1DB21/TXXXX—2021蒙古櫟SSR分析技術規(guī)程本文件規(guī)定了蒙古櫟SRR分析技術的定義和術語、儀器設備、溶液配制、引物和分析程序。本文件適用于遼寧地區(qū)蒙古櫟的SSR分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T28660馬鈴薯種薯真實性和純度鑒定SSR分子標記LY/T2426棗品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法LY/T2756白蠟品種分子鑒定方法—SRAP分子標記法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1簡單重復序列又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由1～6個核苷酸為重復單位的長達幾十至幾百個核苷酸的串聯重復序列。3.2聚合酶鏈式反應在耐熱DNA聚合酶作用下，于體外快速大量特意擴增待定DNA序列的方法。3.3一條互補結合在模板DNA鏈上的短的單鏈，提供3’-OH末端作為DNA合成的起點，延伸合成模板DNA的互補鏈。3.4引物擴增多態(tài)性一對引物在兩個或兩個以上不同材料基因組DNA之間擴增，得到數目不同或長度不同的DNA片段。2DB21/TXXXX—20214儀器設備及試劑儀器設備及試劑見附錄B。引物相關信息見附錄C。6溶液配制溶液配制方法見附錄D。7分析程序7.1分析材料采集蒙古櫟新鮮幼嫩葉片為材料提取基因組DNA。選取適量樣品裝入凍存管，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.2DNA的提取a)采用CTAB法提取蒙古櫟基因組DNA。將干凈研缽、研杵、小匙、無水乙醇預先放入冰箱中-20℃預冷，用自來水、蒸餾水先后沖洗葉面，再用濾紙吸干水分。b)取5~10g葉片在液氮中迅速研磨成粉狀，迅速轉至滅過菌的1.5mL離心管中，加入500μL預熱過（60℃)的CTAB提取液、5μL0.2%β-巰基乙醇和5μLRNaseA(10mg/mL)，充分混勻后放入65℃水浴30min。其間每隔10min輕輕搖動混勻2次~3次。c)取出離心管加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻10min，再于臺式冷凍離心機上10000g離心10min。d)將上清液轉入另一新的1.5mL離心管中，重復c)步驟1~2次。e)移取上清液至另一已加入2倍體積預冷（0℃以下）無水乙醇的1.5mL離心管中，輕輕顛倒混勻，使DNA沉淀成絮狀，-20℃放置30min以上。f)用鉤狀玻璃棒輕輕挑出絮狀沉淀并置于新的1.5mL離心管中。如果樣品未出現云霧狀沉淀或看不清沉淀，10000g離心10min，再收集沉淀。g)加入1mL~1.5mL70%無水乙醇浸泡洗滌沉淀，輕搖幾分鐘，10000g離心10min，收集沉淀，重復1次。然后將離心管水平放置在清潔場所晾干或在超凈工作臺上吹干。h)風干后加入100μL滅菌的TE緩沖液溶解沉淀。7.3DNA濃度的檢測和定量用TE緩沖液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量標準溶液，各取3μLλ-DNA分子量標準溶液和3μL步驟7.2中提取的未知濃度DNA溶液，在1%瓊脂糖凝膠上電泳15min~20min，穩(wěn)壓90V，電泳緩沖液為1×TBE，325nm紫外燈下觀察，照相，檢測提取DNA的質量。按照GB/T28660要求的方法，計算提取DNA溶液的濃度。7.4PCR反應7.4.1PCR反應體系3DB21/TXXXX—2021在4℃條件下進行操作。15μL反應總體系中，含有10×PCR緩沖液1.5mmol/L，Mg2+1.5mmol/L，dNTPs0.3mmol/L，正向、反向引物各0.4μmol/L，TaqDNA聚合酶0.75U，模板DNA50ng/μL。7.4.2PCR反應程序擴增程序首先94℃預變性5min；隨后的35個循環(huán)為：94℃變性30s，復性30s(不同SSR引物所需的退火溫度見附錄C)，72℃延伸30s；最后72℃延伸8min，4℃保存。7.4.3PCR產物的處理PCR擴增反應結束后，在15μL的反應體系中加入5μL的上樣緩沖液，充分混勻后，備用。7.5PCR產物檢測7.5.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測7.5.1.1玻璃板的清洗用洗滌劑清洗玻璃板（長板和短板），自來水沖洗干凈，隨后將玻璃板用蒸餾水沖洗2次，再用無屑紙巾沾取無水乙醇擦拭2遍，置于通風櫥內垂直晾干待用。7.5.1.2膠槽裝配a)玻璃板的固定將長板玻璃板平鋪于通風櫥內，邊條擦拭干凈后置于長板玻璃板兩側，隨后用短板玻璃板整齊地壓蓋住，確認邊條與兩玻璃板均對齊后，將其放入封膠框中并用夾子固定在制膠板上。b)封膠配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸后用膠頭滴管吸取，沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中，避免出現氣泡，待瓊脂糖凝膠完全漫過玻璃板底部，停止灌注，放置于溫室下待其凝固后再進行下一步操作。7.5.1.3丙烯酰胺膠的配制在30mL8%聚丙烯酰胺貯備液中加入100μL10%過硫酸銨和200μL四甲基乙二胺，迅速輕輕混勻。7.5.1.4灌膠按照LY/T2756要求的方法進行灌膠。灌膠后，將梳子輕輕插入灌膠口中，室溫凝固30min。7.5.1.5上樣和電泳待凝膠完全凝固后，將裝有凝膠的玻璃板輕輕從制膠板上取下，灌膠口向內用夾子固定在電泳槽上，使用1×TBE緩沖溶液灌注電泳儀的上下兩槽，使下槽溶液漫過封膠框，上槽溶液漫過灌膠孔。垂直緩慢將梳子從灌膠口中拔出，并用1×TBE緩沖溶液清洗和整理樣品槽。使用200μL移液器從左至右逐個對點樣孔進行吹打，直至點樣孔內無碎膠、氣泡以及其他雜質。取5μL步驟7.4.3處理后的PCR擴增產物上樣，并在膠板的一側或適當位置的點樣孔中加入4μL的DNAMarker(DL2000Marker)作為對照，電泳在200V穩(wěn)壓，電流100mA條件下進行，電泳時間約為1.5~2h。7.5.1.6卸膠4DB21/TXXXX—2021電泳結束，關閉電源，將上槽中1×TBE緩沖液放出，取下固定的夾子，去掉下部瓊脂糖，取下玻璃板。將玻璃板水平放置，用起膠鏟沿灌膠口一側邊緣將玻璃板緩慢撬起，將緊貼有凝膠的玻璃板放入裝有雙蒸水的洗膠盤中輕輕搖晃，待凝膠與玻璃板完全分離后，取出玻璃板，放凈雙蒸水。7.5.1.7銀染按照LY/T2426要求的方法，對電泳樣品進行銀染檢測。7.5.1.8譜帶記錄參照DNAMarker電泳結果或掃描結果，根據每對SSR引物從檢測樣品中擴增出的條帶數以及分子量大小，按“有”帶記錄為“1”、“無”帶記錄為“0”的方法，仔細記錄每對SSR引物的PCR結果。建立SSR引物、檢測樣品及有無（1/0）對應擴增條帶數據庫。7.5.1.9SSR標記結果分析利用相關統計分析軟件，根據Nei（1973）的遺傳相似系數（GeneticSimilarity,GS）按式（1）計算檢測樣品間的遺傳相似性水平。采用非加權組平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans,UPGMA）進行聚類分析；繪制聚類分析結果圖，顯示SSR標記的直觀結果。…………式中：GS——遺傳相似系數，%；Ni——第i個樣品的擴增條帶數；Nj——第j個樣品的擴增條帶數；Nij——第i個樣品和第j個樣品共有的擴增條帶數。7.5.2毛細管電泳熒光檢測7.5.2.1樣品準備對6-FAM和HEX熒光標記的PCR產物用超純水稀釋30倍（注：不同熒光標記的擴增產物他的最適稀釋度通過預實驗確定）。分別取等體積的上述2種稀釋液混合，從中吸取1μL加入到基因分析儀專用96孔板中，在各孔分別加入0.5μL的ROX-500分子量內標和8.5μL去離子甲酰胺，置于離心機中1000g下離心10s。將樣品在PCR儀上95℃變性3min后上機測序。7.5.2.2收集數據啟動基因分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)后更換緩沖液。將裝有樣品的96孔板置于樣品架基座上，打開數據收集軟件。將電泳板信息等錄入后，啟動運行程序，基因分析儀自動收集毛細管電泳數據。將檢測得到的原始數據文件導入到分析軟件GeneMapper3.2中進行自動分析。8分析和鑒定用多對SSR引物組合進行檢測，將不同種源或家系待測樣品的電泳結果進行統計，據SSR位點的多態(tài)性，從而分析不同種源或家系間的遺傳組成差異。5DB21/TXXXX—2021（資料性）原理A.1原理SSR廣泛分布于蒙古櫟基因組中，不同蒙古櫟種源或家系間每個SSR位點重復單位的數量可能不同。針對兩側序列高度保守的特點，設計一對特異引物。利用PCR技術對重復序列進行擴增。在電泳過程中，由于SSR位點重復單位的數量不同引起的不同長度PCR擴增片段在電場作用下得到分離，經硝酸銀染色或者熒光染料標記加以區(qū)分。因此，根據SSR位點的多態(tài)性，利用PCR擴增和電泳技術，可以對蒙古櫟種源或家系間遺傳組成差異進行分析。6DB21/TXXXX—2021（資料性）儀器設備及試劑B.1主要儀器設備PCR儀、基因分析儀、凝膠成像系統、水平電泳槽及配套的制膠配件、垂直電泳槽及配套的制膠配件、臺式低溫高速冷凍離心機、超微量紫外/可見分光光度計、高壓滅菌鍋、液氮罐、超低溫冰箱、高壓電泳儀、移液器、超純水系統、水平搖床、電子天平、制冰機。B.2試劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）、RNaseA、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、硼酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、SSR引物、TaqDNA聚合酶、四種脫氧核苷酸（dNTPs）、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、λ-DNA分子量標準液、DNAMarker、丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED)、甲醛、硝酸銀、冰乙酸、無水乙醇、甲叉雙丙烯酰胺、ROX-500分子量內標、離子甲酰胺、溴酚藍、二甲苯青、DNA分析用光譜校準基質（包括FAX、HEX熒光標記DNA片段）、DNA分析儀專用電泳緩沖液。7DB21/TXXXX—2021（資料性）SSR（簡單重復序列）標記引物序列表C.1SSR（簡單重復序列）標記引物序列F:AGACTCTCCGGATGCTCF:GCCAATGTTGCTGAATTF:TCTTCTTCCAAACCTCGF:GTTCTGTACGAAGGCCGF:TTAGGAGGCGTGATCGTF:GACACGTCACGACCACTF:AGGGACACGTGCTCATTF:AGCACAAGCCAATGTAF:CCAGCTAAGACGCTCAA8DB21/TXXXX—2021（資料性）主要試劑的配制D.1常用貯備液D.1.10.5mol/LEDTA-二鈉（pH8.0）溶液將18.61g乙二胺四乙酸二鈉溶于80mLH2O中，加入氫氧化鈉（NaOH）調節(jié)pH至8.0，用超純水定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液將24.22g三羥甲基氨基甲烷溶解于160mL水中，用濃鹽酸（HCl）調節(jié)pH至8.0，用超純水定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.35mol/LNaCl溶液將58.44g氯化鈉（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.4CTAB提取緩沖液緩沖液成分為2%（質量濃度）溴代十六烷基三甲胺、100mmol/LTris-HCl（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/L，pH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mL超純水中加入20gCTAB，攪動溶解后，加入100mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）、40mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1L，高壓滅菌，4℃保存。D.1.5TE（pH8.0）緩沖液取1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL，用水定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.610mol/LNaOH溶液稱取80g氫氧化鈉（NaOH），先用160mL水溶解后，在加水定容至200mL，高壓滅菌，室溫保存。D.1.7EB（1mg/mL）溶液取0.05g溴化乙錠（EB）用50mL水溶解，用鋁箔或黑紙包裹容器，室溫保存，工作濃度為1mg/mL。D.1.86×DNA上樣電泳緩沖液(DNALordingBuffer)6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（質量分數）溴酚藍、0.05%（質量分數）二甲苯青、30mmol/LEDTA、36%（質量分數）甘油和ddH2O。使用時按照每5μLDNA樣品加入1μLDNA上樣緩沖液的比例，混勻DNA樣品和DNA上樣緩沖液后，直接加到點樣孔即可。D.2瓊脂糖凝膠電泳溶液的配制稱取1g電泳級瓊脂糖置于200mL三角瓶中，加入100mL1×TBE電泳緩沖液，在微波爐中熔化至溶液透明（確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化），冷卻至50℃~60℃,加入EB（1mg/mL）溶液使其終濃度為0.5μg/mL，混勻后倒入放好梳子（距