高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI）是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的以禽類為主的烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。為預(yù)防、控制和撲滅高致病性禽流感，依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》、《重大動物疫情應(yīng)急條例》、《國家突發(fā)重大動物疫情應(yīng)急預(yù)案》及有關(guān)的法律法規(guī)制定本規(guī)范。1適用范圍本規(guī)范規(guī)定了高致病性禽流感的疫情確認、疫情處置、疫情監(jiān)測、免疫、檢疫監(jiān)督的操作程序、技術(shù)標(biāo)準及保障措施。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切與高致病性禽流感防治活動有關(guān)的單位和個人。2診斷2.1流行病學(xué)特點2.1.1

雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉雞、鷓鴣、鴕鳥、孔雀等多種禽類易感，多種野鳥也可感染發(fā)病。2.1.2

傳染源主要為病禽（野鳥）和帶毒禽（野鳥）。病毒可長期在污染的糞便、水等環(huán)境中存活。2.1.3

病毒傳播主要通過接觸感染禽（野鳥）及其分泌物和排泄物、污染的飼料、水、蛋托（箱）、墊草、種蛋、雞胚和精液等媒介，經(jīng)呼吸道、消化道感染，也可通過氣源性媒介傳播。2.2

臨床癥狀2.2.1

急性發(fā)病死亡或不明原因死亡，潛伏期從幾小時到數(shù)天，最長可達21天；2.2.2

腳鱗出血；2.2.3

雞冠出血或發(fā)紺、頭部和面部水腫；2.2.4

鴨、鵝等水禽可見神經(jīng)和腹瀉癥狀，有時可見角膜炎癥，甚至失明；2.2.5

產(chǎn)蛋突然下降。2.3

病理變化2.3.1

消化道、呼吸道粘膜廣泛充血、出血；腺胃粘液增多，可見腺胃乳頭出血，腺胃和肌胃之間交界處粘膜可見帶狀出血；2.3.2

心冠及腹部脂肪出血；2.3.3

輸卵管的中部可見乳白色分泌物或凝塊；卵泡充血、出血、萎縮、破裂,有的可見“卵黃性腹膜炎”；2.3.4腦部出現(xiàn)壞死灶、血管周圍淋巴細胞管套、神經(jīng)膠質(zhì)灶、血管增生等病變；胰腺和心肌組織局灶性壞死。2.4

血清學(xué)指標(biāo)2.4.1

未免疫禽H5或H7的血凝抑制(HI)效價達到24及以上（附件1）；2.4.2

禽流感瓊脂免疫擴散試驗（AGID）陽性(附件2)。2.5

病原學(xué)指標(biāo)2.5.1

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測，結(jié)果H5或H7亞型禽流感陽性（附件4）；2.5.2

通用熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（熒光RT-PCR）檢測陽性（附件6）；2.5.3

神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗陽性（附件3）；2.5.4

靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)（IVPI）大于1.2或用0.2ml1:10稀釋的無菌感染流感病毒的雞胚尿囊液，經(jīng)靜脈注射接種8只4-8周齡的易感雞，在接種后10天內(nèi)，能致6-7只或8只雞死亡，即死亡率≥75%；2.5.5

對血凝素基因裂解位點的氨基酸序列測定結(jié)果與高致病性禽流感分離株基因序列相符（由國家參考實驗室提供方法）。2.6

結(jié)果判定2.6.1臨床懷疑病例符合流行病學(xué)特點和臨床指標(biāo)2.2.1，且至少符合其他臨床指標(biāo)或病理指標(biāo)之一的;非免疫禽符合流行病學(xué)特點和臨床指標(biāo)2.2.1且符合血清學(xué)指標(biāo)之一的。2.6.2疑似病例臨床懷疑病例且符合病原學(xué)指標(biāo)2.5.1、2.5.2、2.5.3之一。2.6.3確診病例疑似病例且符合病原學(xué)指標(biāo)2.5.4或2.5.5。3

疫情報告3.1

任何單位和個人發(fā)現(xiàn)禽類發(fā)病急、傳播迅速、死亡率高等異常情況，應(yīng)及時向當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)報告。3.2

當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)在接到疫情報告或了解可疑疫情情況后，應(yīng)立即派員到現(xiàn)場進行初步調(diào)查核實并采集樣品，符合2.6.1規(guī)定的，確認為臨床懷疑疫情；3.3

確認為臨床懷疑疫情的，應(yīng)在2個小時內(nèi)將情況逐級報到省級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)和同級獸醫(yī)行政管理部門，并立即將樣品送省級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)進行疑似診斷；3.4

省級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)確認為疑似疫情的，必須派專人將病料送國家禽流感參考實驗室做病毒分離與鑒定，進行最終確診；經(jīng)確認后，應(yīng)立即上報同級人民政府和國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門，國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門應(yīng)當(dāng)在4個小時內(nèi)向國務(wù)院報告；3.5

國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門根據(jù)最終確診結(jié)果，確認高致病性禽流感疫情。4疫情處置4.1臨床懷疑疫情的處置對發(fā)病場（戶）實施隔離、監(jiān)控，禁止禽類、禽類產(chǎn)品及有關(guān)物品移動，并對其內(nèi)、外環(huán)境實施嚴格的消毒措施（附件8）。4.2疑似疫情的處置當(dāng)確認為疑似疫情時，撲殺疑似禽群，對撲殺禽、病死禽及其產(chǎn)品進行無害化處理，對其內(nèi)、外環(huán)境實施嚴格的消毒措施，對污染物或可疑污染物進行無害化處理，對污染的場所和設(shè)施進行徹底消毒，限制發(fā)病場（戶）周邊3公里的家禽及其產(chǎn)品移動（見附件9、10）。4.3確診疫情的處置疫情確診后立即啟動相應(yīng)級別的應(yīng)急預(yù)案。4.3.1

劃定疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)由所在地縣級以上獸醫(yī)行政管理部門劃定疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)。疫點：指患病動物所在的地點。一般是指患病禽類所在的禽場（戶）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位；如為農(nóng)村散養(yǎng)，應(yīng)將自然村劃為疫點。疫區(qū)：由疫點邊緣向外延伸3公里的區(qū)域劃為疫區(qū)。疫區(qū)劃分時，應(yīng)注意考慮當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)環(huán)境和天然屏障（如河流、山脈等）。受威脅區(qū)：由疫區(qū)邊緣向外延伸5公里的區(qū)域劃為受威脅區(qū)。4.3.2

封鎖由縣級以上獸醫(yī)主管部門報請同級人民政府決定對疫區(qū)實行封鎖；人民政府在接到封鎖報告后，應(yīng)在24小時內(nèi)發(fā)布封鎖令，對疫區(qū)進行封鎖：在疫區(qū)周圍設(shè)置警示標(biāo)志，在出入疫區(qū)的交通路口設(shè)置動物檢疫消毒站，對出入的車輛和有關(guān)物品進行消毒。必要時，經(jīng)省級人民政府批準，可設(shè)立臨時監(jiān)督檢查站，執(zhí)行對禽類的監(jiān)督檢查任務(wù)?？缧姓^(qū)域發(fā)生疫情的，由共同上一級獸醫(yī)主管部門報請同級人民政府對疫區(qū)發(fā)布封鎖令，對疫區(qū)進行封鎖。4.3.3疫點內(nèi)應(yīng)采取的措施4.3.3.1撲殺所有的禽只，銷毀所有病死禽、被撲殺禽及其禽類產(chǎn)品；4.3.3.2對禽類排泄物、被污染飼料、墊料、污水等進行無害化處理；4.3.3.3對被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行徹底消毒。4.3.4疫區(qū)內(nèi)應(yīng)采取的措施4.3.4.1撲殺疫區(qū)內(nèi)所有家禽，并進行無害化處理，同時銷毀相應(yīng)的禽類產(chǎn)品；4.3.4.2禁止禽類進出疫區(qū)及禽類產(chǎn)品運出疫區(qū)；4.3.4.3對禽類排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規(guī)定標(biāo)準進行無害化處理；4.3.4.4對所有與禽類接觸過的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行徹底消毒。4.3.5受威脅區(qū)內(nèi)應(yīng)采取的措施4.3.5.1對所有易感禽類進行緊急強制免疫，建立完整的免疫檔案；4.3.5.2

對所有禽類實行疫情監(jiān)測，掌握疫情動態(tài)。4.3.6

關(guān)閉疫點及周邊13公里內(nèi)所有家禽及其產(chǎn)品交易市場。4.3.7

流行病學(xué)調(diào)查、疫源分析與追蹤調(diào)查追蹤疫點內(nèi)在發(fā)病期間及發(fā)病前21天內(nèi)售出的所有家禽及其產(chǎn)品，并銷毀處理。按照高致病性禽流感流行病學(xué)調(diào)查規(guī)范，對疫情進行溯源和擴散風(fēng)險分析（附件11）。4.3.8

解除封鎖4.3.8.1解除封鎖的條件疫點、疫區(qū)內(nèi)所有禽類及其產(chǎn)品按規(guī)定處理完畢21天以上，監(jiān)測未出現(xiàn)新的傳染源；在當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下，完成相關(guān)場所和物品終末消毒；受威脅區(qū)按規(guī)定完成免疫。4.3.8.2解除封鎖的程序經(jīng)上一級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)審驗合格，由當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門向原發(fā)布封鎖令的人民政府申請發(fā)布解除封鎖令，取消所采取的疫情處置措施。4.3.8.3疫區(qū)解除封鎖后，要繼續(xù)對該區(qū)域進行疫情監(jiān)測，6個月后如未發(fā)現(xiàn)新病例，即可宣布該次疫情被撲滅。疫情宣布撲滅后方可重新養(yǎng)禽。4.3.9對處理疫情的全過程必須做好完整詳實的記錄，并歸檔。5疫情監(jiān)測5.1監(jiān)測方法包括臨床觀察、實驗室檢測及流行病學(xué)調(diào)查。5.2監(jiān)測對象以易感禽類為主，必要時監(jiān)測其他動物。5.3監(jiān)測的范圍5.3.1

對養(yǎng)禽場戶每年要進行兩次病原學(xué)抽樣檢測，散養(yǎng)禽不定期抽檢，對于未經(jīng)免疫的禽類以血清學(xué)檢測為主；5.3.2對交易市場、禽類屠宰廠（場）、異地調(diào)入的活禽和禽產(chǎn)品進行不定期的病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測。5.3.3對疫區(qū)和受威脅區(qū)的監(jiān)測5.3.3.1對疫區(qū)、受威脅區(qū)的易感動物每天進行臨床觀察，連續(xù)1個月，病死禽送省級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)實驗室進行診斷，疑似樣品送國家禽流感參考實驗室進行病毒分離和鑒定。解除封鎖前采樣檢測1次，解除封鎖后納入正常監(jiān)測范圍；5.3.3.2對疫區(qū)養(yǎng)豬場采集鼻腔拭子，疫區(qū)和受威脅區(qū)所有禽群采集氣管拭子和泄殖腔拭子，在野生禽類活動或棲息地采集新鮮糞便或水樣，每個采樣點采集20份樣品，用RT-PCR方法進行病原檢測，發(fā)現(xiàn)疑似感染樣品，送國家禽流感參考實驗室確診。5.5在監(jiān)測過程中，國家規(guī)定的實驗室要對分離到的毒株進行生物學(xué)和分子生物學(xué)特性分析與評價，密切注意病毒的變異動態(tài)，及時向國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門報告。5.6各級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)對監(jiān)測結(jié)果及相關(guān)信息進行風(fēng)險分析，做好預(yù)警預(yù)報。5.7監(jiān)測結(jié)果處理監(jiān)測結(jié)果逐級匯總上報至中國動物疫病預(yù)防控制中心。發(fā)現(xiàn)病原學(xué)和非免疫血清學(xué)陽性禽，要按照《國家動物疫情報告管理辦法》的有關(guān)規(guī)定立即報告，并將樣品送國家禽流感參考實驗室進行確診，確診陽性的，按有關(guān)規(guī)定處理。6免疫6.1國家對高致病性禽流感實行強制免疫制度，免疫密度必須達到100%，抗體合格率達到70%以上。6.2預(yù)防性免疫，按農(nóng)業(yè)部制定的免疫方案中規(guī)定的程序進行。6.3突發(fā)疫情時的緊急免疫，按本規(guī)范有關(guān)條款進行。6.4所用疫苗必須采用農(nóng)業(yè)部批準使用的產(chǎn)品，并由動物防疫監(jiān)督機構(gòu)統(tǒng)一組織、逐級供應(yīng)。6.5所有易感禽類飼養(yǎng)者必須按國家制定的免疫程序做好免疫接種，當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)負責(zé)監(jiān)督指導(dǎo)。6.6定期對免疫禽群進行免疫水平監(jiān)測，根據(jù)群體抗體水平及時加強免疫。7檢疫監(jiān)督7.1產(chǎn)地檢疫飼養(yǎng)者在禽群及禽類產(chǎn)品離開產(chǎn)地前，必須向當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)報檢，接到報檢后，必須及時到戶、到場實施檢疫。檢疫合格的，出具檢疫合格證明，并對運載工具進行消毒，出具消毒證明，對檢疫不合格的按有關(guān)規(guī)定處理。7.2屠宰檢疫動物防疫監(jiān)督機構(gòu)的檢疫人員對屠宰的禽只進行驗證查物，合格后方可入廠（場）屠宰。宰后檢疫合格的方可出廠，不合格的按有關(guān)規(guī)定處理。7.3引種檢疫國內(nèi)異地引入種禽、種蛋時，應(yīng)當(dāng)先到當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)辦理檢疫審批手續(xù)且檢疫合格。引入的種禽必須隔離飼養(yǎng)21天以上，并由動物防疫監(jiān)督機構(gòu)進行檢測，合格后方可混群飼養(yǎng)。7.4監(jiān)督管理7.4.1禽類和禽類產(chǎn)品憑檢疫合格證運輸、上市銷售。動物防疫監(jiān)督機構(gòu)應(yīng)加強流通環(huán)節(jié)的監(jiān)督檢查，嚴防疫情傳播擴散。7.4.2生產(chǎn)、經(jīng)營禽類及其產(chǎn)品的場所必須符合動物防疫條件，并取得動物防疫合格證。7.4.3各地根據(jù)防控高致病性禽流感的需要設(shè)立公路動物防疫監(jiān)督檢查站，對禽類及其產(chǎn)品進行監(jiān)督檢查，對運輸工具進行消毒。8保障措施8.1各級政府應(yīng)加強機構(gòu)隊伍建設(shè)，確保各項防治技術(shù)落實到位。8.2各級財政和發(fā)改部門應(yīng)加強基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，確保免疫、監(jiān)測、診斷、撲殺、無害化處理、消毒等防治工作經(jīng)費落實。8.3各級獸醫(yī)行政部門動物防疫監(jiān)督機構(gòu)應(yīng)按本技術(shù)規(guī)范，加強應(yīng)急物資儲備，及時演練和培訓(xùn)應(yīng)急隊伍。8.4在高致病禽流感防控中，人員的防護按《高致病性禽流感人員防護技術(shù)規(guī)范》執(zhí)行（附件12）。

附件1血凝抑制（HI）試驗

流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識別并吸附于紅細胞表面受體的結(jié)構(gòu)，HA試驗由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法?？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。HA-HI試驗的優(yōu)點是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法，可用來鑒定所有的流感病毒分離株，可用來檢測禽血清中的感染或免疫抗體。它的缺點是只有當(dāng)抗原和抗體HA亞型相一致時才能出現(xiàn)HI象，各亞型間無明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在于血清中的非特異凝集素，對于其它禽種，也可以考慮選用在調(diào)查研究中的禽種紅細胞；需要在每次試驗時進行抗原標(biāo)準化；需要正確判讀的技能。1

阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?

10%和1%雞紅細胞液的制備2.1采血

用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2洗滌雞紅細胞

將離心管中的血液經(jīng)1500～1800r/min離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)1500～1800r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20mL，輕輕混合成紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，不超過5天。2.3

10%雞紅細胞懸液

取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800r/min8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細胞混合均勻。2.4

1%雞紅細胞液

取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1mL，加入9mL生理鹽水，混合均勻即可。3抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）3.1在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入0.025mLPBS，換滴頭。3.2吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。3.3從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。3.4每孔再加入0.025mLPBS。3.5每孔均加入0.025mL體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）見附錄B。3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。3.7結(jié)果判定

將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見下表）。表1：血凝試驗結(jié)果判讀標(biāo)準類別孔

底

所

見結(jié)果12345紅細胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細胞凝集紅細胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊紅細胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細胞完全不凝集++++++++++-

能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。4血凝抑制（HI）試驗（微量法）4.1根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。4.2在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入0.025mLPBS，第12孔加入0.05mLPBS。4.3吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。4.41孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min。4.5每孔加入0.025mL體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.6結(jié)果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。

附件2瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗

A型流感病毒都有抗原性相似的核衣殼和基質(zhì)抗原。用已知禽流感AGID標(biāo)準血清可以檢測是否有A型流感病毒的存在，一般在鑒定所分禽的病毒是否是A型禽流感病毒時常用，此時的抗原需要試驗者自己用分離的病毒制備；利用AGID標(biāo)準抗原，可以檢測所有A型流感病毒產(chǎn)生的各個亞型的禽流感抗體，通常在禽流感監(jiān)測時使用(水禽不適用)，可作為非免疫雞和火雞感染的證據(jù)，其標(biāo)準抗原和陽性血清均可由國家指定單位提供。流感病毒感染后不是所有的禽種都能產(chǎn)生沉淀抗體。1抗原制備1.1用含豐富病毒核衣殼的尿囊膜制備。從尿囊液呈HA陽性的感染雞胚中提取絨毛尿囊膜，將其勻漿或研碎，然后反復(fù)凍融三次，經(jīng)1000r/m離心10分鐘，棄沉淀，取上清液用0.1%福爾馬林或1%β-丙內(nèi)酯滅活后可作為抗原。1.2用感染的尿囊液將病毒濃縮或者用已感染的絨毛尿囊膜的提取物，這些抗原用標(biāo)準血清進行標(biāo)定。將含毒尿囊液以超速離心或者在酸性條件下進行沉淀以濃縮病毒。酸性沉淀法是將1.0mol/LHCl加入到含毒尿囊液中，調(diào)pH值到4.0，將混合物置于冰浴中作用1小時，經(jīng)1000r/m，4℃離心10分鐘，棄去上清液。病毒沉淀物懸于甘氨-肌氨酸緩沖液中（含1%十二烷酰肌氨酸緩沖液，用0.5mol/L甘氨酸調(diào)pH值至9.0）。沉淀物中含有核衣殼和基質(zhì)多肽。2瓊脂板制備該試驗常用1g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或0.8～1g瓊脂糖加入100mL0.01mol/L、pH值7.2的8%氯化鈉-磷酸緩沖液中，水浴加熱融化，稍涼（60～65℃），倒入瓊脂板內(nèi)（厚度為3mm），待瓊脂凝固后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ么蚩灼髟诃傊迳习?孔梅花圖案打孔，孔徑約3mm～4mm，孔距為3mm。3加樣用移液器滴加抗原于中間孔，周圍1、4孔加陽性血清，其余孔加被檢血清，每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品應(yīng)換一個滴頭,并設(shè)陰性對照血清。4感作將瓊脂板加蓋保濕，置于37℃溫箱。24～48小時后，判定結(jié)果。5結(jié)果判定5.1陽性。陽性血清與抗原孔之間有明顯沉淀線時，被檢血清與抗原孔之間也形成沉淀線，并與陽性血清的沉淀線末端吻合，則被檢血清判為陽性。5.2弱陽性。被檢血清與抗原孔之間沒有沉淀線，但陽性血清的沉淀線末端向被檢血清孔偏彎，此被檢血清判為弱陽性（需重復(fù)試驗）。5.3

陰性。被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，且陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陰性。

附件3神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗神經(jīng)氨酸酶是流感病毒的兩種表面糖蛋白之一，它具有酶的活性。NA與底物(胎球蛋白)混合，37℃溫育過夜，可使胎球蛋白釋放出唾液酸，唾液酸經(jīng)碘酸鹽氧化，經(jīng)硫代巴比妥酸作用形成生色團，該生色團用有機溶劑提取后便可用分光光度計測定。反應(yīng)中出現(xiàn)的粉紅色深淺與釋放的唾液酸的數(shù)量成比例，即與存在的流感病毒的數(shù)量成比例。在進行病毒NA亞型鑒定時，當(dāng)已知的標(biāo)準NA分型抗血清與病毒NA亞型一致時，抗血清就會將NA中和，從而減少或避免了胎球蛋白釋放唾液酸，最后不出現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)，即看不到粉紅色出現(xiàn)，則表明血清對NA抑制陽性。該試驗可用于分離株NA亞型的鑒定，也可用于血清中NI抗體的定性測定。1

溶液配置1.1胎球蛋白：48-50mg/ml;1.2過碘酸鹽：4.28克過碘酸鈉+38ml無離子水+62ml濃正磷酸，充分混合，棕色瓶存放；1.3砷試劑：10克亞砷酸鈉+7.1克無水硫酸鈉+100ml無離子水+0.3ml濃硫酸；1.4硫代巴比妥酸：1.2克硫代巴比妥酸+14.2克無水硫酸鈉+200ml無離子水，煮沸溶解，使用期一周。2

操作方法2.1按下圖所示標(biāo)記試管○

○

○

○N1原液

N110倍

N1100倍

N11000倍○

○

○

○N2原液

N210倍

N2100倍

N21000倍○

○

○

○陰性血清原液

陰性血清10倍

陰性血清100倍

陰性血清1000倍

2.2

將N1、N2標(biāo)準陽性血清和陰性血清分別按原液、10倍、100倍稀釋，并分別加入標(biāo)記好的相應(yīng)試管中。2.3

將已經(jīng)確定HA亞型的待檢雞胚尿囊液稀釋至HA價為16倍，每管均加入0.05ml，混勻37℃水浴1小時。2.4

每管加入的胎球蛋白溶液（50mg/ml）0.1ml，混勻，擰上蓋后37℃水浴16-18小時。2.5

室溫冷卻后，每管加入0.1ml過碘酸鹽混勻，室溫靜置20分鐘。2.6

每管加入1ml砷試劑，振蕩至棕色消失乳白色出現(xiàn)。2.7

每管加入2.5ml硫代巴比妥酸試劑，將試管置煮沸的水浴中15分鐘，不出現(xiàn)粉紅色的為神經(jīng)氨酸酶抑制陽性，即待檢病毒的神經(jīng)氨酸酶亞型與加入管中的標(biāo)準神經(jīng)氨酸酶分型血清亞型一致。

附件4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物和雞胚尿囊液中禽流感病毒核酸。鑒于RT-PCR方法的敏感性和特異性，引物的選擇是最為重要的，通常引物是以已知序列為基礎(chǔ)設(shè)計的，大量掌握國內(nèi)分離株的序列是設(shè)計特異引物的前題和基礎(chǔ)。利用RT-PCR的通用引物可以檢測是否有A型流感病毒的存在，亞型特異性引物則可進行禽流感的分型診斷和禽流感病毒的亞型鑒定。1

試劑/引物1.1

變性液：見附錄A.11.2

2M醋酸鈉溶液(pH4.0)：見附錄A.21.3

水飽和酚（pH4.0）1.4

氯仿/異戊醇混合液：見附錄A.31.5

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200u/μL）1.6

RNA酶抑制劑(40u/μL)1.7

TaqDNA聚合酶(5u/μL)1.8

1.0%瓊脂糖凝膠：見附錄A.41.9

50×TAE緩沖液：見附錄A.51.10

溴化乙錠(10μg/μL)：見附錄A.61.11

加樣緩沖液：見附錄A.71.12

焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水：見附錄A.81.13

5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液（附錄A.9）1.14

2.5mmoldNTPs（附錄A.10）1.15

10×PCRBuffer（附錄A.11）1.16

DNA分子量標(biāo)準1.17

引物：見附錄B2

操作程序2.1

樣品的采集和處理：按照GB/T18936中提供方法進行。2.2

RNA的提取2.2.1

設(shè)立陽性、陰性樣品對照。2.2.2異硫氰酸胍一步法2.2.2.1向組織或細胞中加入適量的變性液，勻漿。2.2.2.2將混合物移至一管中，按每毫升變性液中立即加入0.1mL乙酸鈉，1mL酚，0.2ml氯仿-異戊醇。加入每種組分后，蓋上管蓋，倒置混勻。2.2.2.3將勻漿劇烈振蕩10s。冰浴15min使核蛋白質(zhì)復(fù)合體徹底裂解。2.2.2.412000r/min，4℃離心20min，將上層含RNA的水相移入一新管中。為了降低被處于水相和有機相分界處的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下層。2.2.2.5加入等體積的異丙醇，充分混勻液體，并在-20℃沉淀RNA1h或更長時間。2.2.2.64℃12000r/min離心10min，棄上清，用75%的乙醇洗滌沉淀，離心，用吸頭徹底吸棄上清，自然條件下干燥沉淀，溶于適量DEPC處理的水中。-20℃貯存，備用。2.2.3也可選擇市售商品化RNA提取試劑盒，完成RNA的提取。2.3反轉(zhuǎn)錄2.3.1取5μLRNA，加1μL反轉(zhuǎn)錄引物，70℃作用5min。2.3.2冰浴2min。2.3.3繼續(xù)加入：5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液

4μL0.1MDTT

2μL2.5mmoldNTPs

2μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶

0.5μLRNA酶抑制劑

0.5μLDEPC水

11μL37℃水浴1h，合成cDNA鏈。取出后可直接進行PCR，或者放于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炛型瑫r設(shè)立陽性和陰性對照。2.4PCR根據(jù)擴增目的不同，選擇不同的上/下游引物，M-229U/M-229L是型特異性引物，用于擴增禽流感病毒的M基因片段；H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-501L、H9-732U/H9-732L分別特異性擴增H5、H7、H9亞型血凝素基因片段；N1-358U/N1-358L、N2-377U/N2-377L分別特異性擴增N1、N2亞型神經(jīng)氨酸酶基因片段。PCR為50μL體系，包括：雙蒸滅菌水

37.5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

4μL上游引物

0.5μL下游引物

0.5μL10×PCRBuffer

5μL2.5mmoldNTPs

2μLTaq酶

0.5μL首先加入雙蒸滅菌水，然后按順序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混懸，瞬時離心，使液體都沉降到PCR管底。在每個PCR管中加入1滴液體石蠟(約20μL)。循環(huán)參數(shù)為95℃5min，94℃45s，52℃45s，72℃45s，循環(huán)30次，72℃延伸6min結(jié)束。設(shè)立陽性對照和陰性對照。2.5電泳2.5.1制備1.0%瓊脂糖凝膠板，見附錄A.4。2.5.2取5μLPCR產(chǎn)物與0.5μL加樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。2.5.3加入分子量標(biāo)準。2.5.4蓋好電泳儀，插好電極，5V/cm電壓電泳，30～40min。2.5.5用紫外凝膠成像儀觀察、掃描圖片存檔，打印。2.5.6用分子量標(biāo)準比較判斷PCR片段大小。3

結(jié)果判定3.1在陽性對照出現(xiàn)相應(yīng)擴增帶、陰性對照無此擴增帶時判定結(jié)果。3.2用M-229U/M-229L檢測，出現(xiàn)大小為229bp擴增片段時，判定為禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。3.3用H5-380U/H5-380L檢測，出現(xiàn)大小為380bp擴增片段時，判定為H5血凝素亞型禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。3.4用H7-501U/H7-501L檢測，出現(xiàn)大小為501bp擴增片段時，判定為H7血凝素亞型禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。3.5用H9-732U/H9-732L檢測，出現(xiàn)大小為732bp擴增片段時，判定為H9血凝素亞型禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。3.6用N1-358U/N1-358L檢測，出現(xiàn)大小為358bp擴增片段時，判定為N1神經(jīng)氨酸酶亞型禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。3.7用N2-377U/N2-377L檢測，出現(xiàn)大小為377bp擴增片段時，判定為N2神經(jīng)氨酸酶亞型禽流感病毒陽性，否則判定為陰性。

附錄A相關(guān)試劑的配制A.1

變性液4M異硫氰酸胍25mM檸檬酸鈉.2H2O0.5%（m/V）十二烷基肌酸鈉0.1Mβ-巰基乙醇具體配制：將250g異硫氰酸胍、0.75M（PH7.0）檸檬酸鈉17.6ml和26.4ml10%（m/V）十二烷基肌酸鈉溶于293ml水中。65℃條件下攪拌、混勻，直至完全溶解。室溫條件下保存，每次臨用前按每50ml變性液加14.4mol/L的β-巰基乙醇0.36ml的劑量加入。變性液可在室溫下避光保存數(shù)月。A.2

2mol/L醋酸鈉溶液(pH4.0)乙酸鈉16.4g冰乙酸調(diào)pH至4.0滅菌雙蒸水加至100mLA.3

氯仿/異戊醇混合液氯仿49mL異戊醇1mLA.4

1.0%瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖1.0g0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL微波爐中完全融化，待冷至50℃-60℃時，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。A.5

50×TAE電泳緩沖液A.5.1

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.5.2

TAE電泳緩沖液(50×)配制羥基甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(PH8.0)100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用A.6

溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠20mg滅菌雙蒸水加至20mLA.7

10×加樣緩沖液聚蔗糖25g滅菌雙蒸水100mL溴酚藍0.1g二甲苯青0.1gA.8

DEPC水超純水100mL焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL室溫過夜，121℃高壓15min，分裝到1.5mLDEPC處理過的微量管中。A.9

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶5×反應(yīng)緩沖液1moLTris-HCl(pH8.3)5mLKCl0.559gMgCl20.029gDTT0.154g滅菌雙蒸水加至100mLA.10

2.5mmol/LdNTPdATP(10mmol/L)20μLdTTP(10mmol/L)20μLdGTP(10mmol/L)20μLdCTP(10mmol/L)20μLA.11

10×PCR緩沖液1MTris-HCl(pH8.8)10mL1MKCl50mLNonidetP400.8mL1.5moLMgCl21mL滅菌雙蒸水加至100mL

附錄B禽流感病毒RT-PCR試驗用引物

B.1

反轉(zhuǎn)錄引物Uni12:5′-AGCAAAAGCAGG-3′，引物濃度為20pmol。B.2

PCR引物見下表，引物濃度均為20pmol。B.2

PCR過程中選擇的引物引物名稱引物序列長度(bp)擴增目的M-229U5′-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′229通用引物M-229L5′-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3′H5-380U5′-AGTGAATTGGAATATGGTAACTG-3′380H5H5-380L5′-AACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT-3′H7-501U5′-AATGCACARGGAGGAGGAACT-3′501H7H7-501L5′-TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA-3′H9-732U5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′732H9H9-732L5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′N1-358U5′-ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC-3′358N1N1-358L5′-GTCWCCGAAAACYCCACTGCA-3′N2-377U5′-GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG-3′377N2N2-377L5′-GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA-3′W=(AT)；Y=(CT)；R=(AG)。

附件5禽流感病毒致病性測定

高致病性禽流感是指由強毒引起的感染，感染禽有時可見典型的高致病性禽流感特征，有時則未見任何臨床癥狀而突然死亡。所有分離到的高致病性病毒株均為H5或H7亞型，但大多數(shù)H5或H7亞型仍為弱毒株。評價分離株是否為高致病性或者是潛在的高致病性毒株具有重要意義。1歐盟國家對高致病性禽流感病毒判定標(biāo)準接種6周齡的SPF雞，其IVPI大于1.2的或者核苷酸序列在血凝素裂解位點處有一系列的連續(xù)堿性氨基酸存在的H5或H7亞型流感病毒均判定為高致病性病毒。靜脈接種指數(shù)（IVPI）測定方法：收獲接種病毒的SPF雞胚的感染性尿囊液，測定其血凝價>1/16（24或lg24）將含毒尿囊液用滅菌生理鹽水稀釋10倍（切忌使用抗生素），將此稀釋病毒液以0.1mL/羽靜脈接種10只6周齡SPF雞,2只同樣雞只接種0.1mL稀釋液作對照（對照雞不應(yīng)發(fā)病，也不計入試驗雞）。每隔24小時檢查雞群一次，共觀察10天。根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法每天進行記錄：正常雞記為0，病雞記為1，重病雞記為2，死雞記為3（病雞和重病雞的判斷主要依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn)。一般而言，“病雞”表現(xiàn)有下述一種癥狀，而“重病雞”則表現(xiàn)下述多個癥狀，如呼吸癥狀、沉郁、腹瀉、雞冠和/或肉髯發(fā)紺、臉和/或頭部腫脹、神經(jīng)癥狀。死亡雞在其死后的每次觀察都記為3）。

IVPI值＝每只雞在10天內(nèi)所有數(shù)字之和/（10只雞×10天），如指數(shù)為3.00，說明所有雞24小時內(nèi)死亡；指數(shù)為0.00，說明10天觀察期內(nèi)沒有雞表現(xiàn)臨床癥狀。當(dāng)IVPI值大于1.2時，判定分離株為高致病性禽流感病毒（HPAIV）。IVPI測定舉例：(數(shù)字表示在特定日期表現(xiàn)出臨床癥狀的雞只數(shù)量)臨床癥狀1D2D3D4D5D6D7D8D9D10總計數(shù)值正常10100000000020x0=0發(fā)病00300000003x1=3麻痹004510000010x2=20死亡00359101010101067x3=201

總計=224上述例子中的IVPI為:

224/100=2.24＞1.2

2

OIE對高致病性禽流感病毒的分類標(biāo)準2.1取HA滴度>1/16的無菌感染流感病毒的雞胚尿囊液用等滲生理鹽水1:10稀釋，以0.2mL／羽的劑量翅靜脈接種8只4～8周齡SPF雞，在接種10天內(nèi)，能導(dǎo)致6只或6只以上雞死亡，判定該毒株為高致病性禽流感病毒株。2.2如分離物能使1～5只雞致死，但病毒不是H5或H7亞型，則應(yīng)進行下列試驗：將病毒接種于細胞培養(yǎng)物上，觀察其在胰蛋白酶缺乏時是否引起細胞病變或形成蝕斑。如果病毒不能在細胞上生長，則分離物應(yīng)被考慮為非高致病性禽流感病毒。2.3所有低致病性的H5和H7毒株和其它病毒，在缺乏胰蛋白酶的細胞上能夠生長時，則應(yīng)進行與血凝素有關(guān)的肽鏈的氨基酸序列分析，如果分析結(jié)果同其它高致病性流感病毒相似，這種被檢驗的分離物應(yīng)被考慮為高致病性禽流感病毒。

附件6禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測

1材料與試劑1.1儀器與器材熒光RT-PCR檢測儀高速臺式冷凍離心機（離心速度12000r/min以上）臺式離心機（離心速度3000r/min）混勻器冰箱（2～8℃和-20℃兩種）微量可調(diào)移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套帶濾芯吸頭Eppendorf管（1.5mL）1.2試劑除特別說明以外，本標(biāo)準所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器（用DEPC水處理后高壓滅菌）分裝。氯仿；異丙醇：-20℃預(yù)冷；PBS：121±2℃，15min高壓滅菌冷卻后，無菌條件下加入青霉素、鏈霉素各10000U/mL；75%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20℃預(yù)冷。禽流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒：組成、功能及使用注意事項見附錄。2抽樣2.1采樣工具下列采樣工具必須經(jīng)（121±2）℃，15min高壓滅菌并烘干：棉拭子、剪刀、鑷子、注射器、1.5mlEppendorf管、研缽。2.2樣品采集1)活禽取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮3-5次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便；將拭子一并放入盛有1.0mLPBS的1.5mLEppendorf管中，加蓋、編號。2)肌肉或組織臟器待檢樣品裝入一次性塑料袋或其它滅菌容器，編號，送實驗室。3)血清、血漿用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。2.3樣品貯運樣品采集后，放入密閉的塑料袋內(nèi)（一個采樣點的樣品，放一個塑料袋），于保溫箱中加冰、密封，送實驗室。2.4樣品制備1)咽喉、泄殖腔拭子樣品在混合器上充分混合后，用高壓滅菌鑷子將拭子中的液體擠出，室溫放置30min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mLEppendorf管中，編號備用。2)肌肉或組織臟器取待檢樣品2.0g于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10mLPBS混勻，4℃，3000r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mLEppendorf管中，編號備用。2.5樣本存放制備的樣本在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存應(yīng)置-70℃以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。3操作方法3.1實驗室標(biāo)準化設(shè)置與管理禽流感病毒通用熒光RT－PCR檢測的實驗室規(guī)范。3.2樣本的處理在樣本制備區(qū)進行。⑴取n個滅菌的1.5mLEppendorf管，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），編號。⑵每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL，一份樣本換用一個吸頭，再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻）。于4℃、12000r/min離心15min。⑶取與⑴相同數(shù)量滅菌的1.5mLEppendorf管，加入500μL異丙醇（-20℃預(yù)冷），做標(biāo)記。吸取本標(biāo)準⑵各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取500μL，不能吸出中間層，顛倒混勻。⑷于4℃、12000r/min離心15min（Eppendorf管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入600μL75％乙醇，顛倒洗滌。⑸于4℃、12000r/min離心10min（Eppendorf管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。⑹4000r/min離心10s（Eppendorf管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥3min，不能過于干燥，以免RNA不溶。⑺加入11μLDEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內(nèi)進行PCR擴增；若需長期保存須放置-70℃冰箱。3.3檢測⑴擴增試劑準備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行。從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2000r/min離心5s。設(shè)所需熒光RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應(yīng)體系配制如下：RT-PCR反應(yīng)液15μL，Taq酶0.25μL。根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積中，向其中加入0.25×n顆RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶顆粒，充分混合均勻，向每個熒光RT-PCR管中各分裝15μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。⑵加樣在樣本處理區(qū)進行。在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋，500r/min離心30s。⑶熒光RT-PCR檢測在檢測區(qū)進行。將本標(biāo)準中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置：第一階段，反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；第二階段，預(yù)變性92℃/3min；第三階段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5個循環(huán)；第四階段，92℃/10s，60℃/30s，40個循環(huán)，在第四階段每個循環(huán)的退火延伸時收集熒光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。4結(jié)果判定4.1結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。4.2質(zhì)控標(biāo)準⑴陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。⑵陽性對照的Ct值應(yīng)＜28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。4.3結(jié)果描述及判定⑴陰性無Ct值并且無擴增曲線，表示樣品中無禽流感病毒。⑵陽性Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在禽流感病毒。⑶有效原則Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無Ct值者為陰性，否則為陽性。

附錄試劑盒的組成

1試劑盒組成每個試劑盒可做48個檢測，包括以下成分：裂解液30mL×1盒DEPC水1mL×1管RT-PCR反應(yīng)液（內(nèi)含禽流感病毒的引物、探針）750μL×1管RT-PCR酶1顆/管×12管Taq酶12μL×1管陰性對照1mL×1管陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA）1mL×1管2說明2.1裂解液的主要成分為異硫氰酸胍和酚，為RNA提取試劑，外觀為紅色液體，于4℃保存。2.2DEPC水，用1%DEPC處理后的去離子水，用于溶解RNA。2.3RT-PCR反應(yīng)液中含有特異性引物、探針及各種離子。3功能試劑盒可用于禽類相關(guān)樣品（包括肌肉組織、臟器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血漿等）中禽流感病毒的檢測。4使用時的注意事項4.1在檢測過程中，必須嚴防不同樣品間的交叉污染。4.2反應(yīng)液分裝時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，上機前檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。RT-PCR酶顆粒極易吸潮失活，必須在室溫條件下置于干燥器內(nèi)保存，使用時取出所需數(shù)量，剩余部分立即放回干燥器中。

附件7樣品采集、保存和運輸

活禽病料應(yīng)包括氣管和泄殖腔拭子，最好是采集氣管拭子。小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可采集新鮮糞便。死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品。將每群采集的10份棉拭子，放在同一容器內(nèi)，混合為一個樣品；容器中放有含有抗菌素的pH值為7.0-7.4的PBS液?？股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL），慶大霉素（50μg/mL），制霉菌素（1000IU/mL）。但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍。加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0-7.4。樣品應(yīng)密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷劑的容器中運輸，容器必須密封，防止?jié)B漏。樣品若能在24小時內(nèi)送到實驗室，冷藏運輸。否則，應(yīng)冷凍運輸。若樣品暫時不用，則應(yīng)冷凍（最好-70℃或以下）保存。采

樣

單樣品名稱

樣品編號

采樣基數(shù)

采樣數(shù)量

采樣日期

保存情況冷凍（藏）被采樣單位

通訊地址

聯(lián)系電話

郵

編

被采樣單位蓋章或簽名

年

月

日采樣單位蓋章采樣人簽名

年

月

日備注：(如禽流感的免疫情況以及20天內(nèi)是否進行過其它免疫注射或異常刺激)此單一式三份，第一聯(lián)存根，第二聯(lián)隨樣品，第三聯(lián)由被采樣單位保存

附件8消毒技術(shù)規(guī)范

1設(shè)備和必需品1.1清洗工具：掃帚、叉子、鏟子、鍬和沖洗用水管。1.2消毒工具：噴霧器、火焰噴射槍、消毒車輛、消毒容器等。1.3消毒劑：清潔劑、醛類、強堿、氯制劑類等合適的消毒劑。1.4防護裝備：防護服、口罩、膠靴、手套、護目鏡等。2圈舍、場地和各種用具的消毒2.1對圈舍及場地內(nèi)外采用噴灑消毒液的方式進行消毒，消毒后對污物、糞便、飼料等進行清理；清理完畢再用消毒液以噴灑方式進行徹底消毒，消毒完畢后再進行清洗；不易沖洗的圈舍清除廢棄物和表土，進行堆積發(fā)酵處理。2.2對金屬設(shè)施設(shè)備，可采取火焰、熏蒸等方式消毒；木質(zhì)工具及塑料用具采取用消毒液浸泡消毒；工作服等采取浸泡或高溫高壓消毒。3疫區(qū)內(nèi)可能被污染的場所應(yīng)進行噴灑消毒。4污水溝、水塘可投放生石灰或漂白粉。5運載工具清洗消毒5.1在出入疫點、疫區(qū)的交通路口設(shè)立消毒站點，對所有可能被污染的運載工具應(yīng)當(dāng)嚴格消毒。5.2從車輛上清理下來的廢棄物按無害化處理。6疫點每天消毒1次連續(xù)1周，1周以后每兩天消毒1次。疫區(qū)內(nèi)疫點以外的區(qū)域每兩天消毒1次。

附件9撲殺方法

1窒息先將待撲殺禽裝入袋中，置入密封車或其它密封容器，通入二氧化碳窒息致死；或?qū)⑶菅b入密封袋中，通入二氧化碳窒息致死。2扭頸撲殺量較小時采用。根據(jù)禽只大小，一手握住頭部，另一手握住體部，朝相反方向扭轉(zhuǎn)拉伸。3其它可根據(jù)本地情況，采用其它能避免病原擴散的致死方法。撲殺人員的防護符合NY/T768《高致病性禽流感人員防護技術(shù)規(guī)范》的要求。

附件10無害化處理

所有病死禽、被撲殺禽及其產(chǎn)品、排泄物以及被污染或可能被污染的墊料、飼料和其它物品應(yīng)當(dāng)進行無害化處理。清洗所產(chǎn)生的污水、污物進行無害化處理。

無害化處理可以選擇深埋、焚燒或高溫高壓等方法，飼料、糞便可以發(fā)酵處理。1深埋1.1選址應(yīng)當(dāng)避開公共視線，選擇地表水位低、遠離學(xué)校、公共場所、居民住宅區(qū)、動物飼養(yǎng)場、屠宰場及交易市場、村莊、飲用水源地、河流等的地域。位置和類型應(yīng)當(dāng)有利于防洪。1.2坑的覆蓋土層厚度應(yīng)大于1.5米，坑底鋪墊生石灰，覆蓋土以前再撒一層生石灰。1.3禽類尸體置于坑中后，澆油焚燒，然后用土覆蓋，與周圍持平。填土不要太實，以免尸腐產(chǎn)氣造成氣泡冒出和液體滲漏。1.4飼料、污染物等置于坑中，噴灑消毒劑后掩埋。2工廠化處理將所有病死牲畜、撲殺牲畜及其產(chǎn)品密封運輸至無害化處理廠，統(tǒng)一實施無害化處理。3發(fā)酵飼料、糞便可在指定地點堆積，密封徹底發(fā)酵，表面應(yīng)進行消毒。4無害化處理應(yīng)符合環(huán)保要求，所涉及到的運輸、裝卸等環(huán)節(jié)應(yīng)避免灑漏，運輸裝卸工具要徹底消毒。

附件11高致病性禽流感流行病學(xué)調(diào)查規(guī)范

1范圍本標(biāo)準規(guī)定了發(fā)生高致病性禽流感疫情后開展的流行病學(xué)調(diào)查技術(shù)要求。本標(biāo)準適用于高致病性禽流感暴發(fā)后的最初調(diào)查、現(xiàn)地調(diào)查和追蹤調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準的引用而成為本標(biāo)準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單位（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準。鼓勵根據(jù)本標(biāo)準達成協(xié)議的各方研究可以使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準。NY764

高致病性禽流感疫情判定及撲滅技術(shù)規(guī)范NY/T768

高致病性禽流感人員防護技術(shù)規(guī)范3

術(shù)語和定義3.1最初調(diào)查獸醫(yī)技術(shù)人員在接到養(yǎng)禽場/戶懷疑發(fā)生高致病性禽流感的報告后，對所報告的養(yǎng)禽場/戶進行的實地考察以及對其發(fā)病情況的初步核實。3.2現(xiàn)地調(diào)查獸醫(yī)技術(shù)人員或省級、國家級動物流行病學(xué)專家對所報告的高致病性禽流感發(fā)病場/戶的場區(qū)狀況、傳染來源、發(fā)病禽品種與日齡、發(fā)病時間與病程、發(fā)病率與病死率以及發(fā)病禽舍分布等所作的現(xiàn)場調(diào)查。3.3跟蹤調(diào)查在高致病性禽流感暴發(fā)及撲滅前后，對疫點的可疑帶毒人員、病死禽及其產(chǎn)品和傳播媒介的擴散趨勢、自然宿主發(fā)病和帶毒情況的調(diào)查。

4

最初調(diào)查4.1目的核實疫情、提出對疫點的初步控制措施，為后續(xù)疫情確診和現(xiàn)地調(diào)查提供依據(jù)。4.2組織與要求4.2.1

動物防疫監(jiān)督機構(gòu)接到養(yǎng)禽場/戶懷疑發(fā)病的報告后，應(yīng)立即指派2名以上獸醫(yī)技術(shù)人員，攜必要的器械、用品和采樣用容器，在24h以內(nèi)盡快趕赴現(xiàn)場，核實發(fā)病情況。4.2.2

被派獸醫(yī)技術(shù)人員至少3d內(nèi)沒有接觸過高致病性禽流感病禽及其污染物，按NY/T768要求做好個人防護。4.3內(nèi)容4.3.1調(diào)查發(fā)病禽場的基本狀況、病史、癥狀以及環(huán)境狀況四個方面，完成最初調(diào)查表（見附錄A）。4.3.2認真檢查發(fā)病禽群狀況，根據(jù)NY764做出是否發(fā)生高致病性禽流感的初步判斷。4.3.3若不能排除高致病性禽流感，調(diào)查人員應(yīng)立即報告當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)并建議提請省級/國家級動物流行病學(xué)專家作進一步診斷，并應(yīng)配合做好后續(xù)采樣、診斷和疫情撲滅工作；4.3.4實施對疫點的初步控制措施，禁止家禽、家禽產(chǎn)品和可疑污染物品從養(yǎng)禽場/戶運出，并限制人員流動；4.3.5畫圖標(biāo)出疑病禽場/戶周圍10km以內(nèi)分布的養(yǎng)禽場、道路、河流、山嶺、樹林、人工屏障等，連同最初調(diào)查表一同報告當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)。5現(xiàn)地調(diào)查5.1目的在最初調(diào)查無法排除高致病性禽流感的情況下，對報告養(yǎng)禽場/戶作進一步的診斷和調(diào)查，分析可能的傳染來源、傳播方式、傳播途徑以及影響疫情控制和撲滅的環(huán)境和生態(tài)因素，為控制和撲滅疫情提供技術(shù)依據(jù)。5.2組織與要求5.2.1

省級動物防疫監(jiān)督機構(gòu)接到懷疑發(fā)病報告后，應(yīng)立即派遣流行病學(xué)專家配備必要的器械和用品于24h內(nèi)赴現(xiàn)場，作進一步診斷和調(diào)查。5.2.2

被派獸醫(yī)技術(shù)人員應(yīng)遵照4.2.2的要求。5.3內(nèi)容5.3.1在地方動物防疫監(jiān)督機構(gòu)技術(shù)人員初步調(diào)查的基礎(chǔ)上，對發(fā)病養(yǎng)禽場/戶的發(fā)病情況、周邊地理地貌、野生動物分布、近期家禽、產(chǎn)品、人員流動情況等開展進一步的調(diào)查，分析傳染來源、傳播途徑以及影響疫情控制和消滅的環(huán)境和生態(tài)因素。5.3.2盡快完成流行病學(xué)現(xiàn)地調(diào)查表（見附錄B）并提交省和地方動物防疫監(jiān)督機構(gòu)。5.3.3與地方動物防疫監(jiān)督機構(gòu)密切配合，完成病料樣品的采集、包裝及運輸?shù)仍\斷事宜。5.3.4對所發(fā)疫病作出高致病性禽流感診斷后，協(xié)助地方政府和地方動物防疫監(jiān)督機構(gòu)撲滅疫情。6跟蹤調(diào)查6.1目的追蹤疫點傳染源和傳播媒介的擴散趨勢、自然宿主的發(fā)病和帶毒情況，為可能出現(xiàn)的公共衛(wèi)生危害提供預(yù)警預(yù)報。6.2組織當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)調(diào)查人員在省級或國家級動物流行病學(xué)專家指導(dǎo)下對有關(guān)人員、可疑感染家禽、可疑污染物品和帶毒宿主進行追蹤調(diào)查。6.3內(nèi)容6.3.1追蹤出入發(fā)病養(yǎng)禽場/戶的有關(guān)工作人員和所有家禽、禽產(chǎn)品及有關(guān)物品的流動情況，并對其作適當(dāng)?shù)母綦x觀察和控制措施，嚴防疫情擴散。6.3.2對疫點、疫區(qū)的家禽、水禽、豬、留鳥、候鳥等重要疫源宿主進行發(fā)病情況調(diào)查，追蹤病毒變異情況。6.3.3完成跟蹤調(diào)查表（見附錄C）并提交本次暴發(fā)疫情的流行病學(xué)調(diào)查報告。

附錄A高致病性禽流感流行病學(xué)最初調(diào)查表任務(wù)編號：國標(biāo)碼：調(diào)查者姓名：電

話：場/戶主姓名：電

話：場/戶名稱郵

編：場/戶地址

飼養(yǎng)品種

飼養(yǎng)數(shù)量

場址地形環(huán)境描述

發(fā)病時天氣狀況溫度干旱/下雨主風(fēng)向場區(qū)條件□進場要洗澡更衣

□進生產(chǎn)區(qū)要換膠靴

□場舍門口有消毒池□供料道與出糞道分開污水排向□附近河流

□農(nóng)田溝渠

□附近村莊

□野外湖區(qū)

□野外水塘□野外荒郊

□其他過去一年曾發(fā)生的疫病□低致病性禽流感

□雞新城疫

□馬立克氏病

□禽白血病□雞傳染性喉氣管炎

□雞傳染性貧血

□雞傳染性支氣管炎□雞傳染性發(fā)氏囊病本次典型發(fā)病情況□急性發(fā)病死亡

□腳鱗出血

□雞冠出血或發(fā)紺、頭部水腫□肌肉和其他組織器官廣泛性嚴重出血

□神經(jīng)癥狀

□綠色稀便□其他（請?zhí)顚懀阂咔楹藢嵔Y(jié)論□不能排除高致病性禽流感

□排除高致病性禽流感調(diào)查人員簽字：時間：

附錄B高致病性禽流感現(xiàn)地調(diào)查表

疫情類型

（1）確診

（2）疑似

（3）可疑B1疫點易感禽與發(fā)病禽現(xiàn)場調(diào)查B1.1

最早出現(xiàn)發(fā)病時間:

年

月

日

時，發(fā)病數(shù)：

只，死亡數(shù)：

只，圈舍（戶）編號:

。B1.2

禽群發(fā)病情況：

圈舍（戶）編號家禽品種日齡發(fā)病日期發(fā)病數(shù)開始死亡日期死亡數(shù)

B1.3襲擊率：

計算公式:襲擊率=（疫情暴發(fā)以來發(fā)病禽數(shù)÷疫情暴發(fā)開始時易感禽數(shù)）×100%B2可能的傳染來源調(diào)查B2.1發(fā)病前30d內(nèi)，發(fā)病禽舍是否新引進了家禽？（1）是

（2）否引進禽品種引進數(shù)量混群情況*最初混群時間健康狀況引進時間來源

*混群情況為：（1）同舍（戶）飼養(yǎng)（2）鄰舍（戶）飼養(yǎng)（3）飼養(yǎng)于本場（村）隔離場,隔離場（舍）人員應(yīng)單獨隔離B2.2發(fā)病前30d內(nèi)發(fā)病禽場/戶是否有野鳥棲息或捕獲鳥？（1）是

（2）否鳥

名數(shù)

量來

源鳥停留地點*鳥病死數(shù)量與禽畜接觸頻率**

*停留地點：包括禽場（戶）內(nèi)建筑場上、樹上、存料處及料槽等；**接觸頻率：指鳥與停留地點的接觸情況，分為每天、數(shù)次、僅一次。

B2.3發(fā)病前30d內(nèi)是否運入可疑的被污染物品（藥品）？（1）是

（2）否物品名稱數(shù)

量經(jīng)過或存放地運入后使用情況

B2.4最近30d內(nèi)是否有場外有關(guān)業(yè)務(wù)人員來場？（1）無

（2）有，請寫出訪問者姓名、單位、訪問日期，并注明是否來自疫區(qū)。來訪人來訪日期來訪人職業(yè)/電話是否來自疫區(qū)

B2.5發(fā)病場（戶）是否靠近其他養(yǎng)禽場及動物集散地？（1）是

（2）否B2.5.1與發(fā)病場的相對地理位置_____________________。B2.5.2與發(fā)病場的距離_________________。B2.5.3其大致情況__________。B2.6發(fā)病場周圍10公里以內(nèi)是否有下列動物群？B2.6.1豬，__________。B2.6.2野禽，具體禽種：__________。B2.6.3野水禽，具體禽種：__________。B2.6.4田鼠、家鼠：__________。B2.6.5其它：__________。B2.7

在最近25-30d內(nèi)本場周圍10公里有無禽發(fā)病？（1）無

（2）有，請回答：B2.7.1發(fā)病日期：__________。B2.7.2病禽數(shù)量和品種：__________。B2.7.3確診/疑似診斷疾?。篲_________。B2.7.4場主姓名：__________。B2.7.5發(fā)病地點與本場相對位置、距離：__________。B2.7.6投藥情況：__________。B2.7.7疫苗接種情況：__________。B2.8

場內(nèi)是否有職員住在其他養(yǎng)殖場/養(yǎng)禽村？（1）無

（2）有B2.8.1該農(nóng)場所處的位置：__________。B2.8.2該場養(yǎng)禽的數(shù)量和品種：__________。B2.8.3該場禽的來源及去向：__________。B2.8.4職員拜訪和接觸他人地點：__________。B3

在發(fā)病前30d是否有飼養(yǎng)方式/管理的改變？（1）無

（2）有，__________。B4發(fā)病場（戶）周圍環(huán)境情況B4.1靜止水源-——沼澤、池塘或湖泊：（1）是

（2）否B4.2流動水源——灌溉用水、運河水、河水：（1）是

（2）否B4.3斷續(xù)灌溉區(qū)——方圓三公里內(nèi)無水面：（1）是

（2）否B4.4最近發(fā)生過洪水：（1）是

（2）否B4.5靠近公路干線：（1）是

（2）否B4.6靠近山溪或森（樹）林：（1）是

（2）否B5

該養(yǎng)禽場/戶地勢類型屬于：（1）盆地（2）山谷（3）高原（4）丘陵（5）平原（6）山區(qū)（7）其他（請注明）__________。B6飲用水及沖洗用水情況B6.1飲水類型：（1）自來水（2）淺井水（3）深井水（4）河塘水（5）其他B6.2沖洗水類型：（1）自來水（2）淺井水（3）深井水（4）河塘水（5）其他B7發(fā)病養(yǎng)禽場/戶高致病性禽流感疫苗免疫情況：（1）免疫

（2）不免疫B7.1疫苗生產(chǎn)廠家__________。B7.2疫苗品種、批號__________。B7.3被免疫雞數(shù)量__________。B8受威脅區(qū)免疫禽群情況B8.1免疫接種一個月內(nèi)禽只發(fā)病情況：（1）

未見發(fā)病（2）發(fā)病，發(fā)病率__________。B8.2異源亞型血清學(xué)檢測和病原學(xué)檢測標(biāo)本類型采樣時間檢測項目檢測方法結(jié)

果

注：標(biāo)本類型包括鼻咽、脾淋內(nèi)臟、血清及糞便等。

B9解除封鎖后是否使用崗哨動物（1）否

（2）是，簡述結(jié)果__________。B10最后診斷情況：B10.1確診HPAI，確診單位__________。B10.2排除，其他疫病名稱________