實驗三肉制品中沙門氏菌的檢驗一、實驗?zāi)康囊罅私馐称返馁|(zhì)量與沙門氏菌檢驗的意義。掌握沙門氏菌的生物學(xué)特性。掌握沙門氏菌檢驗的生化試驗的操作方法和結(jié)果的判斷。掌握沙門氏菌屬血清學(xué)試方法。掌握食品中沙門氏菌檢驗的方法和技術(shù)。二、原理沙門菌屬是一大群寄生于人類和動物腸道，其生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌。種類繁多，少數(shù)只對人致病。其他對動物致病，偶爾可傳染給人。主要引起人類傷寒，副傷寒以及食物中毒或敗血癥。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。食品中沙門氏菌的檢驗方法有五個基本步驟：1

前增菌；2

選擇性增菌；3

選擇性平板分離沙門氏菌；4

生化試驗，鑒定到屬；5

血清學(xué)分型鑒定。目前檢驗食品中的沙門氏菌是按統(tǒng)計學(xué)取樣方案為基礎(chǔ)，25g食品為標(biāo)準(zhǔn)分析單位。三、試劑和儀器（一）最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml廣口瓶 1個 稀釋樣品2、500ml三角瓶 1個 制緩沖蛋白胨水3、250ml三角瓶 8個 制增菌液、培養(yǎng)基4、15×150mm試管 18支 制三糖鐵培養(yǎng)基和PH7.2尿素5、13×130mm試管 30支 制蛋白胨水等6、1ml移液管 5支7、10ml移液管 2支8、直徑為90 mm平皿 12套 制BS、SS平板9、250ml量筒 1支（二）應(yīng)滅菌的其它器材剪刀1把 不銹鋼湯匙1把 稱量紙適量（三）應(yīng)準(zhǔn)備的培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基總量 所用容器緩沖蛋白胨水(BP)： 1瓶 225ml/瓶 500ml三角瓶氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液： 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液： 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶亞硫酸鉍瓊脂(BS)： 4皿 1瓶 60ml/瓶 250ml三角瓶SS瓊脂： 6皿 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶三糖鐵瓊脂： 6支 6ml/支40ml 15×150mm試管尿素瓊脂(pH7.2)： 6支 4ml/支 25ml 15×150mm試管蛋白胨水： 6支 2ml/支 20ml 13×100mm試管氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基： 6支 4ml/支 30ml 13×13氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基（賴氨酸）：6支 1ml/支 10ml13×13氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基（不含賴氨酸）：6支1ml/支10ml13×13沙門氏菌因子血清：多價血清；11種因子血清。按26種用于初步分型；57種用于進(jìn)一步分型；163種用于詳細(xì)分型。四、實驗內(nèi)容樣品處理→→前增菌→→選擇性增菌→→選擇性平板分離→→生化學(xué)試驗→→血清學(xué)試驗鑒別→→結(jié)果報告第一天樣品處理和增菌培養(yǎng)（一）樣品處理1、加工過的樣品：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。稱取檢樣25g，加在裝有225mL緩沖蛋白陳水的500mL廣口瓶內(nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化，備用。2、未加工樣品：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。各取25g(25mL)加入滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液，備用。（二）、前增菌和增菌1、加工過的樣品：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。接種操作：將混均勻的稀釋樣液放在36±1℃培養(yǎng)4h(干蛋品培養(yǎng)18～24h)；移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24h。同時，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽骯氨酸增菌液（SC）內(nèi)。培養(yǎng)：于36±1℃培養(yǎng)18～24h。2、未加工樣品：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。接種操作：取25mL勻液，接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24h；另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）內(nèi)培養(yǎng)操作：于36±1℃培養(yǎng)18～24h。第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)（一）分離培養(yǎng)接種操作：取前天增菌培養(yǎng)的增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板（BS）和一個DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。培養(yǎng)操作：于36±1℃分別培養(yǎng)18～24h(DHL、HE、WS、SS)或40～48h(BS)，觀察各個平板上生長的菌落。第三天觀察分離結(jié)果，從平板上挑取可疑菌落接種到：三糖鐵瓊脂、蛋白陳水、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基(一)、觀察分離結(jié)果典型的沙門氏菌菌落形態(tài)如下：A、在HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂上。菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落。B、亞硫酸鉍（BS）瓊脂上。產(chǎn)硫化氫的菌落為黑色，有時帶有金屬光澤，呈褐色，灰色或黑色。菌落周圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時間的延長而變?yōu)楹谏?，并有所謂的暈環(huán)效應(yīng)。C、SS瓊脂上：無色半透明；產(chǎn)硫化氫菌株，有的菌落中心帶黑色。（二）、五項生化試驗接種操作：1、接種三糖鐵瓊脂：從選擇性瓊脂平板上，直接挑取2個或更多個菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。用一空白培養(yǎng)基作對照試驗。用滅菌接種針輕輕地接觸每個菌落中心部位，接種TSI斜面，先在斜面上劃線，再于底層穿刺。不需灼燒接種針，接種后面四項生化培養(yǎng)基。2、接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試驗。各用一空白培養(yǎng)基作對照試驗。接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各1管。培養(yǎng)操作：于36±1℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。革蘭氏染色與鏡檢：從平板上挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢觀察五項生化試驗結(jié)果，判斷沙門氏菌屬性，做血清學(xué)試驗（一）、觀察五項生化試驗結(jié)果1、在三糖鐵瓊脂內(nèi)，符合沙門氏菌屬種的反應(yīng)結(jié)果見表1。表1沙門氏菌屬種在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫可疑為沙門氏菌屬和種-++/-+沙門氏菌屬+++/-+沙門氏菌Ⅱ-++-沙門氏菌屬-+--傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除，其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。2、符合沙門氏菌屬的五項生化試按表2判定結(jié)果，沙門氏菌屬五項生化試的結(jié)果應(yīng)符合A1、A2和B1，其他反應(yīng)結(jié)果均可以排除。表2沙門氏菌屬種生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號H2S靛基質(zhì)尿素(pH7.2)氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1+---+沙門氏菌屬A2++--+沙門氏菌屬（少見）B1----+沙門氏菌屬、甲型號副傷寒沙門氏菌屬-----符合反應(yīng)序號A1，為沙門氏菌屬典型反應(yīng)，判定為沙門氏菌屬細(xì)菌。如尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)和賴氨酸脫羧酶試驗三項中，有一項異常，按表3可判定沙門氏菌：表3尿素(pH7.2)氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶判定菌屬---甲型號副傷寒沙門氏菌-++沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ+-+沙門氏菌個別變體、（二）、血清學(xué)分型鑒定1、抗原的準(zhǔn)備一般采用1.5%瓊脂斜面培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的(如2.5%一3%)培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.7%～0.8%半固體瓊脂平板的中央，候菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3%～0.4%半固體瓊脂的小玻管1～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。2、O抗原的鑒定操作：用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型?？筄血清抗O血清生理鹽水玻片凝集試驗圖被A～F多價O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集試驗。根據(jù)試驗結(jié)果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩個O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。不被A～F多價O血清凝集者，先用57種或163種沙門氏菌因子血清中的9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：O多價1A，B，C，D，E，F(xiàn)群(并包括6，14群)O多價213，16，17，18，21群O多價328，30，35，38，39群O多價44