PAGEPAGE52食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（食工、烹飪專業(yè)用）目錄實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的構(gòu)造及使用方法 5實(shí)驗(yàn)二酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別 9實(shí)驗(yàn)三霉菌的形態(tài)觀察 11實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色與形態(tài)觀察 13實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的革蘭氏染色與芽孢染色 14實(shí)驗(yàn)六培養(yǎng)基的制備與滅菌 16實(shí)驗(yàn)七細(xì)菌的分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀的觀察 22實(shí)驗(yàn)八酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù) 30實(shí)驗(yàn)九食品中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 32實(shí)驗(yàn)十食品中大腸菌群數(shù)的測(cè)定 37附錄一常用染色液 44附錄二常用培養(yǎng)基配方 45實(shí)驗(yàn)室安全守則1.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。2.在進(jìn)行高壓、干燥、消毒等工作時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員不得擅自離開現(xiàn)場(chǎng)，認(rèn)真觀察溫度、時(shí)間，蒸餾易揮發(fā)、易燃液體時(shí)，不準(zhǔn)直接加熱，應(yīng)置水浴鍋上進(jìn)行。3.嚴(yán)禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌操作進(jìn)行，如發(fā)生菌液、病原體濺出容器外時(shí)，應(yīng)立即用有效消毒劑進(jìn)行徹底消毒，安全處理后方能離開現(xiàn)場(chǎng)。4.實(shí)驗(yàn)完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時(shí)可用（殺菌劑）新潔爾滅、過氧乙酸液浸泡手，然后用水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時(shí)高壓消毒。5.實(shí)驗(yàn)完畢，及時(shí)清理現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)用具，對(duì)染菌帶毒物品，進(jìn)行消毒滅菌處理，并填寫日常工作記錄。6.每日實(shí)驗(yàn)結(jié)束，認(rèn)真檢查水、相關(guān)電源是否關(guān)閉和正在使用的設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，并認(rèn)真記錄。關(guān)好門窗，方可離去。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)總則一、樣品的采集（一）采樣目的確保采集的樣品能代表全部被檢驗(yàn)的物質(zhì)，使檢驗(yàn)分析更具代表性。（二）采樣原則1.采集的樣品要有代表性，采樣時(shí)應(yīng)首先對(duì)該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，檢查是否有污染源存在，同時(shí)能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。2.應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況，在進(jìn)行檢驗(yàn)前不得污染，不發(fā)生變化。3.采樣必須遵循無菌操作程，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。（三）采樣數(shù)量取樣數(shù)量的確定，應(yīng)考慮分析項(xiàng)目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個(gè)因素。樣品應(yīng)一式三份，分別供檢驗(yàn)、復(fù)檢及備查使用，每份樣品數(shù)量一般不少于200g。根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品一般為25克。（四）采樣方法1．采取隨機(jī)抽樣的方式。2．直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。3．如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至0－4℃4．不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌增殖。5．在將冷凍食品送到實(shí)驗(yàn)室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。（五）樣品的保存和運(yùn)送1．樣品采集完后，應(yīng)迅速送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠(yuǎn)，可保存在1－5℃2．冷凍樣品應(yīng)存放在－15℃以下冰箱內(nèi)；冷卻和易腐食品應(yīng)存放在0－53．運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。4．待檢樣品存放時(shí)間一般不應(yīng)超過36小時(shí)。二、檢驗(yàn)樣品的制備（一）樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。（二）檢驗(yàn)冷凍樣品前應(yīng)先使其融化。可在0－4℃融化，時(shí)間不超過18小時(shí)，也可在溫度不超過45℃的環(huán)境中融化，時(shí)間不超過15分鐘。（三）檢驗(yàn)液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速翻轉(zhuǎn)25次；如未裝滿，可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動(dòng)25次。從混樣到檢驗(yàn)間隔時(shí)間不應(yīng)超過3min。(四)開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75％乙醇消毒開啟部位及其周圍。1．非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)，吸管插入樣品內(nèi)的深度不應(yīng)超過2.5cm,也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。2．粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。3.固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進(jìn)行均質(zhì)，從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種，相隔時(shí)間不應(yīng)超過15分鐘。三、檢驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)室收到樣品后，首先進(jìn)行外觀檢驗(yàn)，及時(shí)按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)過程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。（二）檢驗(yàn)所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過有效的滅菌。（三）實(shí)驗(yàn)室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。（四）制備試劑和培養(yǎng)基所用的水，應(yīng)為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。（五）檢驗(yàn)結(jié)束后，所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。四、檢驗(yàn)記錄和結(jié)果的報(bào)告（一）經(jīng)檢驗(yàn)的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗(yàn)記錄。樣品檢驗(yàn)過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗(yàn)記錄，以作為對(duì)結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不得涂改和偽造。（二）檢驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，及時(shí)填寫檢驗(yàn)報(bào)告書，簽字并經(jīng)負(fù)責(zé)人審核簽字后發(fā)出。實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的構(gòu)造及使用方法一、目的要求了解顯微鏡的構(gòu)造、性能及成像原理。掌握顯微鏡的正確使用及維護(hù)方法。二、實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、紗布、綢布細(xì)菌示教標(biāo)本三、普通光學(xué)顯微鏡簡(jiǎn)介微生物的最顯著的特點(diǎn)就是個(gè)體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到它們的個(gè)體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。熟悉顯微鏡并掌握其操作技術(shù)是研究微生物不可缺少的手段。顯微鏡可分為電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡兩大類。光學(xué)顯微鏡包括：明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡、立體顯微鏡等。其中明視野顯微鏡為最常用普通光學(xué)顯微鏡，其它顯微鏡都是在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，基本結(jié)構(gòu)相同，只是在某些部分作了一些改變。明視野顯微鏡簡(jiǎn)稱顯微鏡。（一）顯微鏡的構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可以分為機(jī)械和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分。圖1-1顯微鏡構(gòu)造1.目鏡2.鏡筒3.轉(zhuǎn)換器4.物鏡5.載物臺(tái)6.聚光器7.虹彩光圈8.聚光鏡調(diào)節(jié)鈕9.反光鏡10.底座11.鏡臂12.標(biāo)本片移動(dòng)鈕13.細(xì)調(diào)焦旋鈕14.粗調(diào)焦旋鈕15.電源開關(guān)16.光亮調(diào)節(jié)鈕17.光源機(jī)械系統(tǒng)：鏡座Base：在顯微鏡的底部，呈馬蹄形、長(zhǎng)方形、三角形等。鏡臂Arm：連接鏡座和鏡筒之間的部分，呈圓弧形，作為移動(dòng)顯微鏡時(shí)的握持部分。鏡筒Tube：位于鏡臂上端的空心圓筒，是光線的通道。鏡筒的上端可插入接目鏡，下面可與轉(zhuǎn)換器相連接。鏡筒的長(zhǎng)度一般為160mm。顯微鏡分為直筒式和斜筒式；有單筒式的，也有雙筒式的。旋轉(zhuǎn)器Nosepiece：位于鏡筒下端，是一個(gè)可以旋轉(zhuǎn)的圓盤。有3~4個(gè)孔，用于安裝不同放大倍數(shù)的接物鏡。載物臺(tái)Stage：是支持被檢標(biāo)本的平臺(tái)，呈方形或圓形。中央有孔可透過光線，臺(tái)上有用來固定標(biāo)本的夾子和標(biāo)本移動(dòng)器。調(diào)焦旋鈕：包括粗調(diào)焦鈕Coarseadjustmentknob和細(xì)調(diào)焦鈕Fineadjustmentknob，是調(diào)節(jié)載物臺(tái)或鏡筒上下移動(dòng)的裝置。2. 光學(xué)系統(tǒng)接物鏡Objectivelens，常稱為鏡頭，簡(jiǎn)稱物鏡，是顯微鏡中最重要的部分，由許多塊透鏡組成。其作用是將標(biāo)本上的待檢物進(jìn)行放大，形成一個(gè)倒立的實(shí)像，一般顯微鏡有3~4和物鏡，根據(jù)使用方法的差異可分為干燥系和油浸系兩組。干燥系物鏡包括低倍物鏡（4~10x）和高倍物鏡（40~45x），使用時(shí)物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)是空氣；油浸系物鏡（90~100x）在使用時(shí)，物鏡與標(biāo)本之間加有一種折射率與玻璃折射率幾乎相等的油類物質(zhì)（香柏油）作為介質(zhì)。圖1-2物鏡的各種標(biāo)記圖1-2物鏡的各種標(biāo)記11——放大倍數(shù)2——數(shù)值口徑3——鏡筒長(zhǎng)度要求4——指定蓋玻片厚度接目鏡Eyepiecelens：通常稱為目鏡，一般由2~3塊透鏡組成。其作用將由物鏡所形成的實(shí)像進(jìn)一步放大，并形成虛像而印入眼簾。一般顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)目鏡是10x。聚光鏡Condenser：位于載物臺(tái)的下方，由兩個(gè)或幾個(gè)透鏡組成，其作用是將由光源來的光線聚成一個(gè)錐形光拄。聚光鏡可以通過位于載物臺(tái)下方的聚光鏡調(diào)節(jié)旋鈕進(jìn)行上下調(diào)節(jié)，以求得最適光度。聚光器還俯有虹彩光圈（IrisdiapHragm）,此調(diào)節(jié)錐形光拄的角度和大小，以控制進(jìn)入物鏡的光的量。反光鏡：反光鏡是一個(gè)雙面鏡，一面是平面，另一面是凹面，起著把外來光線變成平行光線進(jìn)入聚光鏡的作用。使用內(nèi)光源的顯微鏡就無需反光鏡。光源：日光和燈光均可，以日光較好，其光色和光強(qiáng)都比較容易控制，有的顯微鏡采用裝在底座內(nèi)的內(nèi)光源。（二）顯微鏡的成像原理顯微鏡的放大作用是由物鏡和目鏡共同完成的。標(biāo)本經(jīng)物鏡放大后，在目鏡的焦平面上形成一個(gè)倒立實(shí)像，再經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大形成一個(gè)虛像，被人眼所觀察到（圖1-3）。在油鏡系中，載玻片與鏡頭之間多用香柏油作介質(zhì)。因香柏油的折射率（n=1.51）與玻璃的折射率（n=1.52）幾乎相等，故透過載玻片的光線通過香柏油后，直接進(jìn)入物鏡，而不發(fā)生折射。兩組物鏡光線通路的區(qū)別如圖1-4所示圖1-3顯微鏡成像原理圖1-4物鏡光線通路（三）顯微鏡的性能1.分辨率和數(shù)值口徑衡量顯微鏡性能好壞的指標(biāo)主要是顯微鏡的分辨率，顯微鏡的分辨率（Resolvingpower）是指顯微鏡將樣品上相互接近的兩點(diǎn)清晰分辨出來的能力。它主要取決于物鏡的分辨能力，物鏡的分辨力是所用光的波長(zhǎng)和物鏡數(shù)值口徑的函數(shù)。分辨率用鏡頭所能分辨出的兩點(diǎn)間的最小距離表示，距離越小，分辨能力越好?？捎霉奖硎荆何镧R的數(shù)值口徑（Numbericalaperture），簡(jiǎn)寫為（N.A）：表示從聚光鏡發(fā)出的錐形光柱照射在觀察標(biāo)本上，能被物鏡所聚集的量。可用公式表示：n——標(biāo)本和物鏡之間介質(zhì)的折射率θ——由光源投射到透鏡上的光線和光軸之間的最大夾角光線投射到物鏡的角度越大，數(shù)值口徑就越大。如果采用一些高折射率的物質(zhì)作介質(zhì)，如使用油鏡時(shí)采用香柏油作介質(zhì)，則數(shù)值口徑增大，從而提高分辯能力。物鏡鏡筒上標(biāo)有數(shù)值口徑，低倍鏡為0.25，高倍鏡為0.65，油浸鏡為1.25。這些數(shù)值是在其它條件都適宜的情況下的最高值，實(shí)際使用時(shí)，往往低于所標(biāo)的值。2.放大倍數(shù)、焦距和工作距離顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。放大倍數(shù)一樣時(shí)，由于目鏡和物鏡搭配不同，其分辨率也不同。一般來說，增加放大倍數(shù)應(yīng)該是盡量用放大倍數(shù)高的物鏡。物鏡的放大倍數(shù)越大，焦距越短，物鏡和樣品之間的距離（工作距離）便越短。（四）顯微鏡的使用指南1.觀察前的準(zhǔn)備：顯微鏡的安置：取放顯微鏡時(shí)應(yīng)一手握住鏡臂、一手托住底座，使顯微鏡保持直立、平穩(wěn)。置顯微鏡于平整的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣3~4cm。鏡檢時(shí)姿勢(shì)要端正。接通電源，根據(jù)所用物鏡的放大倍數(shù)，調(diào)節(jié)光亮度調(diào)節(jié)鈕、調(diào)節(jié)虹彩光圈的大小，使視野內(nèi)的光線均勻、亮度適宜。2.顯微觀察：（1）接通電源，采用白熾燈為光源時(shí)，應(yīng)在聚光鏡下加一藍(lán)色的濾色片，除去黃光。一般情況下，對(duì)于初學(xué)者，進(jìn)行顯微觀察時(shí)應(yīng)遵從低倍鏡到高倍鏡再到油浸鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅剁R視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。（2）低倍鏡觀察，將做好的酵母標(biāo)本片固定在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器使觀察對(duì)象處在物鏡的正下放。旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)器，將10x物鏡調(diào)至光路中央。旋轉(zhuǎn)粗調(diào)焦鈕將載物臺(tái)升起，從側(cè)面注視小心調(diào)節(jié)物鏡接近標(biāo)本片，然后用目鏡觀察，慢慢降載物臺(tái)，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再使用細(xì)調(diào)節(jié)鈕調(diào)節(jié)圖像清晰。通過玻片夾推進(jìn)器慢慢移動(dòng)玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本個(gè)部位，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察的結(jié)果。調(diào)焦時(shí)只應(yīng)降載物臺(tái)，以免一時(shí)的誤操作而損壞鏡頭。注意無論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應(yīng)雙眼同時(shí)睜開觀察，以減少眼睛的疲勞，也便于邊觀察邊繪圖記錄。（3）高倍鏡觀察，在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。對(duì)聚光鏡光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)鈕使物像清晰，仔細(xì)觀察并記錄。如果，高倍鏡和低倍鏡不同焦，則按照低倍鏡的調(diào)焦方法從新調(diào)節(jié)焦距。（4）油浸鏡觀察，首先，將油鏡轉(zhuǎn)入光路，將聚光鏡升至最高位置并開足光圈，獲得較強(qiáng)光線。其次，在待檢部位加一滴香柏油，固定到載物臺(tái)上，從側(cè)面注視，移動(dòng)十字推進(jìn)器，找準(zhǔn)待檢部位，用粗調(diào)節(jié)鈕小心上升載物臺(tái)，使油鏡浸到香柏油內(nèi)，并壓住油向四周擴(kuò)散，再稍微上升載物臺(tái)，鏡頭有壓縮跡象。最后，眼睛對(duì)準(zhǔn)目鏡，先用粗調(diào)焦旋鈕慢慢下降載物臺(tái)，然后再用細(xì)調(diào)焦旋鈕調(diào)出清晰圖像為止，仔細(xì)觀察并作記錄。如果油鏡離開油面仍未找到，重復(fù)上述過程。3.顯微鏡的維護(hù)：觀察結(jié)束后，先降載物臺(tái)，取下載玻片。用擦鏡紙分別擦拭物鏡和目鏡。用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。清潔顯微鏡的金屬部件。將各部分還原，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，同時(shí)把聚光鏡降下，以免物鏡和聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。把顯微鏡放回原處。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告根據(jù)講義報(bào)告，對(duì)照實(shí)物，熟悉顯微鏡的構(gòu)造。按顯微鏡的使用方法，分別用低倍鏡和高倍鏡對(duì)酵母細(xì)胞示教標(biāo)本進(jìn)行觀察。哪個(gè)物鏡的工作距離最短？有哪些部件可以調(diào)節(jié)視野中光的強(qiáng)弱？有哪些方法可以提高顯微鏡的分辨率？為什么在用高倍鏡和油鏡觀察標(biāo)本之前要先用低倍鏡進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)二酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別目的要求進(jìn)一步學(xué)習(xí)并掌握光學(xué)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用方法；觀察并掌握酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及其子囊、子囊孢子和假菌絲的形態(tài)；學(xué)習(xí)并掌握鑒別酵母菌細(xì)胞死活的方法；了解酵母菌子囊孢子的染色方法及假菌絲觀察的壓片培養(yǎng)法。實(shí)驗(yàn)材料菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）、粟酒裂殖酵母（Sachizosaccharomycespombe）染色液：0.1％美藍(lán)染色液、孔雀綠染色液、沙黃染色液、95％乙醇等其他：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、吸水紙等基本原理酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，其大小通常比常見的細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍，因此，不必染色即可用顯微鏡觀察其形態(tài)。大多數(shù)酵母以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有的二分裂殖；子囊菌綱中的酵母菌在一定條件下，可產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)行有性生殖。酵母菌假菌絲的生成與培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。美藍(lán)是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈藍(lán)色，還原態(tài)呈無色。用美藍(lán)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，活細(xì)胞由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能將美藍(lán)由籃色的氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的還原態(tài)型，從而細(xì)胞呈無色；而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則由于細(xì)胞內(nèi)還原力較弱而不具備這種能力，從而細(xì)胞呈藍(lán)色，據(jù)此可對(duì)酵母菌的細(xì)胞死活進(jìn)行鑒別。操作步驟1.水浸片觀察：1）制片：在干凈的載玻片中央加一滴預(yù)先稀釋至適宜濃度的酵母液體培養(yǎng)物，從側(cè)面蓋上一片蓋玻片（先將蓋玻片一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上），應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去多余的水分（菌液不宜過多或過少，否則，在蓋蓋玻片時(shí)，菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)氣泡而影響觀察；蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡）。2）鏡檢：將制作好的水浸片置于顯微鏡的載物臺(tái)上，先用低倍鏡，后用高倍鏡進(jìn)行觀察，注意觀察各種酵母的細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式，并進(jìn)行記錄。2.美藍(lán)染色1）染色：在干凈的載玻片中央加一小滴0.1%美藍(lán)染色液，然后再加一小滴預(yù)先稀釋至適宜濃度的釀酒酵母液體培養(yǎng)物，混勻后從側(cè)面蓋上蓋玻片，并吸去多余的水分和染色液（注意染色液和菌液不宜過多或過少，并應(yīng)基本等量，而且要混勻）。2）鏡檢：將制好的染色片置于顯微鏡的載物臺(tái)上，放置約3min后進(jìn)行鏡檢，先用低倍鏡，后用高倍鏡進(jìn)行觀察，根據(jù)細(xì)胞顏色區(qū)分死細(xì)胞（藍(lán)色）和活細(xì)胞（無色），并進(jìn)行記錄。3）比較：染色約30min后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。3．子囊孢子的染色與觀察1）活化酵母：將釀酒酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上，培養(yǎng)24h，然后再轉(zhuǎn)種2~3次2）生孢培養(yǎng)：將經(jīng)活化的菌種轉(zhuǎn)移到醋酸鈉培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7~13）制片：在潔凈載玻片的中央滴一小滴蒸餾水，用接種環(huán)于無菌條件下挑取少許菌苔至水滴上，涂布均勻，自然風(fēng)干后在酒精燈火焰上熱固定（水和菌均不要太多，涂布時(shí)應(yīng)盡量涂開，否則將造成干燥時(shí)間長(zhǎng)；熱固定溫度不宜太高，以免使菌體變形）。4）染色：滴加數(shù)滴孔雀綠染色液，1min后水洗；加95%乙醇脫色30s，水洗；最后用0.5%沙黃染色液復(fù)染30s，水洗，最后用吸水紙吸干。5）鏡檢：將染色片置于顯微鏡的載物臺(tái)上，先用低倍鏡，后用高倍鏡進(jìn)行觀察，子囊孢子呈綠色，菌體和子囊呈粉紅色。注意觀察子囊孢子的數(shù)目、形狀，并進(jìn)行記錄。4.假菌絲的觀察壓片培養(yǎng)法：取新鮮的酵母菌在薄層馬鈴薯浸出汁瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種2~3條，取無菌蓋玻片蓋在接種線上，于25~28℃培養(yǎng)4~5天后，打開皿蓋，置于顯微鏡下直接觀察劃線的兩側(cè)所形成的假菌絲的形狀。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容對(duì)所給的酵母菌制片進(jìn)行形態(tài)觀察；對(duì)死活酵母細(xì)胞進(jìn)行美藍(lán)染色鑒別實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪制各種酵母菌的細(xì)胞形態(tài)圖，注明菌名與放大倍數(shù)；圖示美藍(lán)染色結(jié)果；用美藍(lán)染色法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行死活鑒別時(shí)為什么要控制染液的濃度和染色時(shí)間？實(shí)驗(yàn)三霉菌的形態(tài)觀察一、目的要求了解常見霉菌（曲霉、青霉）的基本形態(tài)特征；學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)材料菌種：曲霉（Aspergillussp.）、青霉（Penicilliumsp.）培養(yǎng)基：土豆瓊脂培養(yǎng)基（PDA）或察氏培養(yǎng)基。溶液或試劑：乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。其他：無菌吸管，平皿，載玻片，蓋玻片，解剖針，顯微鏡等。三、實(shí)驗(yàn)原理霉菌菌絲比較粗大（菌絲和孢子的直徑達(dá)到3~10μm），通常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因而可用低倍、高倍鏡觀察。霉菌菌絲細(xì)胞容易收縮變形，孢子容易飛揚(yáng)，在制備霉菌標(biāo)本時(shí)，常用乳酸石炭酸溶液作為介質(zhì)，具有不使細(xì)胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。若加入棉藍(lán)，又具有一定的染色效果。霉菌的有些結(jié)構(gòu)在制片過程中易被破壞，影響觀察，可采用載片培養(yǎng)法。此法便于直接在顯微鏡下觀察，尤其適用于根霉的假根、曲霉的足細(xì)胞及分生孢子鏈等結(jié)構(gòu)的著生和生長(zhǎng)情況的觀察。并且還可以在同一標(biāo)本上觀察到微生物發(fā)育的不同階段的形態(tài)。四、操作步驟（一）一般觀察法：點(diǎn)種培養(yǎng)：用接種針沾取斜面少許孢子在無菌的察氏培養(yǎng)基中央穿刺接種（倒置培養(yǎng)皿穿刺接種），30℃下培養(yǎng)7~10天，形成巨大菌落培養(yǎng)物。直接制片：在載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液于潔凈，打開霉菌平板培養(yǎng)物，用解剖針從菌落的邊緣挑取少量帶有孢子的菌絲，放入載玻片的染液中，細(xì)心地把菌絲挑散開，加蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，置于顯微鏡下觀察，菌絲呈蘭色，顏色的深度隨菌齡的增加而減弱。觀察曲霉時(shí)，注意觀察其菌絲有橫隔、足細(xì)胞、分生孢子梗、頂囊、小梗（形狀、層數(shù)及著生情況）、分生孢子。觀察青霉時(shí)，注意觀察其菌絲有橫隔、分生孢子梗、帚狀枝（小梗的輪數(shù)及對(duì)稱性）、分生孢子。（二）載玻片濕室培養(yǎng)觀察法也稱載片培養(yǎng)法，用無菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長(zhǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置于顯微鏡下觀察。載片培養(yǎng)法制備的標(biāo)本片可直接在顯微鏡下觀察，這種培養(yǎng)觀察方法保持了霉菌的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，尤其適用于根霉的假根、匍匐菌絲，曲霉的足細(xì)胞的觀察，并且還可在同一標(biāo)本片上觀察霉菌的不同生長(zhǎng)階段的形態(tài)。載玻片濕室培養(yǎng)觀察法具體操作：準(zhǔn)備濕室：在培養(yǎng)皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“U”形載玻片擱架、載玻片、蓋玻片（兩片），蓋上皿蓋，外用紙包扎，高壓滅菌（9.8×104Pa）20分鐘后，60℃烘箱干燥，備用。取菌接種：用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子，置于濕室的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可。（接種量要少，以免培養(yǎng)后菌絲過于稠密而影響觀察）加培養(yǎng)基：用無菌細(xì)口滴管吸取少許融化并冷卻至45℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，直徑約為0.5cm（滴加量一般以1/2小滴為宜），注意無菌操作。加蓋玻片：在培養(yǎng)基未徹底凝固前，用無菌鑷子將皿內(nèi)的蓋玻片蓋在瓊脂薄層上，用鑷子輕壓蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁。（蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此留有小縫隙，一是為了通氣，二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察。）倒保濕劑：每皿倒入約3mL20%的無菌甘油，使皿內(nèi)濾紙完全濕潤(rùn)，以保持皿內(nèi)濕度，蓋上皿蓋。制成載玻片濕室，28℃培養(yǎng)。觀察：將培養(yǎng)好的載玻片取出，置于顯微鏡下直接觀察。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容直接觀察曲霉、青霉菌落形態(tài)制片觀察曲霉、青霉的形態(tài)構(gòu)造對(duì)青霉、曲霉作載片培養(yǎng)，觀察其形態(tài)構(gòu)造（示教）。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.繪出所觀察到的各種霉菌的形態(tài)圖，注明各部分名稱。2.列表比較曲霉、青霉菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)及繁殖方式的異同點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色與形態(tài)觀察一、目的要求：了解并掌握細(xì)菌簡(jiǎn)單染色的機(jī)理及技術(shù)；學(xué)會(huì)用油鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)。二、實(shí)驗(yàn)材料：菌種：枯草桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌StapHyloccusaureus等培養(yǎng)好的細(xì)菌斜面；染料：結(jié)晶紫其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、無菌水、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙。三、基本原理：染色是細(xì)菌學(xué)上一個(gè)重要而基本的操作技術(shù)。因細(xì)菌細(xì)胞小而且透明，當(dāng)把細(xì)菌懸浮于水滴內(nèi)，用光學(xué)顯微鏡時(shí)，由于菌體和背景沒有顯著的明暗差，因而難以看清它們的形態(tài)，更不易識(shí)別其結(jié)構(gòu)，所以，用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌時(shí)，往往要先將細(xì)菌進(jìn)行染色，借助于顏色的反襯作用，可以更清楚地觀察到細(xì)菌的形狀及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)。用于微生物染色的染料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的有機(jī)化合物。發(fā)色基團(tuán)賦予化合物的顏色特征，助色基團(tuán)則給予化合物能夠成鹽的性質(zhì)。染料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類。在微生物染色中，堿性染料較常用，如常用的美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃、孔雀綠等都屬于堿性染料。簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡(jiǎn)便，適于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)椋涸谥行浴A性和弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料電離后帶有正電荷，很容易與菌體結(jié)合使細(xì)菌著色。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握細(xì)菌的染色技術(shù)，了解細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)，鞏固課堂知識(shí)，增加感性認(rèn)識(shí)。四、方法與步驟：（一）制片涂片：在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴蒸餾水，用接種環(huán)以無菌操作從枯草芽孢桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜，涂布面積約1~1.5cm2。干燥：室溫自然干燥固定：手執(zhí)載玻片一端，使涂菌一面向上，通過火焰2~3次。此操作也稱熱固定，其目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在玻片上。染色：將涂片置于水平位置，滴加結(jié)晶紫染色液（以剛好覆蓋涂片薄膜為宜），染色1min左右。水洗：傾去染液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖洗在涂菌處，直至載片上流下的水無色為止。干燥：自然干燥，或用電吹風(fēng)吹干，也可用濾紙吸干，注意不要檫掉菌體。鏡檢：待標(biāo)本片完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的革蘭氏染色與芽孢染色一、目的要求了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。學(xué)習(xí)并初步掌握細(xì)菌的革蘭氏染色法。二、實(shí)驗(yàn)材料菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌試劑：草酸銨結(jié)晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番紅液（沙黃）其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、無菌水、香柏油、二甲苯等。三、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram創(chuàng)立的。通過革蘭氏染色可把細(xì)菌區(qū)分為兩大類。革蘭氏染色的基本步驟：先用結(jié)晶紫初染、次經(jīng)碘液媒染、再用95%乙醇脫色、最后用蕃紅復(fù)染。經(jīng)過此法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞染上復(fù)染的紅色的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。大腸桿菌是標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌是標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陽性菌。革蘭氏染色的機(jī)理，與細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。經(jīng)結(jié)晶紫初染以后，所有的細(xì)菌都被染成藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合形成復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用乙醇脫色時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色處理時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖層在內(nèi)層且較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂被乙醇溶解、細(xì)胞壁透性增加，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物被洗脫出來。用蕃紅復(fù)染時(shí)染上紅色。四、操作步驟細(xì)菌的活化：將細(xì)菌接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)約18~24h。制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。脫色：直接滴加95%乙醇作用30s脫色，立即水洗。脫色是革蘭氏染色中最關(guān)鍵的一步。復(fù)染：滴加番紅液，染色2min，水洗。用濾紙吸干，油鏡鏡檢。五、注意事項(xiàng)為了保證革蘭氏染色結(jié)果的正確性，制片過程中要注意：要選用活躍生長(zhǎng)的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色，涂片不宜過厚，火焰固定不宜過熱，脫色時(shí)間的控制。另外，可選用標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌和未知菌一起混合涂片和染色。六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分別對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行革蘭氏染色對(duì)上述兩種菌進(jìn)行混合涂片，再進(jìn)行革蘭氏染色。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告圖示所觀察到的菌體細(xì)胞的形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果；為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不能超過24小時(shí)？在下表中依次填入革蘭氏染色所用染料的名稱，并填上革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌在每步染色后菌體所呈的顏色。在不影響革蘭氏反應(yīng)的前提下，哪一步可被省略？步驟所用染料菌體所呈顏色革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌1234當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣才能確保你的操作正確、結(jié)果可靠？附錄：細(xì)菌的芽孢染色一、目的要求學(xué)習(xí)芽孢染色的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)材料菌種：枯草芽孢桿菌，肉汁斜面培養(yǎng)24h；染料：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯等。三、實(shí)驗(yàn)原理芽孢又叫內(nèi)生孢子，是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鑒定細(xì)菌的依據(jù)。由于芽孢壁厚、透性差、不易著色。當(dāng)用結(jié)晶紫單染色時(shí)，菌體呈紫色，芽孢是無色透明。芽孢染色法是根據(jù)細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行染色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚，透性低，著色、脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料孔雀綠在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，此染料可以進(jìn)入菌體及芽孢使其著色，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再用番紅復(fù)染，則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。四、操作步驟制備菌懸液加1~2滴水于小試管中，用接種環(huán)挑取2~3環(huán)菌苔于試管中，攪拌均勻，制成濃的菌懸液。染色加2~3滴孔雀綠于小試管中，并使其與菌液混合均勻，然后將試管置于沸水浴的燒杯中，加熱染色15~20min。涂片固定用接種環(huán)取試管底部菌液數(shù)環(huán)于干凈載玻片上，涂成薄膜，然后將涂片通過火焰3次溫?zé)峁潭?。脫色水洗，直至流出的水無綠色為止。復(fù)染用蕃紅染液染色2~3min，傾去染液并用濾紙吸干殘液。鏡檢干燥后用油鏡觀察，芽孢呈綠色，芽孢囊和營養(yǎng)細(xì)胞為紅色。注意：所用菌種應(yīng)掌握菌齡，以大部分細(xì)菌已形成芽孢為宜；取菌不宜太少。實(shí)驗(yàn)六培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。掌握培養(yǎng)基的配置方法。掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性．因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同．例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。三、實(shí)驗(yàn)材料藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2．滅菌前玻璃器皿的包裝培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。圖6-1移液管的包扎移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約1~1.5cm。塞棉花時(shí)．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。圖6-1移液管的包扎先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1．液體培養(yǎng)基配制稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量．然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時(shí)，此步可省去。2．固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1．試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。2．三角瓶的分裝圖6-2培養(yǎng)基的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250m1三角瓶中加入50m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作圖6-2培養(yǎng)基的分裝平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1．試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。圖6-3棉塞的制作圖6-4正確與不正確的棉塞圖6-3棉塞的制作圖6-4正確與不正確的棉塞1.金屬塞2正確3、4不正確2．三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的制作1．斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度不超過試管長(zhǎng)度l／2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。2．平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無菌后方可使用。（八）無菌水的制備在每個(gè)250mL的三角瓶?jī)?nèi)裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內(nèi)裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌20~30min。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿，并進(jìn)行包扎。根據(jù)要求配制各種培養(yǎng)基。用電熱鼓風(fēng)干燥箱對(duì)玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌。用高壓蒸汽滅菌鍋對(duì)所配各培養(yǎng)基滅菌。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告簡(jiǎn)述移液管和培養(yǎng)皿的包扎注意事項(xiàng)。簡(jiǎn)述配制培養(yǎng)基的基本步驟及注意事項(xiàng)。為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用報(bào)紙包起來，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后才能使用?為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞（硅膠塞）才能使用？配制培養(yǎng)基時(shí)為什么要調(diào)節(jié)pH？高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時(shí)間短？附錄 滅菌技術(shù)一、目的要求了解消毒和滅菌的原理，并掌握各種滅菌方法的操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)材料儀器或其他用具：上述包扎的培養(yǎng)皿、試管、移液管等，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，微孔濾膜過濾器，0.22μm濾膜，注射器，鑷子，玻璃涂棒。培養(yǎng)基：上述配制的培養(yǎng)基及生理鹽水三、基本原理在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此必須對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所進(jìn)行滅菌和消毒。滅菌是指殺死一定環(huán)境中的所有微生物，包括微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法包括直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等方法。這些方法的基本原理是通過加熱使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的。四、操作步驟（一）干熱滅菌法干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160℃~170℃）進(jìn)行滅菌，它是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的。此法適用于玻璃器皿如移液管、試管和培養(yǎng)皿的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能采用干熱滅菌。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160℃~170℃），時(shí)間長(zhǎng)（1~2h）。但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的是電熱干燥箱（干燥箱）。具體操作步驟如下：裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱干燥箱內(nèi)，關(guān)好箱門。堆積時(shí)要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱干燥箱內(nèi)壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。升溫：接通電源，打開開關(guān)，適當(dāng)打開電熱干燥箱頂部的排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器，使溫度逐步上升。當(dāng)溫度升至100℃時(shí)，關(guān)閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱干燥箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160℃~170℃，則需要轉(zhuǎn)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)器使紅燈亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需的溫度。恒溫：當(dāng)溫度升到160℃~170℃時(shí)，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制，保持此溫度2h。干熱滅菌過程中，嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。降溫：切斷電源，自然降溫。開箱取物：待電熱干燥箱內(nèi)溫度降到60℃以下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。同時(shí)，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到零點(diǎn)，并打開排氣孔。電熱干燥箱內(nèi)溫度未降到60℃以前，切勿自行打開箱門，以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定的壓力下保持15~30分鐘進(jìn)行滅菌。此法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，獲得高于100℃的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌。有三點(diǎn)原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)容易凝固變性，蛋白質(zhì)隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比干燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結(jié)，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結(jié)構(gòu)和工作原理是相同的。本實(shí)驗(yàn)介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說明書。具體操作步驟如下：加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故。裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的冷空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。無菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，檢查無雜菌生長(zhǎng)后，即可使用。（三）過濾除菌有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等采用加熱滅菌法時(shí)，容易受熱分解而被破壞，因而要采用過濾除菌法。過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。過濾除菌法除實(shí)驗(yàn)室用于溶液、試劑的除菌外，在微生物工作中使用的凈化工作臺(tái)也是根據(jù)過濾除菌的原理設(shè)計(jì)的，可根據(jù)不同的需要來選用不同的濾器和濾板材料。應(yīng)用最廣泛的過濾器種類有：微孔濾膜過濾器：是一種新型過濾器，它由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質(zhì)通過濾膜，從而達(dá)到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。該濾器的優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，過濾速度快，每張濾膜只使用1次，不用清洗。蔡氏（Seitz）過濾器：是一種金屬制成的過濾漏斗，其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大，每張纖維板只能使用1次。玻璃過濾器：是一種玻璃制成的過濾漏斗，其過濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器的規(guī)格很多，5號(hào)（孔徑2~5μm）和6號(hào)（孔徑<2μm）適用于過濾細(xì)菌，其優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。本實(shí)驗(yàn)采用微孔濾膜過濾器進(jìn)行過濾除菌，具體操作步驟如下：組裝、滅菌：將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝滅菌后待用（0.1Mpa，121.5℃，滅菌20分鐘）。連接：將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。壓濾：將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭拔出。壓濾時(shí)用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過濾膜。無菌檢查：無菌操作吸取除菌濾液0.1mL于肉湯蛋白胨平板上，均勻涂布，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，檢查是否有雜菌生長(zhǎng)。清洗：棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，并換上一張新的微孔濾膜，組裝包扎，再經(jīng)滅菌后使用。整個(gè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作，以防污染，過濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)七細(xì)菌的分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀的觀察在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，細(xì)菌的分離培養(yǎng)是重要的基本技術(shù)之一。從混雜微生物中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為分離；純培養(yǎng)是指一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)菌都是由一個(gè)細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。分離培養(yǎng)的目的在于從被檢材料中，或者從污染的眾多雜菌中分離出純的病原菌。細(xì)菌分離培養(yǎng)應(yīng)先從被檢材料或病料中分離培養(yǎng)單個(gè)菌落，然后釣取可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再將純培養(yǎng)物移植培養(yǎng)。目的要求1．了解細(xì)菌的菌落形態(tài)及其在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀。2．了解培養(yǎng)性狀對(duì)細(xì)菌鑒別的重要意義。3．學(xué)習(xí)、掌握需氧菌和厭氧菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和技術(shù)。4．掌握釣菌、純培養(yǎng)及移植技術(shù)。操作步驟一．需氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法1.平板劃線分離法菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用平板劃線法進(jìn)行純種分離，此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散的由單個(gè)微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法（圖7-1）和分區(qū)劃線法（圖7-2）兩種。劃線法示意圖見圖7-3。（1）連續(xù)劃線法圖7-3劃線分離示意圖圖7-1連續(xù)劃線法圖7-2分區(qū)劃線法以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻，然后從接種細(xì)菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時(shí)平板面與接種環(huán)面成30～40度角，以手腕力量在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平圖7-3劃線分離示意圖圖7-1連續(xù)劃線法圖7-2分區(qū)劃線法(2)分區(qū)劃線法（四分區(qū)劃線法）取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。分區(qū)劃線法劃線分離時(shí)平板分4個(gè)區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環(huán)蘸取少量菌在平板上1區(qū)劃3-5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60～70度。灼燒接種環(huán)，待在平板邊緣上冷卻后，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動(dòng)約60～70度，同樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，在劃線區(qū)觀察單菌落。2.傾注平皿分離法被檢材料若含有兩種或兩種以上細(xì)菌時(shí),可借助溶化的瓊脂將細(xì)菌稀釋，待瓊脂冷凝后,分散的細(xì)菌就被固定在原地形成菌落.這樣也能達(dá)到分得純種的目的。根據(jù)材料中存在菌數(shù)的多少，傾注平皿前可將被檢材料不稀釋或用生理鹽水作適當(dāng)稀釋。其具體方法如下：取三支預(yù)先準(zhǔn)備的普通瓊脂培養(yǎng)基試管，水浴加熱融化，冷至約50℃，用火焰滅菌接種環(huán)釣取待分離物接種至第一管內(nèi)，充分搖勻后，自第一管取一接種環(huán)內(nèi)容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第三管。然后分別傾注一個(gè)已滅菌的平皿，凝固后倒轉(zhuǎn)置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。結(jié)果多數(shù)細(xì)菌在瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)成菌落，僅少數(shù)菌落出現(xiàn)在表面，通常第一個(gè)平板內(nèi)的菌落數(shù)較多而密集，第二、三個(gè)平板則逐漸減少，可見單個(gè)菌落。3.芽胞需氧菌分離培養(yǎng)法如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細(xì)菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置于80℃水浴箱中維持15～20分鐘，或85℃加熱10分鐘，再進(jìn)行培養(yǎng)。材料中若有帶芽孢的細(xì)菌仍可存活而生長(zhǎng)繁殖，不耐熱的細(xì)菌繁殖體則被殺滅。4．利用化學(xué)藥品的分離培養(yǎng)法（1）抑菌作用有些藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)另外一些細(xì)菌沒有抑制作用，所以可利用這種特性進(jìn)行細(xì)菌的分離，例如通常在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或青霉素等化學(xué)藥品來抑制革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)，以分離得到革蘭氏陰性菌。（2）殺菌作用將病料如結(jié)核病料用15％硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結(jié)核桿菌因具有抗酸性而存活。（3）鑒別作用利用細(xì)菌對(duì)某種糖的分解能力，通過培養(yǎng)基中指示劑的變化來鑒別某種細(xì)菌。例如遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基可以用來鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離法被檢病料中疑有某種病原菌存在，可將病料以無菌操作取出，放入滅菌乳缽或組織勻漿器內(nèi)，加3～5倍量無菌生理鹽水制成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死后，取其臟器，?？煞蛛x到純的病原菌。例如，疑有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取其脾臟以分離豬丹毒桿菌，可得到純培養(yǎng)。6.瓊脂斜面分離法取瓊脂斜面3管，用接種環(huán)蘸取欲檢病料少許（如為臟器，先將表面燒烙后，用滅菌解剖刀切開，以滅菌接種環(huán)由切口插入、轉(zhuǎn)動(dòng)、釣取組織），混合于第1管的凝集水中，再作斜面劃線；然后抽出接種環(huán)，不經(jīng)燒灼，繼續(xù)在第2管、第3管斜面上作同樣劃線。劃畢，置37℃溫箱中培養(yǎng)。經(jīng)此法分離培養(yǎng)后，第2管的菌落較第1管為少，第3管的菌落更少，如此較易得到單個(gè)菌落，達(dá)到純培養(yǎng)之目的。7.瓊脂平板涂布分離法被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細(xì)吸管或吸管吸取1～2滴置于平板中央，用滅菌的L形玻棒作均勻涂布。如估計(jì)細(xì)菌數(shù)很多，可直接用火焰滅菌的接種環(huán)釣菌，并做分區(qū)劃線。如為臟器病料，可先作成乳懸液再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅菌刀切開，以其切面直接進(jìn)行涂布，此法適用于含菌量較少的病料的分離。8.營養(yǎng)肉湯分離法當(dāng)組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時(shí)，用上述瓊脂斜面或平板分離法可能無菌落長(zhǎng)出，這時(shí)可以無菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯，經(jīng)37℃培養(yǎng)，在肉湯中長(zhǎng)出細(xì)菌后，再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。二、厭氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法細(xì)菌接種后，直接放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長(zhǎng)繁殖；但對(duì)厭氧菌，則需將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的氧氣除去，或?qū)⒀趸臀镔|(zhì)還原，降低其氧化還原電勢(shì)，才能生長(zhǎng)繁殖。在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)較高，不適于厭氧菌的生長(zhǎng)。為使培養(yǎng)基降低電勢(shì)，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓是十分必要的?，F(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法很多，主要有生物學(xué)法、化學(xué)法和物理學(xué)法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。（一）生物學(xué)方法培養(yǎng)基中含有植物組織（馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等）或動(dòng)物組織（新鮮動(dòng)物組織小片，或加熱的肌肉、心腦等），因組織的呼吸作用，以及組織中可氧化物質(zhì)的氧化而消耗氧氣（肌肉、腦磷脂中不飽和脂肪酸的氧化，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用），造成厭氧環(huán)境，以利于厭氧性細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)，組織中所含的還原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-還原電勢(shì)下降。此外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在同一環(huán)境中，則環(huán)境中的氧被需氧菌消耗，造成厭氧環(huán)境，也有利于厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖。1.動(dòng)物組織及其他物質(zhì)加入法在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入肝臟、腎臟等動(dòng)物臟器，因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩(wěn)定，為強(qiáng)還原劑，所以可利用此培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng)之前將肝片肉湯加熱，以驅(qū)出空氣，冷卻，然后接種培養(yǎng)。2.共棲培養(yǎng)法將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在同一個(gè)平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長(zhǎng)繁殖將氧氣消耗后，造成厭氧環(huán)境利于厭氧菌生長(zhǎng)。其具體方法是將培養(yǎng)皿的一半接種消耗氧氣能力極強(qiáng)的需氧菌如靈桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3d，（二）化學(xué)方法利用還原能力強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣消耗，或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化-還原電勢(shì)。1.焦性沒食子酸法焦性沒食子酸在堿性溶液內(nèi)能大量地吸收氧而造成厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖。通常100cm3空間用焦性沒食子酸1g及10％氫氧化鈉或氫氧化鉀10m1。具體方法有下列幾種：（1）平板培養(yǎng)法將厭氧菌劃線接種于適宜的瓊脂平板，取一小團(tuán)直徑約2cm的脫脂棉，置于平皿蓋的內(nèi)面中央，其上滴加0.5ml10％氫氧化鈉溶液；在靠近脫脂棉的一側(cè)放置0.5g焦性沒食子酸，暫勿使兩者接觸。立即將已接種的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿四周。封畢，輕輕搖動(dòng)平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒食子酸接觸，然后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h后，取出觀察。圖7-4Buchner氏厭氧培養(yǎng)法圖7-5瑞氏厭氧培養(yǎng)法（2）Buchner氏試管法（圖7-4）取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放入大試管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml圖7-4Buchner氏厭氧培養(yǎng)法圖7-5瑞氏厭氧培養(yǎng)法（3）瑞氏厭氧培養(yǎng)法（圖7-5）將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉棉塞在火焰中灼燒滅菌后，塞入管中離培養(yǎng)基1～1.5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)。（4）史氏厭氧培養(yǎng)法用圖7-6所示的厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置NaOH溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封，然后搖動(dòng)底部，使氫氧化鈉與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。（5）平皿厭氧培養(yǎng)法置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封閉后置溫箱中培養(yǎng)（圖7-7）圖7-6史氏厭氧培養(yǎng)法圖7圖7-6史氏厭氧培養(yǎng)法圖7-7平皿厭氧培養(yǎng)法2.李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法此法是利用連二亞硫酸鈉（Sodiumhyerosulphite）和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣,釋放二氧化碳造成厭氧環(huán)境。其反應(yīng)式如下：Na2S2O4+Na2CO3+O2→Na2SO4+Na2SO3+CO2取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)（如是液體培養(yǎng)基，則直立于罐內(nèi)），最上端保留可容納1～2個(gè)平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內(nèi)水分過多。若用無蓋玻罐，可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐置于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉,如圖7-8所示。3.硫乙醇酸鈉法硫乙醇酸鈉是一種還原劑，加入培養(yǎng)基中，能除去其中的氧或還原氧化型物質(zhì)，促使厭氧菌生長(zhǎng)。其它可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C及半胱氨酸等。（1）液體培養(yǎng)基法將細(xì)菌接入含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，并加入美蘭溶液作為氧化還原的指示劑，37℃培養(yǎng)24～48h后觀察，在無氧條件下，美蘭被還原成無色。圖7-8李伏夫氏厭氧培養(yǎng)法圖7-9Brewer氏培養(yǎng)皿圖7-10Mc1gtosh－Fildes二氏厭氧罐（2）固體培養(yǎng)基法利用特殊構(gòu)造的Brewer氏培養(yǎng)皿，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落。具體方法如下：先將Brewer氏培養(yǎng)皿干熱滅菌，將溶化冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾入皿內(nèi)。待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸（圖7-9）。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的氧氣被硫乙醇酸鈉還原，美蘭指示劑逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，仍呈藍(lán)色。將Brewer氏培養(yǎng)皿于圖7-8李伏夫氏厭氧培養(yǎng)法圖7-9Brewer氏培養(yǎng)皿圖7-10Mc1gtosh－Fildes二氏厭氧罐（三）物理學(xué)方法利用加熱、密封、抽氣等物理方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，造成厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖。1.厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtosh－Fildes二氏罐（圖4-10）。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)受鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放入溫箱培養(yǎng)。2.真空干燥器法將接種好的平皿或試管放入真空干燥器中，開動(dòng)抽氣機(jī)，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱中培養(yǎng)。3.加熱密封法將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏鍋內(nèi)加熱10min，驅(qū)除溶解液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層0.5cm的無菌凡士林石蠟。置37℃培養(yǎng)24～48h4.高層瓊脂柱法加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養(yǎng)基，待冷至50℃左右，接入少許經(jīng)適當(dāng)稀釋的待分離的培養(yǎng)物或含菌材料，充分搖震均勻。在瓊脂凝固前，迅速以無菌滴管吸取上述已接種的瓊脂培養(yǎng)基，注入準(zhǔn)備好的玻璃管內(nèi)（長(zhǎng)約15cm，一端塞小膠塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高壓滅菌備用），裝至4／5左右之處，塞好棉花塞，放在大試管或玻璃筒內(nèi)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌落后，拔去膠塞和棉花塞，以無菌玻棒將瓊脂柱推出于無菌平皿中，再用滅菌接種環(huán)釣取獨(dú)立菌落作厭氧純培養(yǎng)。三、兼性厭氧菌的分離培養(yǎng)方法(二氧化碳培養(yǎng)法)在細(xì)菌培養(yǎng)中，有少數(shù)細(xì)菌（如牛型布氏桿菌）在含有5～10％二氧化碳的環(huán)境下才能生長(zhǎng)。最簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是燭缸法：將接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置玻璃干燥器或其他可以密閉的玻璃缸內(nèi)，在其內(nèi)點(diǎn)燃一小段蠟燭，加上蓋（蓋邊涂上凡士林以防漏氣），約1min左右蠟燭自然熄滅，此時(shí)缸內(nèi)氧氣已被消耗，缸內(nèi)所含二氧化碳約5～10％。注意蠟燭勿太長(zhǎng)，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃過熱而破裂。也可用化學(xué)物質(zhì)作用生成二氧化碳?xì)怏w如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸。四、細(xì)菌的釣菌、純培養(yǎng)和移植圖7-11斜面接種時(shí)試管的拿法將劃線分離培養(yǎng)37℃24h的平板從溫箱中取出，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)涂片、染色鏡檢，證明不含雜菌，此時(shí)用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，所得培養(yǎng)物即為純圖7-11斜面接種時(shí)試管的拿法1.接種環(huán)移植法兩試管斜面移植時(shí)，左手斜持菌種管和新鮮空白瓊脂斜面各一管，使管口互相并齊，稍上斜，管底握于手中，松動(dòng)兩管棉塞，以便接種時(shí)容易拔出（圖7-11）。右手食指和拇指執(zhí)接種環(huán)，燒灼接種環(huán)，以右手小指扭開一管的棉塞，無名指扭開第二管的棉塞。棉塞頭向掌心內(nèi)，將試管口通過酒精燈火焰滅菌，待冷卻后將接種環(huán)插入菌種管中，釣取細(xì)菌少許取出接種環(huán)立即接種在新鮮空白瓊脂斜面上，不要碰及管壁，直達(dá)斜面底部。從斜面底部開始劃曲線或直線，向上至斜面頂端為止，管口通過火焰滅菌后，塞好棉塞。接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅菌后放下接種環(huán)。用蠟筆在試管上標(biāo)明細(xì)菌名稱和接種日期，置37℃溫箱中培養(yǎng)。斜面接種無菌操作過程如圖7-12圖7-12斜面接種無菌操作程序2.吸管或注射器移植法欲移植定量的液體培養(yǎng)物或表面有液體石蠟油的厭氧菌培養(yǎng)物，可以利用吸管或注射器移植，其操作方法是以無菌吸管或無菌注射器吸取培養(yǎng)物，代替接種環(huán)進(jìn)行移植。圖7-12斜面接種無菌操作程序五、穿刺培養(yǎng)明膠穿刺和瓊脂柱穿刺方法基本上與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，垂直刺入培養(yǎng)基中。要從培養(yǎng)基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。六、細(xì)菌培養(yǎng)性狀的檢查（一）細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)1.瓊脂平皿上的生長(zhǎng)表現(xiàn)細(xì)菌于固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)繁殖，形成單個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集落群體，稱為菌落。各種細(xì)菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鑒別某種細(xì)菌。如葡萄球菌在瓊脂平皿上，由于產(chǎn)生色素的不同，形成各種顏色的圓形而突起的菌落；炭疽桿菌形成扁平干燥，邊緣不整齊的火焰狀菌落，用放大鏡觀察時(shí)，呈卷發(fā)樣構(gòu)造；腸道桿菌屬的細(xì)菌，形成圓形、濕潤(rùn)、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌，形成細(xì)小露珠狀菌落。觀察菌落的方法除肉眼外，還可用放大鏡，必要時(shí)也可用低倍顯微鏡進(jìn)行檢查。觀察的主要內(nèi)容有（圖7-13，圖7-14）：12345678圖7-13菌落的形狀、邊緣和表面構(gòu)造圓形、邊緣整齊、表面光滑；2．圓形、邊緣整齊、表面有同心圓；3．圓形、葉狀邊緣、表面有放射狀皺褶；4．圓形、鋸齒狀邊緣、表面較不光滑；5．不規(guī)則形、波浪狀邊緣、表面有不規(guī)則皺紋；6．圓形、邊緣殘缺不全、表面呈顆粒狀；7．毛狀；8根狀12345678圖7-14菌落的隆起度1．扁平狀；2．低隆起；3．隆起；4．臺(tái)狀；5．臍狀；6．紐扣狀；7．乳頭狀；8．褶皺凸面（1）大小菌落的大小，規(guī)定用毫米（mm）表示，一般不足lmm者為露滴狀菌落；1～2mm者為小菌落；2～4mm者為中等大菌落；4～6mm或更大者稱為大菌落或巨大菌落。（2）形狀菌落的外形有圓形、不規(guī)則形、根足形、葡萄葉形。（3）邊緣菌落邊緣有整齊、鋸齒狀、網(wǎng)狀、樹葉狀、蟲蝕狀、放射狀等。（4）表面性狀觀察其是否平滑、粗糙、皺襞狀、旋渦狀、荷包蛋狀，甚至有子菌落等。（5）隆起度表面有隆起、輕度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤狀者。（6）顏色及透明度菌落有無色、灰白色，有的能產(chǎn)生各種色素；菌落是否有光澤，其透明度可分為透明、半透明及不透明。（7）硬度黏液狀、膜狀、干燥或濕潤(rùn)等。（8）溶血情況若是鮮血瓊脂平皿，應(yīng)看其是否溶血、溶血情況怎樣。2.瓊脂斜面上生長(zhǎng)表現(xiàn)（圖7-15）將各種細(xì)菌分別以接種針直線接種于瓊脂斜面上（自底部向上劃一直線），培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)。3．瓊脂柱穿刺培養(yǎng)中的生長(zhǎng)表現(xiàn)將各種細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于瓊脂柱中，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)，如圖7-16所示。1234512345圖4-15瓊脂斜面直線接種培養(yǎng)的菌落表現(xiàn)1．線狀；2．棘狀；3．珠狀；4．?dāng)U散狀；5．根狀圖4-15瓊脂斜面直線接種培養(yǎng)的菌落表現(xiàn)1．線狀；2．棘狀；3．珠狀；4．?dāng)U散狀；5．根狀圖7-16瓊脂柱穿刺培養(yǎng)的菌落表現(xiàn)線狀；2．棘狀；3．珠狀；4．絨毛狀；5．根狀（二）細(xì)菌在明膠柱穿刺培養(yǎng)中的生長(zhǎng)表現(xiàn)取大腸桿菌、枯草桿菌和其他細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于明膠柱，置22℃溫箱中培養(yǎng)后觀察其液化與否和液化的情況，不同細(xì)菌對(duì)明膠柱的液化作用各不相同，其形式如圖7-17所示。（三）細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)表現(xiàn)（如圖7-18所示）將馬腺疫鏈球菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌等分別接種于肉湯中，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)情況，主要觀察其混濁度、沉淀物、菌膜、菌環(huán)和顏色等。1.混濁度細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基中經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后其表現(xiàn)性狀不同,有均勻混濁,輕度混濁或培養(yǎng)基保持透明（表面有菌膜或底部有沉淀物）。2.沉淀物細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中所形成的沉淀有：顆粒狀沉淀、粘稠沉淀、絮狀沉淀、小塊狀沉淀。另外還有不生成沉淀的細(xì)菌。3.表面性狀主要是細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,有無菌膜或菌環(huán)形成等。4.顏色有的細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過程中能產(chǎn)生色素,色素能溶于水,所以細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,所產(chǎn)生的色素會(huì)使培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化。1234561234圖7-18細(xì)菌在肉湯中生長(zhǎng)表現(xiàn)1．絮狀；2．環(huán)狀；3．厚膜狀；4．均勻狀圖7-18細(xì)菌在肉湯中生長(zhǎng)表現(xiàn)1．絮狀；2．環(huán)狀；3．厚膜狀；4．均勻狀圖4-17細(xì)菌明膠柱穿刺培養(yǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)不液化；2．火山口狀；3.蕪箐狀；4.漏斗狀；5.囊狀；6.層狀實(shí)驗(yàn)八酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù)一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理；掌握利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二、實(shí)驗(yàn)材料菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）麥芽汁培養(yǎng)液其它：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、擦鏡紙、吸水紙等三、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該方法是將菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間容積一定的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為9個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的邊長(zhǎng)為1mm，中間平臺(tái)下陷0.1mm，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造如下。圖9-1血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造常見血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即計(jì)數(shù)室共分為16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為25個(gè)小方格；另一種是25×16型，即計(jì)數(shù)室先被分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格。但無論是哪一種規(guī)格的血球計(jì)數(shù)板，其計(jì)數(shù)室的小方格都是400個(gè)。我們采用的是25×16型。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)，再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。計(jì)算公式如下：1ml菌液中總菌數(shù)＝5×104AA為5個(gè)中方格中的總菌數(shù)，B為稀釋倍數(shù)。四、操作步