PAGEICSCCS甘肅省地方標(biāo)準(zhǔn)甘肅省地方標(biāo)準(zhǔn)DBXX/TXXXX-XXXXXXX鹿人工授精技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsforartificialinseminationofdeer（報(bào)批稿）XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施發(fā)布DBXX/TXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替DB62/T2225-2012《鹿人工授精技術(shù)規(guī)程》，與DB62/T2225-2012《鹿人工授精技術(shù)規(guī)程》相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：——更改了適用范圍；——更改了規(guī)范性引用文件；——增加和更改了術(shù)語和定義；——更改了精液品質(zhì)檢查；——增加了精子密度示意圖；——增加了冷凍精液包裝；——增加了冷凍精液運(yùn)輸；——更改了冷凍精液的保存；——?jiǎng)h除了解凍后可進(jìn)行輸精的精液品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；——增加了凍精解凍后鏡檢；——增加了同期發(fā)情；——增加了公鹿精液品質(zhì)檢查記錄表。本文件由甘肅省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本文件由甘肅省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)、甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心、甘肅省農(nóng)民教育培訓(xùn)工作總站、民勤縣收成鎮(zhèn)人民政府負(fù)責(zé)起草。本文件主要起草人：王鵬飛、楊姣姣、張生偉、田文錦、李偉、滾雙寶、封洋、楊巧麗、閆尊強(qiáng)、高小莉、黃曉宇、張昌吉。本文件及其所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——2012年首次發(fā)布為DB62/T2225-2012；——本次為第一次修訂。本文件由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)解釋。各單位或個(gè)人在執(zhí)行本文件過程中如發(fā)現(xiàn)需要修改和補(bǔ)充之處，請(qǐng)隨時(shí)將意見和建議反饋至《鹿人工授精技術(shù)規(guī)程》地方標(biāo)準(zhǔn)修訂組（地址：甘肅省蘭州市安寧區(qū)營(yíng)門村1號(hào)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，郵編：730070，聯(lián)系人：王鵬飛，E-mail:wangpf815@163.com，聯(lián)系方式，以供今后修訂時(shí)參考。DBXX/TXXXX-XXXXPAGE1鹿人工授精技術(shù)規(guī)程１范圍本規(guī)程規(guī)定了鹿人工授精的方法和操作程序。本規(guī)程適用于鹿規(guī)模飼養(yǎng)場(chǎng)、人工輸精站（點(diǎn)）和養(yǎng)鹿專業(yè)戶人工馴養(yǎng)鹿的種質(zhì)資源保護(hù)、良種擴(kuò)繁﹑雜交改良﹑胚胎移植及性別控制技術(shù)等領(lǐng)域。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器LY/T2367-2014馬鹿人工授精操作技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義3.1初情期鹿生長(zhǎng)發(fā)育到一定階段，公鹿初次釋放有受精能力的精子或母鹿初次發(fā)情和排卵的時(shí)期。3.2性成熟期鹿初情期后的一段時(shí)期，生殖器官發(fā)育成熟，具備了正常的繁殖能力。3.3體成熟期鹿生長(zhǎng)發(fā)育基本完全，并具有成年動(dòng)物應(yīng)有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，亦稱生理成熟。3.4發(fā)情周期母鹿自第一次發(fā)情后，如果沒有配種或配種后未妊娠，則每間隔一定時(shí)間便開始下一次發(fā)情，如此周而復(fù)始地進(jìn)行，直到性機(jī)能停止活動(dòng)的年齡為止，這種周期性的活動(dòng)稱為發(fā)情周期。3.5同期發(fā)情采用外源生殖激素等方法使一群母鹿在同一時(shí)期內(nèi)發(fā)情并排卵的技術(shù)。3.6人工授精用人工方法把公畜的精液采出經(jīng)適當(dāng)處理后，輸送到發(fā)情母鹿的生殖道內(nèi)，使之受胎的一種繁殖技術(shù)。3.7精子活力37℃溫度鏡檢，精液中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子占精子總數(shù)的百分比，亦稱精子活率。3.8精子密度單位體積（通常為mL）精液中所含的精子數(shù)。3.9精子畸形率精液中頭、體、尾形態(tài)異常的精子數(shù)占精子總數(shù)的百分率。3.10精子頂體異常率精液中頂體異常的精子數(shù)占精子總數(shù)的百分率。3.11冷凍精液將原精液用稀釋液等溫稀釋、平衡后快速冷凍，在液氮中保存。冷凍精液包括顆粒冷凍精液和細(xì)管冷凍精液。3.12冷凍精液解凍冷凍精液使用前使冷凍精子重新恢復(fù)活力的處理方法。3.13發(fā)情鑒定采用外部觀察法結(jié)合公鹿試情法和直腸觸摸法來判定母鹿發(fā)情程度。3.14直腸把握輸精法將已涂潤(rùn)滑劑的手臂伸進(jìn)保定好的母鹿直腸內(nèi)，把握住子宮頸口，配合輸精槍頭進(jìn)入子宮頸口，將精液輸入子宮體的一種輸精方法。4精液的準(zhǔn)備精液分為鮮精液和凍精液兩種。4.1鮮精液的準(zhǔn)備4.1.1采精采精前的準(zhǔn)備備齊器械藥品，包括電刺激采精器、集精杯、玻璃棒、溫度計(jì)、紗布、鹽水瓶、消毒鍋、顯微鏡、量筒、恒溫箱、水浴鍋、分裝瓶、輸精管、pH試紙、青霉素、鏈霉素、高錳酸鉀、葡萄糖、標(biāo)簽等。認(rèn)真清潔消毒，凡是同精液有接觸的器械都必須用煮沸或高溫干燥等方法消毒。采精員、檢驗(yàn)員必須用消毒液清洗手臂。保持采精室、檢驗(yàn)室的環(huán)境衛(wèi)生和安靜。每次采精前應(yīng)配制好稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用。配方如下：葡萄糖3g、檸檬酸鈉1.4g、EDTA0.1g、蒸餾水加至100mL，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，待充分溶解后，用紗布過濾裝入鹽水瓶，蓋緊瓶塞。然后高壓蒸氣消毒（103.4kpa、15min）或煮沸消毒，待自然冷卻備用。4.1.2精液采集保定采精的種公鹿藥物麻醉保定或機(jī)械保定。麻醉保定用二甲苯胺噻唑?qū)β挂淮渭∪庾⑸洌樽韯┝堪疵縦g體重1~3mg）。鹿臥倒后用繩索縛住四肢，灌腸、排糞，用水沖洗陰莖并擦拭干凈。電刺激采精將電極棒插入肛門內(nèi)，接通電流，電壓調(diào)至2v，以每間隔5s、通電5s進(jìn)行間歇性刺激，持續(xù)5~6個(gè)周期后，將輸出電壓升高到4v，再進(jìn)行5~6個(gè)周期的刺激，以此類推，逐漸升高電壓，直至射精，即不再升壓，但要繼續(xù)通、斷電刺激，直至射精完畢。收集精液陰莖勃起后將保溫集精杯套于陰莖上收集精液。采精開始和結(jié)束前射出的少量白色液體和清白稀薄精液不予收集。4.1.3精液處理精液品質(zhì)檢查外觀評(píng)定：精液的氣味為無味或略腥；色澤為濃厚的乳白色或者乳黃色；狀態(tài)為云霧狀翻滾；pH為弱酸或弱堿性。實(shí)驗(yàn)室檢查：用玻璃棒蘸取精液滴于玻片上，在35~37℃溫度下，400倍顯微鏡檢查精子活力（0.8以上）、精子畸形率（不超過20%）和精子頂體異常率等；精子密度采用目測(cè)法（密、中、稀，圖1）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和精子密度儀測(cè)定法等方法測(cè)定。精液的稀釋根據(jù)原精的濃度計(jì)算出需要稀釋的倍數(shù)。其計(jì)算方法為：需加稀釋液量=濾精量×（原精密度×活力/0.1~1）。將稀釋液調(diào)配至所需要的量，按每100mL5~10萬單位的比例加入抗菌素，輕輕攪拌。將集精杯內(nèi)的原精液沿杯壁或玻璃棒慢慢倒入大量筒內(nèi)。然后再加入等溫稀釋液輕輕攪拌。稀釋后，立即按常規(guī)項(xiàng)目對(duì)稀釋精液進(jìn)行鏡檢?；盍Σ坏陀谙♂屒?、每毫升活精子在0.1億個(gè)以上。4.2冷凍精液的準(zhǔn)備4.2.1冷凍精液包裝細(xì)管冷凍精液（0.25mL或0.5mL）應(yīng)封閉良好，紗布袋盛裝宜50支/袋。4.2.2冷凍精液保存冷凍精液必須放在液氮儲(chǔ)精罐內(nèi)備用，液氮罐應(yīng)符合GB/T5458規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。冷凍精液罐儲(chǔ)藏時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離水源、熱源、火源，室內(nèi)應(yīng)通風(fēng)、干燥和避光，存放冷凍精液前應(yīng)進(jìn)行清晰的分類分裝，詳細(xì)標(biāo)明鹿的品種、鹿號(hào)，冷凍精液的生產(chǎn)時(shí)間、批號(hào)、產(chǎn)地，精子活力、密度、畸形率、和頂體完整率等精液品質(zhì)參數(shù)和應(yīng)用單位等。冷凍精液儲(chǔ)存應(yīng)設(shè)專人管理，儲(chǔ)存期間若不取精液，不要隨便打開罐蓋。保存期間定期檢查罐內(nèi)液氮消耗量，不足60%時(shí)及時(shí)補(bǔ)充液氮。4.2.3冷凍精液運(yùn)輸冷凍精液供應(yīng)地應(yīng)出示精液品質(zhì)檢驗(yàn)合格證、冷凍精液來源﹑鹿的品種及遺傳性能。精液選擇應(yīng)依據(jù)當(dāng)?shù)芈沟钠贩N、體質(zhì)類型及培育方向，按選配計(jì)劃有目的地選擇。運(yùn)輸前應(yīng)對(duì)冷凍精液的品質(zhì)進(jìn)行抽檢。運(yùn)輸中液氮罐應(yīng)小心輕放，不可碰撞沖擊，傾斜倒置。4.2.4冷凍精液的解凍手握法將細(xì)管從容器中取出放入手心中用雙手搓熱，直至精液溶解。水溶法將細(xì)管冷凍精液取出后，立即投入45~60℃溫水中浸泡，直至精液完全溶解取出。4.2.5冷凍精液解凍后鏡檢冷凍精液解凍后，精液品質(zhì)應(yīng)在400~600倍帶有恒溫加熱板的顯微鏡下鏡檢﹐精子活力0.3以上方可用于輸精。5同期發(fā)情在母鹿發(fā)情配種期，分批次對(duì)其采取麻醉保定，發(fā)情周期任意一天放入孕酮陰道栓（CIDR），放入后進(jìn)行解藥使其蘇醒。在第13d時(shí)對(duì)母鹿采取麻醉保定，取CIDR，同時(shí)肌注PMSG600IU~1000IU/頭，即CIDR+PMSG法。撤栓后48h開始觀察發(fā)情。6輸精6.1發(fā)情鑒定6.1.1直接觀察法用肉眼對(duì)母鹿進(jìn)行發(fā)情鑒定，綜合符合以下狀況即可輸精：食欲減退，興奮不安，在圈內(nèi)沿圍墻離群走動(dòng)，外生殖器官腫脹，擺尾，排尿頻繁。6.1.2公鹿試情法試情時(shí)母鹿站立不動(dòng)接受公鹿爬跨即可適時(shí)輸精。6.1.3直腸觸摸法母鹿保定后，先掏出直腸內(nèi)宿糞，手通過直腸壁輕輕地觸摸卵巢，判斷其大小、形狀及其上面卵泡的形態(tài)變化，以便更準(zhǔn)確地確定母馬鹿發(fā)情所處時(shí)期及對(duì)其輸精時(shí)間。6.2輸精前的準(zhǔn)備將發(fā)情母鹿放在保定器內(nèi)，若保定過程中母鹿騷動(dòng)不安，應(yīng)先進(jìn)行半麻醉后再機(jī)械保定。用溫肥皂水洗滌陰戶，出去污垢并消毒，用消毒后的紗布擦干。所用的輸精用具要嚴(yán)格消毒。輸精人員指甲須剪短磨光，手臂洗滌消毒。精液境檢活率不低于50%。6.3輸精操作6.3.1大型鹿的輸精操作對(duì)于馬鹿等體型比較大的鹿輸精采用直腸把握輸精法。輸精人員一手五指并攏，呈圓錐形從肛門伸進(jìn)直腸，動(dòng)作要輕柔，在直腸內(nèi)觸摸并把握住子宮頸，另一手從引導(dǎo)下口斜上方約45°角向里輕輕插入，雙手配合，輸精器頭對(duì)準(zhǔn)子宮頸口，輕輕旋轉(zhuǎn)插進(jìn)，過子宮頸口螺旋狀皺壁1~2cm到達(dá)輸精部位。一頭母鹿應(yīng)使用一支輸精器或者一支消毒塑料輸精外套管。直腸把握輸精使用器械及其操作分為：用球式玻璃輸精器的，注入精液前略后退約0.5cm，手捏橡膠頭注入精液，輸精管抽出前不得松開橡膠頭，以免回吸精液；用金屬輸精器的，注入精液前略后退約0.5cm，把輸精器推桿緩緩向前推，通過細(xì)管中棉塞向前注入精液。6.3.2小型鹿的輸精操作對(duì)于梅花鹿等體型較小的鹿輸精以機(jī)械保定使母鹿呈站立或橫臥保定姿勢(shì)。在開膣器末端和外陰部涂上無菌潤(rùn)滑劑，按照母鹿尻部的傾斜度，緩慢地將開膣器插入母鹿體內(nèi)，使其達(dá)到陰道末端。用小手電筒照明進(jìn)行觀察，子宮頸位于陰道底部，稍向外突出，看起來呈深紅色陰影或小孔，就像極小的唇狀物，如有云霧狀粘液妨礙觀察，應(yīng)用吸管吸去。用手迅速磨擦使輸精槍變熱，將細(xì)管槍上的活塞拉回12.7~17.8cm，插入細(xì)管，棉花端封口朝向前，切下細(xì)管尖使切口整齊，套上細(xì)管，并扭緊“Ｏ”型環(huán)。緩慢地旋轉(zhuǎn)移動(dòng)，把輸精器插入子宮頸。將第二根同長(zhǎng)度的細(xì)管或細(xì)管套插到子宮頸口，測(cè)量?jī)筛艿拈L(zhǎng)度差異，子宮頸通常為3cm左右，如插入深度比這個(gè)