附件1

食品中大黃酚和橙黃決明素的測(cè)定

BJS201916

1范圍

本方法規(guī)定了食品（含保健食品）中大黃酚和橙黃決明素的高效液相色譜測(cè)定方法。

本方法適用于飲料、代用茶等食品及片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等劑型的保健食品中

大黃酚和橙黃決明素的含量測(cè)定。

2原理

試樣經(jīng)甲醇回流提取后，再以稀鹽酸水解，二氯甲烷萃取，采用配有二極管陣列檢測(cè)器

或紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

3試劑和材料

除另有說(shuō)明外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1甲醇（CH3OH)：色譜純。

3.1.2乙腈（C2H3N）：色譜純。

3.1.3磷酸（H3PO4）。

3.1.4二氯甲烷（CH2CL2）。

3.1.5鹽酸（HCL）。

3.1.6無(wú)水乙醇（CH3CH2OH）。

1

3.1.7乙酸乙酯（C4H8O2）。

3.1.8甲酸（CH2O2）。

3.2試劑配制

3.2.1磷酸水溶液（0.1%）：取磷酸（3.1.3）1.0mL，加水定容至1000mL。

3.2.2稀鹽酸：取鹽酸（3.1.5）234mL，用水溶解并定容至1000mL。

3.2.3無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液：取無(wú)水乙醇500mL與乙酸乙酯250mL，混勻。

3.2.4甲酸水溶液（0.1%）：取甲酸（3.1.8）1.0mL，加水稀釋并定容至1000mL。

3.3標(biāo)準(zhǔn)品

橙黃決明素、大黃酚的標(biāo)準(zhǔn)品的分子式、相對(duì)分子量、CAS登錄號(hào)見(jiàn)附錄A表A.1。

橙黃決明素的純度≥98%，大黃酚的純度≥99%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100μg/mL)：分別稱(chēng)取大黃酚、橙黃決明素（3.3）各0.0100g（精確至

0.0001g），置100mL棕色量瓶中，用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）溶解并稀

釋至刻度，搖勻，制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4℃冷藏保存，有效期6個(gè)月。

3.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（20μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取大黃酚、橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

(100μg/mL)(3.4.1)各5mL，置同一25mL棕色量瓶中，用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶

液（3.2.3）稀釋至刻度，搖勻。0～4℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。

3.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用無(wú)水乙醇-乙酸乙酯

（2+1）混合溶液（3.2.3）稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，該標(biāo)準(zhǔn)系列中大黃酚和橙黃決明素濃

度為0.2μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。臨用新制。

4儀器和設(shè)備

4.1高效液相色譜儀：配有二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器。

2

4.2超聲波清洗器。

4.3高速萬(wàn)能粉碎機(jī)。

4.4分析天平：感量分別為0.01g和0.01mg。

4.5電熱恒溫水浴鍋。

4.6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.7氮吹儀。

5分析步驟

5.1試樣制備

5.1.1固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣

取適量固態(tài)試樣（代用茶及片劑、膠囊內(nèi)容物、顆粒劑等保健食品）混勻，研細(xì)，或取

適量半固態(tài)試樣（軟膠囊內(nèi)容物）混勻，稱(chēng)取0.5g～1g（精確至0.001g），置平底燒瓶中，

加入甲醇50mL，混勻，稱(chēng)定重量，加熱回流1h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重

量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液25mL于平底燒瓶中，蒸干（或氮吹至干），加入稀鹽酸

（3.2.2）30mL，超聲2min，加熱回流水解1h，立即冷卻，置于分液漏斗中，先用少量水洗

滌燒瓶，再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振搖提取4次，

用量依次為40mL、30mL、30mL、20mL，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)脽o(wú)

水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻度，溶

液經(jīng)0.45μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍

內(nèi)，備用。

5.1.2液態(tài)試樣

取適量試樣（飲料、口服液）混勻，準(zhǔn)確吸取2.0～5.0mL，置平底燒瓶中，水浴蒸干，

3

加入稀鹽酸（3.2.2）10mL，超聲2min，加熱回流水解1h，立即冷卻，置于分液漏斗中，用

少量水洗滌燒瓶，再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振搖提

取4次，用量依次為15mL、10mL、10mL、10mL，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，

殘?jiān)脽o(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至

刻度，溶液經(jīng)0.45μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

線(xiàn)性范圍內(nèi)，備用。

5.2色譜參考條件

5.2.1色譜柱：BDSHYPERSILC18（4.6mm×250mm,5μm）或性能相當(dāng)者。

5.2.2流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%磷酸水溶液(3.2.1)，洗脫梯度程序見(jiàn)表1。

5.2.3流速：1.0mL/min。

5.2.4柱溫：30℃。

5.2.5檢測(cè)波長(zhǎng)：284nm。

5.2.6進(jìn)樣量：10μL。

表1梯度洗脫程序表

梯度時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）

06040

156040

229010

329010

376040

406040

5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（3.4.3）按液相色譜參考條件（5.2）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定相應(yīng)的色譜峰

面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

線(xiàn)。

5.4試樣溶液的測(cè)定

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將試樣溶液（5.1）按液相色譜參考條件（5.2）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)樣品溶液的色譜峰

面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)液中組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次。

6結(jié)果計(jì)算

固態(tài)或半固態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式（1）計(jì)算：

CVV1000（）

X1……………1

V0m1000

式中：

X—試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

C—試樣中所測(cè)的大黃酚或橙黃決明素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V—試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；

V1—最初加入甲醇的體積，單位為毫升（mL）；

V0—試樣加酸水解前取濾液體積，單位為毫升（mL）；

m—試樣稱(chēng)取的質(zhì)量，單位為克（g）；

液態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式（2）計(jì)算：

CV1000

X……………………（2）

V01000

式中：

X—試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量，單位為毫克每升（mg/L）；

C—試樣中所測(cè)的大黃酚或橙黃決明素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V—試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；

V0—試樣吸取體積，單位為毫升（mL）；

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有

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效數(shù)字。

7精密度

在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

8檢出限

固體或半固體試樣：當(dāng)稱(chēng)樣量為0.5g時(shí)，該方法測(cè)定條件下，橙黃決明素和大黃酚的

檢出限均為4mg/kg，定量限為12mg/kg。

液體試樣：當(dāng)取樣量為5mL時(shí)，該方法測(cè)定條件下，橙黃決明素和大黃酚的檢出限均

為0.2mg/L，定量限為0.6mg/L。

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附錄A

化合物相關(guān)信息

表A.1大黃酚和橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)品的中、英文名稱(chēng)、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量

中文名稱(chēng)英文名稱(chēng)CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子量

大黃酚Chrysophanol481-74-3C15H10O4254.23

橙黃決明素Aurantio-obtusin67979-25-3C17H14O7330.29

7

附錄B

大黃酚和橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

mAU

25

2

1

20

15

10

5

0

-5

0.05.010.015.020.025.030.035.0min

圖B.1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

1.橙黃決明素；2.大黃酚

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附錄C

定性確證試驗(yàn)

C.1.色譜參考條件

a)色譜柱：C18柱，1.7μm，100×3.0mm（內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者。

b)流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液（3.2.4）；B相為乙腈（3.1.2）；A+B=40+60。

c)流速：0.3mL/min。

d)柱溫：35℃。

e)進(jìn)樣量：1μL。

C.2質(zhì)譜參考條件

f)離子源：電噴霧離子源(ESI)。

g)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

h)掃描方式：正離子掃描(ESI+)。

i)毛細(xì)管電壓：3000V。

j)噴嘴電壓：1500V。

k)霧化氣溫度：200℃。

l)霧化氣流速：14.0L/min。

m)霧化氣壓力：20psi。

n)鞘氣流速：11.0L/min。

o)鞘氣溫度：250℃。

p)其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表C.1。

表C.1化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)

母離子子離子碰撞能量保留時(shí)間

序號(hào)化合物名稱(chēng)電離方式

(m/z)(m/z)(V)（min）

9

297.8*

1橙黃決明素ESI+330.8281.298

269.8

151.9*

2大黃酚ESI+254.9404.277

180.6

*定量離子。

注：1.本方法提供質(zhì)譜條件為推薦質(zhì)譜方法條件?？筛鶕?jù)實(shí)際情況，選擇響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)且無(wú)干擾的離子對(duì)進(jìn)

行檢測(cè)，質(zhì)譜參數(shù)亦可根據(jù)實(shí)際可達(dá)到最優(yōu)靈敏度的條件進(jìn)行設(shè)定。

2.如實(shí)際樣品中有檢出，通過(guò)保留時(shí)間及DAD光譜圖不能準(zhǔn)確定性，可以附錄C超高效液相色譜-三

重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證。

C.3定性判定