22法DetectionofconventionalexperimentalcatStaphylococcusaureusPCRmethod2024-12-31發(fā)布DB22/T3678—2024I本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)DB22/T3678—20241普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌檢測PCR法本文件描述了普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌的PCR檢測方法，給出了試驗(yàn)原理、材料、樣品、試NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范a)高速離心機(jī)，離心速度：1000r/min～20000r/min；a)陽性對照品：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25923DB22/T3678—20242c)7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯，配制方法按A.1k)核苷酸混合物（dNTPs）。7.1.1.2用滅菌接種環(huán)挑取適量7.1.1.1樣品，加入4mL7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯，均質(zhì)后置于7.1.2.2無菌采集分泌物或濃汁接種在7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中，置于培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h~7.2存放采集或處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；如需長期保存，應(yīng)放置在-80℃7.3運(yùn)輸8.2PCR擴(kuò)增目的片段PCR反應(yīng)體系見表1。上游引物為5’-GCTTGCTATGATTGTGGTAGCC-3’，下游引物為5’-CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’，產(chǎn)物DNA片段長度為423bp，產(chǎn)物基因序列應(yīng)符合BDB22/T3678—20243用量/μLDNA模板（20ng/μL～50ng/μl）TaqE（5U/μL）1123451注：可使用其他等效PCR檢測試劑盒進(jìn)與適合的DNA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物做對比；電壓60V～100V進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下緣1cm處時(shí)，停止電泳。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，觀察P8.3結(jié)果判定8.3.1陰性對照和空白對照未出現(xiàn)目的條帶，陽性對照出現(xiàn)423bp特異性目的條帶，試驗(yàn)成立；否8.3.2檢測樣品未觀察到423bp處有擴(kuò)增條帶，樣品檢測結(jié)果為陰性；檢測樣品觀察到423bp處有擴(kuò)增條帶，樣品檢測結(jié)果為陽性，應(yīng)符合圖DB22/T3678—20244A.17.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯室溫冷卻至50℃~55℃時(shí)，向其中加入DNA染料，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，將電泳梳子置入制膠板中，然后將瓊脂糖溶液倒入制膠板，凝膠適宜厚度為3mm～5mm，需確認(rèn)在梳齒下或梳齒間沒稱取1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)放入燒杯中，再向燒杯中加入100mL雙蒸水，攪拌加入800mL雙蒸水，充分?jǐn)嚢杈鶆?；加?DB22/T3678—20245GCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATACGGGTCCTTTTAAAAACAAATCATGAAACTGTACAAGATTTAAATGGTAAAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAAATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATTTGGCAAAGAAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATAAAGAAAA