式瞬時(shí)離心，之后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。8.6.3PCR擴(kuò)增檢測(cè)在PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。將PCR反應(yīng)管放入金屬浴或恒溫水浴鍋等設(shè)備中，設(shè)置溫度63℃,時(shí)間55min。8.7結(jié)果判定8.7.1質(zhì)量控制自然光下，陽(yáng)性對(duì)照為綠色熒光，陰性對(duì)照為橘黃色無(wú)熒光，則試驗(yàn)成立。8.7.2結(jié)果判定自然光下，看到綠色熒光、淡綠色熒光、淺綠色熒光，判為陽(yáng)性；看到橘黃色無(wú)熒光，判為陰性。4DB21/T3787—2023（規(guī)范性）溶液制備A.1引物的名稱(chēng)和序列引物的名稱(chēng)和序列見(jiàn)表A.1。表A.1引物名稱(chēng)和序列AGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGGGAGTCATTAATGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTATTGTTGGTGA.2引物混合物的制備取引物對(duì)（內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3、外引物B3、環(huán)引物L(fēng)B）干粉，按引物說(shuō)明書(shū)分別加入適量無(wú)菌純化水，溶解混勻，得到各引物溶液，置-20℃保存。A.32×反應(yīng)液（RM）的制備本方法采用的2×反應(yīng)液（RM）為商品化的2×反應(yīng)液（RM）。A.4Bst2.0DNA聚合酶的制備本方法采用的Bst2.0DNA聚合酶為商品化的Bst2.0DNA聚合酶。A.5熒光染料的制備本方法采用的熒光染料為商品化的熒光目視檢測(cè)試劑。A.6陽(yáng)性對(duì)照采用核酸蛋白