PAGEPAGE23《煙草及煙草制品游離氨基酸的測(cè)定離子色譜-積分脈沖安培法》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目試驗(yàn)報(bào)告山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司2012-03目錄1.立項(xiàng)背景························································4標(biāo)準(zhǔn)適用范圍····················································9原理····························································9實(shí)驗(yàn)方法························································9儀器設(shè)備·····················································94.2試劑和材料···················································94.3樣品前處理··················································104.4色譜條件····················································104.5標(biāo)準(zhǔn)曲線配制及制作··········································114.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制···········································4.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作···········································結(jié)果與討論·····················································135.1前處理······················································135.1.1萃取方式的選擇·········································5.1.2稱樣量的選擇···········································135.1.3萃取時(shí)間的優(yōu)化·········································135.2儀器條件的選擇··············································135.2.1固相萃取小柱選擇·······································5.2.2色譜柱溫度的優(yōu)化······································5.2.3進(jìn)樣量的選擇··········································155.3分析參數(shù)····················································155.3.1樣品測(cè)定結(jié)果···········································5.3.2檢測(cè)限·················································5.3.3方法的重復(fù)性試驗(yàn)·······································5.3.4樣品回收率··········································5.3.5與氨基酸分析法比對(duì)·····································5.3.6比對(duì)實(shí)驗(yàn)···············································6方法普適性······················································25參考文獻(xiàn)···························································261.立項(xiàng)背景氨基酸是煙草中主要的成分之一，它們與煙草的品質(zhì)密切相關(guān)。游離氨基酸是煙葉中的重要化學(xué)成分，也是煙草中的一類重要致香前體物質(zhì)，氨基酸的含量與煙草的品質(zhì)有著密切的關(guān)系，其含量的高低直接影響到煙的味道和煙氣的豐滿度[1、2]，在煙葉的烘烤、陳化、調(diào)制及抽吸過(guò)程中均會(huì)與煙葉中的還原糖發(fā)生梅拉德反應(yīng)而形成多種重要的致香成分，故煙葉中游離氨基酸種類的多少和含量的高低會(huì)直接影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)，由于氨基酸分析在煙草化學(xué)分析領(lǐng)域的研究中起著重要的作用，因此，對(duì)煙草中的氨基酸分析方法的研究與改進(jìn)得到人們高度重視。所以研究煙葉中氨基酸含量的測(cè)定方法及其應(yīng)用有著重要的理論和實(shí)踐意義。氨基酸分析是煙草化學(xué)研究中最重要的分析技術(shù)之一。1958年，Moore和Stein[3-5]等首先提出了用陽(yáng)離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)水解生成的氨基酸，實(shí)現(xiàn)了氨基酸分析的自動(dòng)化。其后，傳統(tǒng)氨基酸分析隨著衍生方法、柱載體化學(xué)、靈敏度和自動(dòng)化程度不斷提高。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越重視氨基酸分析方法的研究與改進(jìn)，柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法、毛細(xì)管電泳分析等相繼應(yīng)用于氨基酸分析，現(xiàn)在已是多種氨基酸分析方法并存、互補(bǔ)，使氨基酸分析的靈敏度、準(zhǔn)確度、分析速度直至儀器設(shè)備的自動(dòng)化程度均提高到了一個(gè)嶄新的水平，形成了具有廣泛適應(yīng)性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)。1、紙色譜和薄層色譜分析二十世紀(jì)40-50年代，紙色譜法分析氨基酸得到迅速發(fā)展，由于其具有操作簡(jiǎn)單、分離效能較高、所需儀器設(shè)備廉價(jià)、因而在當(dāng)時(shí)得到應(yīng)用廣泛。紙色譜法采用不同的層析液和檢測(cè)用顯色劑，可以對(duì)30多種氨基酸及其衍生物進(jìn)行分析[6-12]。Jean[13]在早期的煙草游離氨基酸定量分析方面做了大量且詳實(shí)的工作，他主要利用雙向紙層色譜對(duì)煙草游離氨基酸進(jìn)行分離并對(duì)其含量作了測(cè)定。薄層色譜(ThinLayerChromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固-液吸附色譜。薄層色譜是上個(gè)世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的分析方法。這個(gè)方法的特點(diǎn)是操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應(yīng)用于分離和測(cè)定氨基酸，可以對(duì)多達(dá)60多種氨基酸及其衍生物進(jìn)行分離分析[14-16]。薄層層析的分辨率一般比紙層析高10-100倍，既能分離幾十微克的樣品，也能用于分離制備大于500毫克的樣品。為了進(jìn)行定量分析也可使用濃硫酸、濃鹽酸一類的腐蝕性顯色劑顯色，因此薄層色譜分析比紙色譜的應(yīng)用更廣泛。隨著氨基酸分析的研究日漸活躍和分析儀器快速發(fā)展，以及復(fù)雜樣品對(duì)氨基酸分析的要求靈敏度高、分析時(shí)間短和重復(fù)性好等特點(diǎn)，紙色譜和薄層色譜分析氨基酸的應(yīng)用日漸減少。2、氣相色譜分析二十世紀(jì)五十年代和六十年代，隨著氣相色譜的發(fā)展與普及，氣相色譜用于氨基酸分析方面的研究開(kāi)始逐漸廣泛起來(lái)，由于氣相色譜分析是一種高效能、選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛的分析、分離方法，并且易于與質(zhì)譜聯(lián)用，確定氨基酸的結(jié)構(gòu)，從而有可能發(fā)現(xiàn)新的氨基酸，近年來(lái)，已在生化、醫(yī)藥、食品等方面得到廣泛的研究。但是氨基酸不易汽化，氣相色譜分析氨基酸首先要將氨基酸轉(zhuǎn)化為易于汽化的衍生物，然后選擇合適的柱子和檢測(cè)器進(jìn)行分離測(cè)定。氣相色譜(GC)用于測(cè)定衍生的氨基酸已有較長(zhǎng)時(shí)間[17]，目前對(duì)氨基酸比較好的氣相色譜衍生方法是將氨基酸衍生為N-三氟乙?；□18、19]、N-七氟丁酰基異丁酯[20、21]或特丁基二甲硅烷基衍生物[22、23]。Husek[24]報(bào)道了氣相色譜(GC)測(cè)定氯甲酸乙酯衍生的氨基酸，從樣品的衍生到樣品的分離測(cè)定在5min內(nèi)即可完成。GC/MS也是一種強(qiáng)有力的氨基酸分析方法，尤其是在分析氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體有特殊的作用[25]。雖然氣相色譜的毛細(xì)管柱有很高的分離效能和高靈敏度，但是由于氣相色譜將氨基酸衍生化的條件比較苛刻、專一性差，同時(shí)由于其它分析儀器的發(fā)展，致使氣相色譜在氨基酸實(shí)際分析測(cè)定的應(yīng)用中普及不是很廣。劉百戰(zhàn)[1]等用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定了23個(gè)品牌的國(guó)內(nèi)外卷煙中的游離氨基酸。杜啟云[26]等利用山梨醇作內(nèi)標(biāo)采用毛細(xì)管氣相色譜法檢測(cè)了國(guó)內(nèi)外21種牌號(hào)卷煙的天門氨酸和脯氨酸。Ali[27]采用GC-SIM-MS成功分析了煙草制品中氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體L-氨基酸和D-氨基酸。3、高效液相色譜分析二十世紀(jì)80年代以來(lái)，HPLC測(cè)定氨基酸的研究日漸活躍，特別是最近二十年來(lái)柱前衍生高效液相色譜法分析氨基酸是迅速發(fā)展起來(lái)的一種分離分析技術(shù)，高效液相色譜與各種氨基酸衍生方法相結(jié)合的分析技術(shù)發(fā)展迅速，并逐漸顯示出特有的優(yōu)越性，具有分析速度快，準(zhǔn)確性好、靈敏度高、分析時(shí)間短、適用性極廣等優(yōu)點(diǎn)[28]，為氨基酸分析提供了廣闊前景。HPLC要求將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適于反相色譜分離并能被靈敏檢測(cè)的衍生物。柱前衍生的關(guān)鍵在于衍生試劑的選擇，選擇衍生試劑的標(biāo)準(zhǔn)是能與各氨基酸定量反應(yīng)，每種氨基酸只生成一種化合物且產(chǎn)物有一定的穩(wěn)定性，不產(chǎn)生或易于排除干擾物；操作簡(jiǎn)單，色譜分離分辨率高，檢測(cè)靈敏度高，分析時(shí)間短，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和使產(chǎn)物能在不同型號(hào)的高效液相色譜儀上測(cè)定。目前已有大量關(guān)于氨基酸衍生方法研究方面報(bào)道，具有代表性的氨基酸分析用的柱前衍生試劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)[29-33]、異硫氰酸苯酯(PITC)[34-41],氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)[42-47]及二甲氨基萘磺酰氯(Dansyl-Cl)[48、49]、2，4-二硝基氟苯（DNFB）[50、51]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）[52-54]、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）[55-57]等。這些衍生試劑的主要特點(diǎn)見(jiàn)表1：表1柱前氨基酸衍生試劑的特點(diǎn)衍生試劑參數(shù)OPAPITCFMOC-ClDansyl-ClAQCDNFBDabsyl-Cl衍生物穩(wěn)定性不穩(wěn)定穩(wěn)定穩(wěn)定穩(wěn)定很穩(wěn)定穩(wěn)定很穩(wěn)定靈敏度（mol）10-1510-1210-1510-1210-1510-1210-12是否與二級(jí)氨基酸反應(yīng)否是是是是是是衍生操作很簡(jiǎn)單復(fù)雜簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜簡(jiǎn)單檢測(cè)方法熒光紫外紫外/熒光紫外/熒光紫外/熒光紫外紫外/熒光是否受衍生劑干擾否是是是是是是氨基酸的柱前衍生HPLC分析技術(shù)以其特有的優(yōu)勢(shì)-靈敏度高、分析時(shí)間短和重復(fù)性好等，為人們?cè)絹?lái)越重視。實(shí)際工作中，具體用何種方法應(yīng)根據(jù)衍生速度與簡(jiǎn)便程度、分析速度、檢測(cè)二級(jí)氨基酸與胱氨酸能力、干擾因素、靈敏度和重復(fù)性等指標(biāo)做出選擇。目前高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于煙草樣品中氨基酸含量檢測(cè)。謝復(fù)煒[58]等采用一種自動(dòng)柱前衍生化的高效液相色譜法OPA，利用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定了煙草中的十八種游離氨基酸含量，最小檢測(cè)量達(dá)到150fmol。李丹[59、60]等利用柱前衍生高效液相色譜法系統(tǒng)研究了不同等級(jí)煙葉中的游離氨基酸。張鼎方[61]、王蕾[62]、王文領(lǐng)[63]分別利用柱前衍生高效液相色譜法探索卷煙加工關(guān)鍵工序煙草游離氨基酸的變化規(guī)律，為卷煙配方和加工工藝參數(shù)的優(yōu)化提供理論依據(jù)。4、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-IPAD)是一種無(wú)需柱前和柱后衍生的氨基酸直接分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在強(qiáng)堿性介質(zhì)中可以形成陰離子，而氨基酸分子中的氨基在強(qiáng)堿性介質(zhì)中通過(guò)施加一定的電位，可在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)氨基酸的陰離子交換色譜分離和積分脈沖安培檢測(cè)。1983年，Polta和Johnson[64]首先提出了用陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法分析氨基酸。其后，Welch等[65]對(duì)脈沖安培檢測(cè)氨基酸和積分脈沖安培檢測(cè)氨基酸進(jìn)行了比較研究，提出了檢測(cè)氨基酸的積分脈沖安培檢測(cè)波形。以上研究工作雖然實(shí)現(xiàn)了氨基酸的直接分離檢測(cè)，但由于存在基線漂移、線性、重現(xiàn)性差、電極損耗大以及無(wú)高效陰離子色譜柱分離氨基酸等問(wèn)題，因此未能使氨基酸的分析達(dá)到可應(yīng)用程度。1999年，Clarke等[66]發(fā)展了一種積分脈沖安培檢測(cè)氨基酸的優(yōu)化波形，采用高效陰離子交換柱，成功地實(shí)現(xiàn)了氨基酸的高效陰離子交換色譜分離和積分脈沖安培檢測(cè)，該脈沖安培檢測(cè)方法具有高靈敏性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。但用積分脈沖安培法檢測(cè)氨基酸時(shí)，存在金工作電極易被污染需要經(jīng)常清洗的問(wèn)題，為克服金電極的污染的缺點(diǎn)，2003年，Cheng和Jandik等[67]研制了“可拋棄”金電極，用此電極分析氨基酸，除了無(wú)須經(jīng)常清洗電極之外，還保證了結(jié)果與普通金電極一致。HPAEC-IPAD分析氨基酸不需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化處理，可直接進(jìn)行分離、檢測(cè)，對(duì)氨基酸的檢出限為pmol級(jí)。由于糖類化合物(含有多羥基)在強(qiáng)堿性介質(zhì)中可以形成陰離子并可用脈沖安培法檢測(cè)，因此，用HPAEC-IPAD亦可分析糖類化合物、氨基糖和糖酸等。梁立娜[68]利用離線除糖的方法，去除煙葉和煙草料液中大量干擾糖類，建立了高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPAEC-IPAD)直接檢測(cè)煙葉和煙草料液中氨基酸的方法，回收率可達(dá)76％～105％。牟世芬[69]發(fā)展了一種簡(jiǎn)單可靠的一次進(jìn)樣同時(shí)分析17種氨基酸和一些糖類的高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法，進(jìn)一步拓展該法的應(yīng)用。5、毛細(xì)管電泳分析毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)，它迅速發(fā)展于20世紀(jì)80年代中后期。具有高效、快速、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，有許多關(guān)于毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)分析氨基酸的報(bào)道[70-72]。兩種CE模式用于氨基酸的分析。一種是毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)，另一種是膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)。與HPLC相比，CE的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高，無(wú)須梯度洗脫，分析速度快，溶劑消耗少。然而，CE分析的重現(xiàn)性較差。Smith[73、74]和Poinsot[75、76]分別綜述了毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)分析氨基酸的最近十年的進(jìn)展，綜述了CE與紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜等檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用分析實(shí)際樣品中的氨基酸。Carlos和Charles[77]以微芯片毛細(xì)管電泳結(jié)合脈沖安培檢測(cè)器，方法無(wú)需衍生化，分離緩沖液采用Na2B4O7(pH=9.45)，在不到45s的時(shí)間內(nèi)成功分離了三種氨基酸。目前，關(guān)于CE分析氨基酸主要集中在膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)，但是膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)由于在流動(dòng)相中使用了難揮發(fā)的表面活性劑致使其與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用存在很大問(wèn)題。最近，CE-MS聯(lián)用技術(shù)在氨基酸分析方面得到了越來(lái)越多關(guān)注[78-80]。Soga和Heiger[81]運(yùn)用CE-MS聯(lián)用技術(shù)直接分析檢測(cè)了氨基酸，檢測(cè)結(jié)果雖然比熒光檢測(cè)技術(shù)的靈敏度差，但是比紫外可見(jiàn)檢測(cè)技術(shù)靈敏100倍。何友昭[82]等采用毛細(xì)管區(qū)域電泳與紫外聯(lián)用技術(shù)以氨基苯磺酸作為背景電解質(zhì)快速分析了煙葉中的氨基酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明此法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于煙葉中游離氨基酸的測(cè)定。6、小結(jié)由于氨基酸分析在生命科學(xué)、食品科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要作用，因此，對(duì)氨基酸分析方法的研究與改進(jìn)將會(huì)繼續(xù)得到人們高度重視。目前，國(guó)內(nèi)外已研究過(guò)的氨基酸分析方法包括茚三酮比色法、紙色譜和薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法和毛細(xì)管電泳等方法。柱后茚三酮衍生高效陽(yáng)離子交換色譜法是一種已成熟的經(jīng)典氨基酸分析方法，此方法未來(lái)的發(fā)展將主要集中在儀器的柱系統(tǒng)及儀器的自動(dòng)化方面。柱前衍生反相高效液相色譜法是研究比較多的一種氨基酸分析方法，此方法未來(lái)的發(fā)展將主要集中在選擇高穩(wěn)定、高靈敏的衍生試劑，使該方法更趨靈敏、可靠。無(wú)需柱前、柱后衍生的高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法是一種新的氨基酸分析方法，此方法簡(jiǎn)單、靈敏，在氨基酸分析中將會(huì)得到越來(lái)越重要發(fā)展，新型高效陰離子交換柱和穩(wěn)定、可靠的積分脈沖安培檢測(cè)器的研制以及分離、檢測(cè)機(jī)理的研究，將是此方法未來(lái)研究的重點(diǎn)。CE今后發(fā)展方向仍是繼續(xù)提高分辨率、速度和檢測(cè)器的選擇性，將CE與質(zhì)譜儀更好的結(jié)合，可對(duì)生物分子特性做出更快、更準(zhǔn)確的分析，以進(jìn)一步拓寬CE在氨基酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)將在氨基酸及其對(duì)映體分析方面起重要作用，高效液相色譜/質(zhì)譜(HPLC/MS)和毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜(CE/MS)分析氨基酸將得到大的發(fā)展。隨著氨基酸分析技術(shù)在其他領(lǐng)域的迅速發(fā)展和應(yīng)用，也必將推動(dòng)該技術(shù)在煙草化學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展和應(yīng)用。目前柱前衍生反相高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于煙草和其它樣品中氨基酸含量檢測(cè)。隨著高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法，毛細(xì)管電泳方法的進(jìn)一步完善，儀器的進(jìn)一步發(fā)展和完善，這兩種方法將在煙草中的氨基酸分析發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。2.標(biāo)準(zhǔn)適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了煙草及煙草制品中游離氨基酸測(cè)定離子色譜-積分脈沖安培法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于煙草及煙草制品中精氨酸、賴氨酸、色氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、酪氨酸等18種常見(jiàn)游離氨基酸的測(cè)定。3.原理用鹽酸溶液萃取煙草或煙草制品中的游離氨基酸，萃取液經(jīng)陽(yáng)離子固相萃取小柱純化，通過(guò)離子色譜-積分脈沖安培法測(cè)定，外標(biāo)法定量。4.實(shí)驗(yàn)方法4.1儀器設(shè)備——分析天平（METTLETOLEDOXP205），感量0.1mg——ICS3000多功能離子色譜儀（美國(guó)Dionex公司），配備電化學(xué)檢測(cè)器推薦色譜柱：AminoPacPA10陰離子交換柱，包括分析柱(250mm×2mm)和保護(hù)柱(50mm×2mm)——水相濾膜：0.22μm——Milli-Q?型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）——臺(tái)式ZP-200振蕩器（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）——3K15離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）——N-EVAP-112氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）4.2試劑和材料——除特殊要求外均使用優(yōu)級(jí)純?cè)噭?，電阻?8.2MΩ·cm的超純水——18種氨基酸標(biāo)樣（>99%,生化試劑，Sigma公司）——無(wú)水醋酸鈉（>99.9%,Dionex公司）——?dú)溲趸c（優(yōu)級(jí)純，上海國(guó)藥集團(tuán)）——28-30%氨水（Merck公司）——37%HCl（Merck公司）——4mL500mgSCX固相萃取小柱（Alltech公司）4.3樣品前處理稱取1.0g試樣，精確至0.1mg，置于100mL磨口錐形瓶中，準(zhǔn)確加入40mL0.1mol/L鹽酸萃取溶液，具塞后置于振蕩器振蕩30min（轉(zhuǎn)速：150r/min），將萃取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取濾液2mL，再準(zhǔn)確加入8%磺基水楊酸溶液2mL，混合均勻，離心30min，過(guò)陽(yáng)離子固相萃取小柱純化萃取溶液。4.4色譜條件——流動(dòng)相A：超純水——流動(dòng)相B：250mmol/LNaOH——流動(dòng)相C：1mol/LNaAc——柱溫：32——流速：0.25mL/min——進(jìn)樣體積：25μL——總分析時(shí)間：75min——檢測(cè)器為電化學(xué)檢測(cè)器：積分安培檢測(cè)電化學(xué)波形見(jiàn)表1表1檢測(cè)氨基酸的積分安培檢測(cè)電化學(xué)波形時(shí)間（s）電位（V）vs.pH-Ag/AgCl參比電極積分（開(kāi)始、結(jié)束）0.00+0.130.04+0.130.05+0.330.21+0.33開(kāi)始0.22+0.600.46+0.600.47+0.330.56+0.33結(jié)束0.57-1.670.58-1.670.59+0.930.60+0.13梯度洗脫步驟見(jiàn)表2表2離子色譜梯度洗脫步驟時(shí)間(min)A%B%C%0.0762402.0762408.06436011.06436018.040204021.044164023.014167042.014167042.12080044.12080044.27624075762404.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制及制作4.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2.5μmol/mL)：稱取0.0333g天冬氨酸、0.0298g蘇氨酸、0.0263g絲氨酸、0.0368g谷氨酸、0.0188g甘氨酸、0.0223g丙氨酸、0.0293g纈氨酸、0.0601g胱氨酸、0.0373g甲硫氨酸、0.0328g異亮氨酸、0.0328g亮氨酸、0.0453g酪氨酸、0.0413g苯丙氨酸、0.0388g組氨酸、0.0511g色氨酸、0.0365g賴氨酸、0.0436g精氨酸、0.0288g脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1mg，0.1mol/L鹽酸萃取溶液溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，即配制成2.5μmol/mL儲(chǔ)備液。于4℃冰箱中避光保存，有效期為18種氨基酸工作溶液：將2.5μmol/mL18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用萃取溶劑逐級(jí)稀釋得到濃度為4、20、50、125、250、2500（nmol/mL）的工作溶液。4.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用離子色譜-積分脈沖安培法測(cè)定一系列18種氨基酸工作溶液，得到6個(gè)濃度水平的18種氨基酸的積分峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，納摩爾每毫升（nmol/mL）計(jì)的18種氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)(X)建立校正曲線。對(duì)校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不小于0.99。測(cè)定18種氨基酸的濃度，計(jì)算每一個(gè)樣品中18種氨基酸的含量，單位為毫克每克（mg/g）。本實(shí)驗(yàn)建立的18種氨基酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。表318種氨基酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)名稱線性回歸方程相關(guān)系數(shù)精氨酸(Arg)Y=0.4362X+6.38760.996賴氨酸(Lys)Y=0.4021X+2.84320.992丙氨酸(Ala)Y=0.2796X+1.2850.997蘇氨酸(Thr)Y=0.5545X+2.58210.997甘氨酸(Gly)Y=0.3054X+0.71610.996纈氨酸(Val)Y=0.268X+0.76370.998絲氨酸(Ser)Y=0.5772X+3.13380.997脯氨酸(Pro)Y=0.4498X+1.570.998異亮氨酸(Ile)Y=0.2599X+1.71260.995亮氨酸(Leu)Y=0.2327X+1.0340.997蛋氨酸(Met)Y=0.6406X+1.87960.996組氨酸(His)Y=0.5488X+9.66710.991苯丙氨酸(Phe)Y=0.511X+2.23310.996谷氨酸(Glu)Y=0.0688X+0.34760.994天冬氨酸(Asp)Y=0.1147X+0.78660.995胱氨酸(Cys)Y=0.4791X+4.50960.991酪氨酸(Tyr)Y=0.5335X+2.83360.996色氨酸(Trp)Y=1.0819X+6.19930.9955結(jié)果與討論5.1萃取溶劑的選擇大部分氨基酸溶于水，少數(shù)幾種水溶性不好的氨基酸，可用稀鹽酸溶液振搖溶解。因此選擇稀鹽酸溶液作為氨基酸的萃取液，分別選用0.01mol/LHCl溶液、0.02mol/LHCl溶液、0.04mol/LHCl溶液、0.06mol/LHCl溶液、0.08mol/LHCl溶液、0.10mol/LHCl溶液、0.12mol/LHCl溶液、0.1mol/L的HCl-乙醇（30：70，V/V）溶液，結(jié)果表明：0.1mol/L的HCl-乙醇（30：70，V/V）萃取溶液因其含有乙醇，乙醇在電化學(xué)檢測(cè)器上有響應(yīng)，干擾氨基酸的定量檢測(cè)；低濃度HCl溶液萃取樣品中游離氨基酸的效率較低，易造成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)損失，萃取不完全（結(jié)果見(jiàn)圖1），當(dāng)HCl溶液濃度高于0.06mol/L時(shí)，萃取煙草和煙草樣品中游離氨基酸的穩(wěn)定性和萃取效率均好，從萃取效率和穩(wěn)定性最佳角度考慮，本項(xiàng)目選擇0.10mol/LHCl溶液作為萃取溶劑。圖1：不同鹽酸濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響5.2萃取時(shí)間的優(yōu)化圖2：不同萃取時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響為選擇合適的萃取時(shí)間，準(zhǔn)確稱取1g樣品各5份，于25℃下分別振蕩萃取10、20、30、40、50min，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，20min后萃取時(shí)間對(duì)萃取的效率影響不大，考慮樣品具有差異性，選擇30min為合適的萃取時(shí)間。5.3色譜柱溫度的優(yōu)化隨著溫度的升高，纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸保留時(shí)間增長(zhǎng)，在較低溫度下絲氨酸與脯氨酸不能完全分離，在較高溫度下，亮氨酸與蛋氨酸不能完全分離，絲氨酸與脯氨酸的分離效果以及亮氨酸與蛋氨酸的分離效果在32℃最佳，其他氨基酸的保留時(shí)間受溫度影響不大。為了得到最佳的分離效果，本實(shí)驗(yàn)采用的色譜柱溫度是32℃，不同柱溫下18種游離氨基酸溶液的分離色譜圖見(jiàn)圖3。圖3：不同柱溫下18種游離氨基酸溶液的色譜圖1.精氨酸（Arg）；2.賴氨酸(Lys);3.丙氨酸(Ala);4.蘇氨酸(Thr);5.甘氨酸(Gly);6.纈氨酸(Val);7.絲氨酸(Ser);8.脯氨酸（Pro);9.異亮氨酸(Ile);10.亮氨酸(Leu);11.蛋氨酸(Met);12.組氨酸(His);13.苯丙氨酸(Phe);14.谷氨酸(Glu);15.天冬氨酸(Asp);16.胱氨酸(Cys);17.酪氨酸(Tyr);18.色氨酸（Trp）5.4固相萃取小柱選擇由于煙葉中含有大量的糖類和色素等干擾物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)在電化學(xué)檢測(cè)器上有響應(yīng)，干擾煙葉中游離氨基酸定量分析，本研究采用商品化固相萃取小柱離線除去煙葉中的糖類和色素等干擾物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)氨基酸準(zhǔn)確定量分析。分別選取SCX、PCX、MCX三種陽(yáng)離子固相萃取小柱，對(duì)比了固相萃取小柱去除樣品萃取液中糖類和色素等干擾物質(zhì)的效果。三種固相萃取小柱純化樣品提取液中游離氨基酸步驟：（1）活化柱子：依次3mL甲醇、3mL超純水分別活化固相萃取小柱（2）上樣：1mL樣品提取液通過(guò)活化的柱子，由于在酸性溶液中（pH<2.6）,所有的氨基酸帶正電荷而被陽(yáng)離子交換小柱吸附，干擾物質(zhì)流過(guò)固相萃取小柱被去除。（3）淋洗：1mL0.01mol/LHCl淋洗固相萃取小柱，除去殘留在柱子上的干擾物質(zhì)。（4）洗脫：3mL3mol/L氨水洗脫吸附在固相萃取小柱上的氨基酸，將氨基酸從固相萃取小柱洗脫下來(lái)。洗脫液在65℃水浴和氮?dú)夥諊麓蹈桑瑴?zhǔn)確移取1mL0.1mol/L的HCl溶液溶解，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用MCX固相萃取小柱，易造成纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)損失；采用PCX固相萃取小柱，易造成精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、胱氨酸(Cys)損失；采用SCX固相萃取小柱，易造成胱氨酸(Cys)部分損失，但其回收率仍達(dá)到80%，結(jié)果見(jiàn)表4.1。因此選用SCX固相萃取小柱除去煙葉中的糖類和色素等干擾物質(zhì)。表4.1不同固相萃取小柱對(duì)回收率的影響名稱SCX固相萃取小柱回收率（%）PCX固相萃取小住回收率（%）MCX固相萃取小柱回收率（%）精氨酸(Arg)81.2370.10110.24賴氨酸(Lys)95.13109.35108.26丙氨酸(Ala)101.12111.8198.34蘇氨酸(Thr)94.38103.2693.42甘氨酸(Gly)96.5990.8393.45纈氨酸(Val)97.2990.3878.46絲氨酸(Ser)99.3798.3690.12脯氨酸(Pro)89.35109.8386.89異亮氨酸(Ile)90.6989.7489.41亮氨酸(Leu)87.9686.5385.21蛋氨酸(Met)98.4985.0585.01組氨酸(His)100.1968.34108.72苯丙氨酸(Phe)101.46113.21114.12谷氨酸(Glu)99.9397.3495.69天冬氨酸(Asp)101.3093.7689.74胱氨酸(Cys)80.0063.2382.83酪氨酸(Tyr)105.7898.4582.13色氨酸(Trp)106.5491.4692.14為了進(jìn)一步提高精氨酸和胱氨酸的回收率，進(jìn)一步優(yōu)化了SCX固相萃取小柱的純化樣品提取液中游離氨基酸淋洗步驟：①1mL樣品萃取液上樣，0.3mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫；②1mL樣品萃取液上樣，0.5mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫；③1mL樣品萃取液上樣，0.7mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫；④1mL樣品萃取液上樣，1mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫；⑤1mL樣品萃取液上樣，1.2mL超純水淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫，對(duì)比以上5種不同體積的0.01mol/LHCl淋洗液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)淋洗體積大于0.5mL時(shí)，隨著淋洗體積的增加，精氨酸和胱氨酸的回收率降低，而其他氨基酸的回收率變化不明顯，綜合考慮殘留在萃取小柱上的干擾物質(zhì)以及精氨酸和胱氨酸的回收率，選擇0.01mol/LHCl淋洗液體積為0.5mL，此時(shí)精氨酸和胱氨酸的回收率分別為90.12%和88.52%,結(jié)果見(jiàn)表4.2。表4.2SCX固相萃取小柱的回收率名稱SCX固相萃取小柱回收率（%）精氨酸(Arg)90.12賴氨酸(Lys)93.26丙氨酸(Ala)105.51蘇氨酸(Thr)91.79甘氨酸(Gly)92.92纈氨酸(Val)91.34絲氨酸(Ser)95.52脯氨酸(Pro)90.24異亮氨酸(Ile)94.62亮氨酸(Leu)90.51蛋氨酸(Met)92.81組氨酸(His)106.03苯丙氨酸(Phe)96.83谷氨酸(Glu)94.73天冬氨酸(Asp)104.26胱氨酸(Cys)88.52酪氨酸(Tyr)95.43色氨酸(Trp)100.135.5測(cè)定結(jié)果的計(jì)算通過(guò)本文論述的方法測(cè)定煙草或煙草制品中18種游離氨基酸的濃度，然后通過(guò)式（1）計(jì)算18種游離氨基酸的含量，結(jié)果以毫克每克（mg/g）表示：………….（1）式中：Xi—樣品中氨基酸的含量，單位為毫克每克（mg/g）Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的氨基酸濃度，單位為微摩爾每毫升（μmol/mL）Mi—氨基酸分子量，單位為克每摩爾（g/mol）V—萃取溶液的體積（mL）k—稀釋倍數(shù)m—樣品質(zhì)量，單位為克（g）w—樣品水分百分含量取兩次平行測(cè)定結(jié)果的平均值為最終測(cè)試結(jié)果，精確至0.001mg/g。平行測(cè)定結(jié)果其相對(duì)平均偏差應(yīng)小于10%。5.6檢測(cè)限本實(shí)驗(yàn)測(cè)定檢測(cè)限的方法為：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低濃度連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣10次，將10次測(cè)定的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出濃度值，再計(jì)算10次測(cè)定濃度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），分別以3SD和10SD計(jì)算得到的值為本方法的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表5。表5檢出限和定量限結(jié)果化合物檢出限（ng/mL）定量限（ng/mL）精氨酸(Arg)3.26410.880賴氨酸(Lys)3.72512.417丙氨酸(Ala)7.24224.140蘇氨酸(Thr)6.16420.547甘氨酸(Gly)4.85216.173纈氨酸(Val)27.01290.040絲氨酸(Ser)6.85122.837脯氨酸(Pro)24.93883.127異亮氨酸(Ile)32.989109.963亮氨酸(Leu)39.958133.193蛋氨酸(Met)20.43168.103組氨酸(His)3.93813.127苯丙氨酸(Phe)6.53821.793谷氨酸(Glu)15.11650.387天冬氨酸(Asp)9.02430.080胱氨酸(Cys)11.83639.453酪氨酸(Tyr)12.11840.393色氨酸(Trp)8.98929.9635.7方法的重復(fù)性試驗(yàn)為考察方法的重復(fù)性，我們選擇了一個(gè)煙草樣品，按照確定的前處理方法，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如下表6.1，除了精氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、胱氨酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較高外（最高達(dá)到6.64%），其他氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)，表明該方法的日內(nèi)重復(fù)性較好。日間重復(fù)測(cè)定5次，得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如下表6.2，除了精氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、胱氨酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較高外（最高達(dá)到7.39%），其他氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)，表明該方法的日間重復(fù)性較好。表6.1方法的重現(xiàn)性（日內(nèi)）名稱第一次第二次第三次第四次第五次第六次相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，％）精氨酸(Arg)0.4690.5230.4910.5520.4840.5436.64賴氨酸(Lys)0.3920.3860.4090.4250.4250.3824.78丙氨酸(Ala)0.9860.9750.9920.9940.9761.0241.81蘇氨酸(Thr)0.2840.2750.2680.2730.2830.2593.44甘氨酸(Gly)0.1740.1810.1690.1780.1630.1814.13纈氨酸(Val)0.2030.1920.1980.2120.2050.2063.41絲氨酸(Ser)0.4920.5040.4820.5190.4960.5142.78脯氨酸(Pro)2.9122.9352.8542.7682.9322.9532.41異亮氨酸(Ile)0.0760.0780.0750.0810.0690.0795.48亮氨酸(Leu)0.1690.1720.1750.1820.1690.1782.98蛋氨酸(Met)0.0580.0610.0590.0550.0560.0525.61組氨酸(His)0.8930.9020.9420.9210.9530.9462.68苯丙氨酸(Phe)1.4891.4761.5341.5191.4831.5932.90谷氨酸(Glu)0.0570.0610.0540.0570.0520.0565.45天冬氨酸(Asp)2.5852.6292.5912.7082.4982.7013.02胱氨酸(Cys)0.3240.3380.3610.3320.3660.3195.71酪氨酸(Tyr)0.2340.2230.2390.2160.2310.2253.64色氨酸(Trp)0.9620.9080.9160.9280.9590.8923.03表6.2方法的重現(xiàn)性（日間）名稱第一天第二天第三天第四天第五天相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，％）精氨酸(Arg)0.4690.5420.4970.5520.4787.39賴氨酸(Lys)0.3920.3730.4020.4140.3694.89丙氨酸(Ala)0.9861.0691.0241.0120.9783.56蘇氨酸(Thr)0.2840.3010.2840.2660.2754.60甘氨酸(Gly)0.1740.1690.1860.1720.1615.26纈氨酸(Val)0.2030.1940.1820.2010.2064.86絲氨酸(Ser)0.4920.4650.4980.4680.4593.66脯氨酸(Pro)2.9122.7862.6842.7732.8052.92異亮氨酸(Ile)0.0760.0690.0740.0670.0715.11亮氨酸(Leu)0.1690.1580.1670.1720.1794.53蛋氨酸(Met)0.0580.0620.0650.0590.0676.16組氨酸(His)0.8930.8620.8860.9010.9162.24苯丙氨酸(Phe)1.4891.3961.4081.5231.4743.72谷氨酸(Glu)0.0570.0620.0530.0570.0595.71天冬氨酸(Asp)2.5852.6872.6382.7122.5792.25胱氨酸(Cys)0.3240.3040.3130.3150.3495.36酪氨酸(Tyr)0.2340.2130.2290.210.2314.95色氨酸(Trp)0.9620.9710.9490.9030.9183.095.8樣品回收率采用標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)樣品進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)后，按照方法前處理步驟處理樣品，最后根據(jù)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)計(jì)算其加標(biāo)回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，加標(biāo)回收率在80.12~115.61%之間，滿足定量分析要求。表7方法的回收率名稱未加標(biāo)含量(mg/g)加標(biāo)濃度(mg/g)測(cè)定值(mg/g)回收率（％）精氨酸(Arg)0.116低標(biāo)0.0600.16988.73中標(biāo)0.1200.22490.12高標(biāo)0.1800.27990.08賴氨酸(Lys)0.996低標(biāo)0.0501.04394.06中標(biāo)0.1001.08993.26高標(biāo)0.1501.151103.21丙氨酸(Ala)0.369低標(biāo)0.1900.54592.86中標(biāo)0.3800.770105.51高標(biāo)0.5700.90193.25蘇氨酸(Thr)0.072低標(biāo)0.0300.10196.25中標(biāo)0.0600.12791.79高標(biāo)0.0900.15997.18甘氨酸(Gly)0.032低標(biāo)0.0150.04799.36中標(biāo)0.0300.06092.92高標(biāo)0.0450.078103.05纈氨酸(Val)0.135低標(biāo)0.0650.19389.35中標(biāo)0.1300.25491.34高標(biāo)0.1950.31290.69絲氨酸(Ser)0.374低標(biāo)0.1900.54790.98中標(biāo)0.3800.73795.52高標(biāo)0.5700.89491.18脯氨酸(Pro)5.096低標(biāo)2.6007.54894.32中標(biāo)5.2009.78890.24高標(biāo)6.20011.361101.05異亮氨酸(Ile)0.092低標(biāo)0.0400.135108.74中標(biāo)0.0800.16894.62高標(biāo)0.1200.20493.26亮氨酸(Leu)0.031低標(biāo)0.0150.04594.37中標(biāo)0.0300.05890.51103.15高標(biāo)0.0450.077蛋氨酸(Met)0.548低標(biāo)0.2700.841108.65中標(biāo)0.5401.04992.81高標(biāo)0.8101.439110.03組氨酸(His)0.198低標(biāo)0.1000.29495.64中標(biāo)0.2000.410106.03高標(biāo)0.3000.508103.27苯丙氨酸(Phe)0.196低標(biāo)0.1000.28790.98中標(biāo)0.2000.39096.83高標(biāo)0.3000.46991.03谷氨酸(Glu)0.204低標(biāo)0.1000.29692.35中標(biāo)0.2000.39394.73高標(biāo)0.3000.47991.75天冬氨酸(Asp)0.308低標(biāo)0.1600.45289.78中標(biāo)0.3200.642104.26高標(biāo)0.4800.75793.56胱氨酸(Cys)1.286低標(biāo)0.6501.87089.86中標(biāo)1.3002.43788.52高標(biāo)1.9503.06191.02酪氨酸(Tyr)0.217低標(biāo)0.1100.32598.04中標(biāo)0.2200.42795.43高標(biāo)0.3300.53295.36色氨酸(Trp)0.191低標(biāo)0.0900.27087.95中標(biāo)0.1800.371100.13高標(biāo)0.2700.44694.465.9與氨基酸分析儀法的比對(duì)本項(xiàng)目測(cè)定方法與氨基酸分析儀法對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)離子色譜-積分脈沖安培法測(cè)定氨基酸比氨基酸分析儀法靈敏10倍以上，兩種方法檢出限見(jiàn)表8.表8兩種方法檢出限結(jié)果名稱離子色譜-積分脈沖安培法檢出限（ng/ml）氨基酸分析儀方法檢出限（ng/ml）精氨酸(Arg)3.26447.060賴氨酸(Lys)3.72538.056丙氨酸(Ala)7.24280.194蘇氨酸(Thr)6.16473.900甘氨酸(Gly)4.85267.583纈氨酸(Val)27.012287.786絲氨酸(Ser)6.85188.311脯氨酸(Pro)24.938257.956異亮氨酸(Ile)32.989351.495亮氨酸(Leu)39.958395.601蛋氨酸(Met)20.431223.937組氨酸(His)3.93838.903苯丙氨酸(Phe)6.53867.784谷氨酸(Glu)15.116147.357天冬氨酸(Asp)9.02491.737胱氨酸(Cys)11.836134.650酪氨酸(Tyr)12.118145.015色氨酸(Trp)8.989118.645采用離子色譜-積分脈沖安培法與氨基酸分析儀法分別分析同一樣品中18種游離氨基酸，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。兩種方法檢測(cè)的數(shù)據(jù)除了異亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的數(shù)據(jù)有10%左右的差異外，其他檢測(cè)數(shù)據(jù)差異性不大?？紤]到實(shí)際樣品中基質(zhì)干擾成分嚴(yán)重存在，采用固相萃取小柱純化樣品可以有效避免干擾成分影響，實(shí)現(xiàn)氨基酸準(zhǔn)確定量分析，提高儀器的使用壽命。本實(shí)驗(yàn)建立的方法比氨基酸分析儀法具有更高的靈敏度，因而更適合于煙草及煙草制品中游離氨基酸的測(cè)定。表9兩種方法檢測(cè)同一樣品結(jié)果名稱離子色譜-積分脈沖安培法測(cè)定值（mg/g）氨基酸分析儀方法測(cè)定值（mg/g）精氨酸(Arg)0.4690.501賴氨酸(Lys)0.3920.418丙氨酸(Ala)0.9860.997蘇氨酸(Thr)0.2840.296甘氨酸(Gly)0.1740.165纈氨酸(Val)0.2030.216絲氨酸(Ser)0.4920.514脯氨酸(Pro)2.9123.106異亮氨酸(Ile)0.0760.068亮氨酸(Leu)0.1690.179蛋氨酸(Met)0.0580.064組氨酸(His)0.8930.912苯丙氨酸(Phe)1.4891.386谷氨酸(Glu)0.0570.051天冬氨酸(Asp)2.5852.634胱氨酸(Cys)0.3240.341酪氨酸(Tyr)0.4690.501色氨酸(Trp)0.3920.4185.10該方法在對(duì)烤煙、香料煙和白肋煙中的應(yīng)用研究前期的文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道白肋煙游離氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于烤煙和香料煙游離氨基酸的含量，為了驗(yàn)證該方法對(duì)不同類型煙葉的適應(yīng)性，采用該方法測(cè)定了烤煙、香料煙和白肋煙不同類型煙葉中游離氨基酸的含量。發(fā)現(xiàn)白肋煙中游離氨基酸的總量高于烤煙和香料煙中游離氨基酸的總量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)白肋煙中大部分游離氨基酸的含量高于烤煙中游離氨基酸的含量，尤其白肋煙中天冬氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于是烤煙的含量，為了進(jìn)一步提高白肋煙中游離氨基酸含量的準(zhǔn)確性，白肋煙前處理方法：稱取0.25g試樣，精確至0.1mg，置于100mL磨口錐形瓶中，準(zhǔn)確加入40mL0.1mol/L鹽酸萃取溶液，具塞后置于振蕩器振蕩30min（轉(zhuǎn)速：150r/min），將萃取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取濾液2mL，再準(zhǔn)確加入8%磺基水楊酸溶液2mL，混合均勻，離心30min，過(guò)陽(yáng)離子固相萃取小柱純化萃取溶液。發(fā)現(xiàn)采用該處理方法對(duì)白肋煙中含量低的脯氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、胱氨酸表10.1對(duì)比兩種方法的檢測(cè)白肋煙氨基酸含量的回收率方法稱取0.25g試樣，準(zhǔn)確加入40mL0.1mol/L鹽酸萃取溶液，具塞后置于振蕩器振蕩30min，將萃取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取濾液2mL，再準(zhǔn)確加入8%磺基水楊酸溶液2mL，混合均勻，離心30min，過(guò)陽(yáng)離子固相萃取小柱純化萃取溶液，其步驟如下：1mL樣品萃取液上樣，0.5mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫。該方法1回收率稱取1.0g試樣，準(zhǔn)確加入40mL0.1mol/L鹽酸萃取溶液，具塞后置于振蕩器振蕩30min，將萃取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取濾液2mL，再準(zhǔn)確加入8%磺基水楊酸溶液2mL，混合均勻，離心30min，過(guò)陽(yáng)離子固相萃取小柱純化萃取溶液，其步驟如下：1mL樣品萃取液上樣，0.5mL0.01mol/LHCl淋洗，3mL3mol/L氨水洗脫。該方法2回收率精氨酸(Arg)91.2490.46賴氨酸(Lys)101.2492.76丙氨酸(Ala)98.74103.24蘇氨酸(Thr)96.7892.45甘氨酸(Gly)98.5493.24纈氨酸(Val)102.3490.78絲氨酸(Ser)106.2397.36脯氨酸(Pro)96.4591.54異亮氨酸(Ile)91.2396.35亮氨酸(Leu)90.1194.37蛋氨酸(Met)90.4393.25組氨酸(His)97.34104.36苯丙氨酸(Phe)102.3494.35谷氨酸(Glu)95.4398.25天冬氨酸(Asp)97.16108.13胱氨酸(Cys)88.6390.38酪氨酸(Tyr)97.3493.19色氨酸(Trp)108.7494.785.11比對(duì)實(shí)驗(yàn)采用建立的方法在山東中煙、國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、川渝中煙、江蘇中煙等五家行業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用的離子色譜儀均為戴安公司生產(chǎn)，型號(hào)ICS3000。選取的比對(duì)樣品，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表10.2。比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本標(biāo)準(zhǔn)建立的方法進(jìn)行煙草游離氨基酸的測(cè)定，除了精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、胱氨酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差較高外（最高達(dá)到8.05%），其他氨基酸在不同實(shí)驗(yàn)室得到了較為一致的結(jié)果。表10.2比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg/g名稱樣品青島武漢成都南京鄭州相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，％）精氨酸(Arg)白肋煙0.4690.4530.4730.5360.5066.83香料煙0.0480.0510.0490.0460.0524.85烤煙0.1220.1340.1270.1390.1416.05烤煙型卷煙0.1070.1040.0990.1120.1064.47混合型卷煙0.1950.2030.2120.1890.1914.79賴氨酸(Lys)白肋煙0.3920.4140.3780.4120.3883.95香料煙0.0580.0620.0610.0520.0586.70烤煙0.1050.1120.1080.1170.1094.13烤煙型卷煙0.0990.1020.1060.0940.1034.51混合型卷煙0.1060.0960.1040.0980.0994.19丙氨酸(Ala)白肋煙0.9860.9790.9840.9620.9581.33香料煙0.6670.6590.6720.6830.6911.89烤煙0.3850.3920.3530.3630.3764.25烤煙型卷煙0.3710.3840.3480.3670.3543.90混合型卷煙0.3990.4010.4260.4310.4454.73蘇氨酸(Thr)白肋煙0.2840.2960.2690.2820.2763.57香料煙0.0270.0310.0280.0290.0275.89烤煙0.0680.0720.0640.0650.0694.75烤煙型卷煙0.0720.0770.0810.0830.0795.38混合型卷煙0.0890.0920.0880.0930.0834.42甘氨酸(Gly)白肋煙0.1740.1860.1920.1840.1994.99香料煙0.0530.0490.0560.0490.0525.69烤煙0.0390.0380.0360.0350.0327.61烤煙型卷煙0.0340.0310.0290.0320.0336.05混合型卷煙0.0590.0610.0640.0560.0625.05纈氨酸(Val)白肋煙0.2030.2140.2090.2230.2123.45香料煙0.0690.0650.0590.0620.0625.96烤煙0.1390.1280.1270.1250.1314.21烤煙型卷煙0.1410.1370.1360.1290.1373.21混合型卷煙0.1610.1590.1540.1620.1562.12絲氨酸(Ser)白肋煙0.4920.5060.4890.5180.5212.89香料煙0.5020.5120.5060.4960.4891.77烤煙0.3890.3690.3720.3840.3772.19烤煙型卷煙0.3560.3620.3720.3650.3492.43混合型卷煙0.4170.4080.4250.4030.4112.06脯氨酸(Pro)白肋煙2.9122.9182.8172.8362.7682.25香料煙7.4287.6397.5487.7317.5131.54烤煙5.1085.0084.9935.0515.1761.49烤煙型卷煙4.8834.8784.6644.8594.7392.04混合型卷煙4.1534.1244.3174.1934.2321.79異亮氨酸(Ile)白肋煙0.0760.0740.0710.0680.0795.81香料煙0.0210.0240.0220.0210.0235.87烤煙0.0830.0790.0920.0870.0825.95烤煙型卷煙0.0620.0640.0560.0570.0615.65混合型卷煙0.0750.0720.0850.0830.0796.86亮氨酸(Leu)白肋煙0.1690.1830.1940.1810.1965.92香料煙0.0170.0150.0180.0160.0158.05烤煙0.0280.0270.0260.0250.0246.08烤煙型卷煙0.0330.0290.0310.0280.0326.78混合型卷煙0.0480.0510.0480.0470.0524.41蛋氨酸(Met)白肋煙0.0580.0640.0660.0630.0665.18香料煙0.5320.5380.5460.5280.5541.95烤煙0.5490.5670.520.5240.5724.37烤煙型卷煙0.4380.4520.4260.4430.4482.29混合型卷煙0.2680.2530.2470.2390.2494.25組氨酸(His)白肋煙0.8930.8840.9010.8890.9061.00香料煙0.1310.1290.1220.1250.1272.75烤煙0.1930.2040.1960.1860.1883.69烤煙型卷煙0.1190.1130.1180.1260.1154.20混合型卷煙0.3140.3260.3180.3090.3322.89苯丙氨酸(Phe)白肋煙1.4891.5681.5931.5831.5652.63香料煙0.1840.1960.1840.1780.1754.39烤煙0.2040.2130.2250.2290.2174.54烤煙型卷煙0.1890.1820.1710.1780.1843.74混合型卷煙0.4210.4320.4050.4130.4242.47谷氨酸(Glu)白肋煙0.0570.0560.0610.0590.0563.75香料煙0.7760.7870.7660.7590.7781.41烤煙0.1930.2040.1950.1870.2094.46烤煙型卷煙0.1380.1450.1380.1530.1394.56混合型卷煙0.1090.1120.1230.1180.1174.71天冬氨酸(Asp)白肋煙2.5852.5782.5692.6022.5680.54香料煙0.1690.1740.1720.1810.1692.86烤煙0.3130.3190.3030.3160.3222.32烤煙型卷煙0.3770.3830.3590.3710.3782.46混合型卷煙0.8380.8670.8640.8560.8741.60胱氨酸(Cys)白肋煙0.3240.3390.3560.3670.3414.80香料煙2.3862.4132.3392.2132.6136.06烤煙1.2911.3741.2031.2821.3394.99烤煙型卷煙0.7350.7890.7940.7090.7225.23混合型卷煙0.5470.5690.5230.5320.5443.21酪氨酸(Tyr)白肋煙0.2340.2390.2210.2160.2214.32香料煙0.4850.4960.5070.5180.5233.09烤煙0.2210.2320.2420.2310.2263.40烤煙型卷煙0.1960.1980.2040.2140.1894.69混合型卷煙0.1790.1680.1830.1750.1894.45色氨酸(Trp)白肋煙0.9620.8960.9190.9210.8962.94香料煙0.2250.2460.2510.2360.2294.64烤煙0.1840.1960.1780.1880.1933.81烤煙型卷煙0.2450.2530.2620.2430.2583.24混合型卷煙0.3040.3180.2990.2890.3083.546方法普適性為證明所建立的分析方法的可靠性和普適性，項(xiàng)目組采用建立的離子色譜方法測(cè)定了不同產(chǎn)區(qū)不同部位單料煙和不同類型卷煙中游離氨基酸，均檢測(cè)到了18種游離氨基酸。結(jié)果見(jiàn)表11和表12.表11云南、福建、四川、湖南不同地區(qū)不同部位18種氨基酸的含量（mg/g）氨基酸云南福建四川湖南上部中部下部上部中部下部上部中部下部上部中部下部精氨酸0.0280.0810.0460.1330.0220.0580.010.0080.0020.0870.0860.064賴氨酸0.0020.0010.0150.0070.0040.0130.0720.0460.0520.0230.0040.02丙氨酸0.3360.3290.5040.4530.320.510.5160.3270.4870.5090.330.436蘇氨酸0.0070.0080.0730.0390.0290.0960.0520.0370.0840.0640.030.094甘氨酸0.0180.0140.0340.0360.0210.0310.0290.0180.040.040.0190.035纈氨酸0.2440.2130.460.4650.3190.5710.680.4190.6460.5190.3290.554絲氨酸0.1550.1710.3550.2920.2280.4110.3510.2950.4490.2840.2270.43脯氨酸7.3795.9177.9855.5654.5075.0076.6184.1773.686.9314.6684.149異亮氨酸0.0590.0680.0860.0610.0670.0880.0350.0470.0580.0640.0630.079亮氨酸0.0860.0940.1240.1010.0840.1180.1020.1020.0810.1170.1130.106蛋氨酸0.5720.5860.6660.6240.7160.8430.5960.5890.640.5350.5680.609組氨酸0.0590.0540.1830.0880.0630.1620.1850.0890.150.1830.0730.147苯丙氨酸0.0670.0650.2210.1470.1310.3730.2340.1330.210.2060.0970.233谷氨酸0.0630.080.2120.1220.0590.3180.2480.1350.2680.1880.090.289天冬氨酸0.1270.1120.4710.3120.2310.5870.3050.250.4390.3910.2020.542胱氨酸0.030.0330.0720.0550.0440.1070.0750.0530.120.0650.0420.107酪氨酸0.0980.1090.2260.160.1170.2050.2890.1730.1990.2170.1140.219色氨酸0.0770.1330.2410.1230.0750.3330.2490.1910.3120.1540.1170.212游離氨基酸總量9.4078.06811.9748.7837.0379.83110.6467.0897.91710.5777.1728.325表12國(guó)內(nèi)外烤煙和混合型卷煙18種游離氨基酸的含量（mg/g）氨基酸國(guó)內(nèi)混合型卷煙國(guó)內(nèi)烤煙卷煙國(guó)外混合型卷煙國(guó)外烤煙卷煙精氨酸0.1020.0870.0940.070賴氨酸0.0460.0180.0360.023丙氨酸0.5970.3160.4310.450蘇氨酸0.1360.0230.0550.046甘氨酸0.0640.0240.0760.045纈氨酸0.1330.0370.0650.112絲氨酸1.0910.6171.0851.365脯氨酸3.4674.5782.7574.386異亮氨酸0.0340.0130.0200.021亮氨酸0.0390.0040.0230.011蛋氨酸0.1000.1380.0950.226組氨酸0.1850.0840.1000.133苯丙氨酸0.8270.5360.6250.406谷氨酸0.2400.0890.3490.166天冬氨酸2.4270.2553.1050.540胱氨酸0.0430.0260.0320.042酪氨酸0.1240.0670.0530.075色氨酸0.3920.2330.3840.207游離氨基酸總量10.0477.1469.3838.3247.結(jié)論本項(xiàng)目提出了一套規(guī)范準(zhǔn)確的煙草及煙草制品游離氨基酸測(cè)定方法，該方法設(shè)計(jì)合理，精密度、重復(fù)性良好，回收率好，測(cè)試速度較快，易于推廣，建議作為行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)。主要參考文獻(xiàn)1劉百戰(zhàn),孫哲建,徐玉田.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定卷煙中的游離氨基酸[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào),1999,5(2):1~5.2李丹,黃龍,朱巍,等.反相高效液相色譜法測(cè)定煙葉中的游離氨基酸[J].煙草科技,2003,2:20~24.3MooreS,SpackmanDH,SteinWH.ChromatographyofAminoAcidsonSulfonatedPolystyreneResins.AnImprovedSystem[J].Anal.Chem.,1958,30(7):1185~1190.4SpackmanDH，SteinWH,MooreS.AutomaticRecordingApparatusforUseinChromatographyofAminoAcids[J].Anal.Chem.,1958,30(7):1190~1206.5MooreS,SteinWH.Chromatographicdeterminationofaminoacidsbytheuseofautomaticrecordingequipment[J].MethodsEnzymol.1958,6:819~831.6PattonA,PatriciaChism,QuantitativePaperChromatographyofAminoAcids.AnEvaluationofTechniques[J].Anal.Chem.1951,23(11):1683~1685.7GiriKV,RadhakrishnanAN,VaidyanathanCS.SomeFactorsInfluencingQuantitativeDeterminationofAminoAcidsSeparatedbyCircularPaperChromatography[J].Anal.Chem.1952,24(10):1677~1678.8SalanderRC,MarcusPiano,PattonAR,AccuracyofQuantitativePaperChromatographyinAminoAcidAnalysis-Addendum[J].Anal.Chem.,1953,25(8):1252~1253.9RobertsHR,KolorMG,AccuracyofQuantitativePaperChromatographyinAminoAcidDeterminationUsingDirectPhotometry[J].Anal.Chem.,1957,29(12):1800~1802.10ThompsonJF,MorrisCJ,DeterminationofAminoAcidsfromPlantsbyPaperChromatography[J].Anal.Chem.,1959,31(6):1031~1037.11HimesJB,MetcalfeLD,RapidQuantitativeDeterminationofAminoAcidsbyHighTemperaturePaperChromatography[J].Anal.Chem.,1959,31(7):1192~119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