1進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法微滴式數(shù)字PCR法第9部分：檸檬酸桿菌本文件描述了進(jìn)出口化妝品中檸檬酸桿菌的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法。本文件適用于進(jìn)出口化妝品中檸檬酸桿菌的快速檢測(cè)。本文件所能達(dá)到的檢出限(LODm)為0.46CFU/g(mL)-0.53CFU/g(mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件，不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)SN/T4032進(jìn)出口化妝品中弗氏檸檬酸桿南檢測(cè)方法SN/T5075化妝品微生物檢驗(yàn)副樣規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要得定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonueicAcid)dAPCR:微滴式數(shù)字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)5方法原理針對(duì)檸檬酸桿菌rDNA編碼基因MF4660mpA設(shè)計(jì)引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA及反應(yīng)預(yù)混液混合。配成PCR反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR體系分布到12000個(gè)~20000個(gè)微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQI。利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測(cè)通道，可對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)，形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有檸檬酸桿菌。2除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：6.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.2冰箱：2℃~8℃、-20℃。6.3均質(zhì)器或乳液分散機(jī)(轉(zhuǎn)速1000rmin以上)。6.4電子天平：感量0.1g。6.5高速微量離心機(jī)(最大離心力不小于10000g)。6.6渦旋振蕩儀。6.7加熱裝置：95℃-100℃。6.9無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯。6.13離心管：2mL、1.5mL和0.2mL。6.14陽性對(duì)照：弗氏檸檬酸桿菌CICC21523或等效菌株或含目的片段的DN7.1僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無7.2DNA提取液：見附錄A中A.1。7.3大豆酪蛋白卵磷脂吐濕80(SCDLP)敏體培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。7.5生理鹽水：見附錄A中A37.6dAPCR反應(yīng)配套試劑。7.7檸檬酸桿菌rDNA的碼基因MF4660mpA特異性序列片段參見附錄B,引物探針如下：Primer-F:5'-GCTiCAGAAGTACAGACCPrimer-R:5'-GGTTGCTCAGCTGGCProbe-P:5'-FAM-ACCAGAAGCCCAGCAGGCTCT-BH進(jìn)出口化妝品中檸檬酸桿菌ddPCR檢驗(yàn)程序見圖1。吸取10mL1:10樣品液稀釋接種到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)93DNA提取時(shí)，用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸沉淀，于10000g~12000g離心3min,棄去上清液。在沉淀中加入50pLDNA提取液振蕩混勻，于95℃-100℃加熱10min,室溫冷卻4按照公式(1)計(jì)算DNA的濃度。按照表1配制反應(yīng)體系"。 水 6主要培養(yǎng)基和試劑A.1DNA提取液滅菌一級(jí)水將Chelex-100顆粒加入滅菌一級(jí)水中混勻，2℃-8℃保存。A2大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SCDLP)液體培養(yǎng)基酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂蒸餾水先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào)pH值為7.2-7.3,分裝，每瓶90mL,121℃