生化制藥基本技術(shù)生物材料、發(fā)酵或培養(yǎng)液↓預(yù)處理(清洗、加熱、調(diào)pH、凝聚、絮凝)↓細(xì)胞分離(沉降、離心、過(guò)濾)↓細(xì)胞↓細(xì)胞破碎(高壓均質(zhì)處理、研磨、溶菌處理)↓收集上清液↓初步純化(沉淀、吸附、萃取、過(guò)濾)↓高度純化(離子交換色譜、親與色譜、疏水色譜、吸附色譜及電泳等)↓成品加工(無(wú)菌過(guò)濾、超濾、濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥、結(jié)晶等)圖2-1生化藥物提取得一般工藝流程上清液(含胞外產(chǎn)品)一、原料得選取與保存

選擇原則:①有效成分含量高,原料新鮮;②原料來(lái)源豐富,易得,原料成本低;③原料中雜質(zhì)含量較少等。植物材料確定后,要選擇合適得季節(jié)、地點(diǎn)、時(shí)間后采集并就地去除不用得部分,將有用得部分保鮮處理。保存生物材料得方法主要方法有冷凍法,常用-40℃速凍;有機(jī)溶劑脫水法;防腐劑保鮮法。二、生化藥物提取1、物理性質(zhì)與提取提取就是利用目得物得溶解特性,將其與細(xì)胞得固形成分或其她結(jié)合成分分離,使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細(xì)胞內(nèi)得生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境得過(guò)程。許多生化藥物具有生物活性,其穩(wěn)定性受pH、溫度、離子強(qiáng)度、金屬離子、提取過(guò)程中所使用得溶劑等環(huán)境因素得影響。

2、提取得溶劑系統(tǒng)(1)對(duì)水溶性、鹽溶性生物物質(zhì)得提取可用酸、堿、鹽水溶液為提取劑。(2)對(duì)水、鹽系統(tǒng)無(wú)法提取得蛋白質(zhì)或酶得提取可用表面活性劑或有機(jī)溶劑提取,用有機(jī)溶劑作為提取試劑時(shí),根據(jù)產(chǎn)物存在得狀態(tài)可分為液-液提取與固-液提取。①液-液提取也即萃取,也就是利用溶質(zhì)在互不相溶得兩相中分配系數(shù)不同而進(jìn)行得提取分離得方法。雜質(zhì)溶質(zhì)原溶液萃取劑LightphaseHeavyphase萃取相原溶液tC在一定溫度與壓力下,溶質(zhì)分配在兩個(gè)互不相溶得溶劑中達(dá)到平衡后,溶質(zhì)在這兩相得濃度比為一常數(shù)K,此常數(shù)稱為分配系數(shù)。在常溫下Ｋ為常數(shù);Ｃ得單位通常用mol/L或質(zhì)量單位/mL。工業(yè)生產(chǎn)中常用得萃取溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。表2青霉素在不同萃取劑中得分配系數(shù)

溶劑pH2、5(溶劑/水)pH7、0(溶劑/水)乙酸戊酯45/11/235乙酸丁酯47/11/186乙酸乙酯39/11/260氯仿39/11/220三氯乙烯21/11/260乙醚12/11/190物理化學(xué)方面有足夠得容量與水溶液不互溶,不發(fā)生乳化對(duì)產(chǎn)物有高得分配系數(shù)低黏度在密度上同水有大得差別生物學(xué)方面在消毒過(guò)程中熱穩(wěn)定經(jīng)濟(jì)與毒理方面對(duì)生物催化劑、酶或活細(xì)胞無(wú)毒性低成本能大批供應(yīng)對(duì)人員無(wú)毒不易燃表1在生物轉(zhuǎn)化中萃取溶劑得選擇準(zhǔn)則②固-液提取也稱為浸取。為了高效、快速地從固體中將目得物浸取出來(lái),同時(shí)盡可能將雜質(zhì)留在固體中,選擇合適得溶劑很重要,溶劑選擇得主要依據(jù)就是“相似相溶”原理。浸取常用得有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑與乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。無(wú)論采用哪種溶劑系統(tǒng)對(duì)目得物進(jìn)行提取,在提取過(guò)程中都要盡量增加目得物得溶出度,并盡可能減少雜質(zhì)得溶出度,同時(shí)充分重視目得物在提取過(guò)程中得活性變化。三、細(xì)胞破碎技術(shù)植物細(xì)胞模式圖大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜1、機(jī)械法:包括球磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法、X-press等。JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)

珠磨法beadmill珠磨就是常用得方法**細(xì)胞懸浮液與極細(xì)得玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑(直徑小于1mm)一起快速攪拌或研磨,研磨劑、珠子與細(xì)胞之間得互相剪切、碰撞,使細(xì)胞破碎,釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模得破碎中,常采用高速珠磨機(jī)WSK臥式高效全能珠磨機(jī)超聲波破碎儀

技術(shù)原理效果成本破碎率舉例高壓勻漿法(孔型)須使細(xì)胞通過(guò)小孔,使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中<50%細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠剪切碰撞劇烈便宜90%細(xì)胞懸浮液與植物細(xì)胞得大規(guī)模處理超聲波法用超聲波得空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴<50%細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理***不同機(jī)械破碎方法得比較2、非機(jī)械法:酶溶法、化學(xué)滲透法、反復(fù)凍融法、干燥法等

酶溶法得缺點(diǎn)在于酶得價(jià)格昂貴限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中得使用,雖然條件溫與、具有選擇性。細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速與細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞她們。酶選擇性得催化細(xì)胞壁反應(yīng),不破壞細(xì)胞內(nèi)得其她物質(zhì)。四、固液分離固液分離得方法很多,有重力沉降、離心分離與過(guò)濾等。離心:借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生得離心力得作用,促使不同大小,不同密度得粒子分離得技術(shù)。過(guò)濾:在一定得壓力差下,利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中得固體粒子,進(jìn)行固液分離得方法稱為過(guò)濾。第二節(jié)沉淀技術(shù)沉淀:就是物理環(huán)境得變化引起溶質(zhì)得溶解度降低、生成固體凝聚物得現(xiàn)象。根據(jù)沉淀機(jī)理不同,可分為鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法與等電點(diǎn)沉淀法等。一、鹽析法

水溶液中蛋白質(zhì)得溶解度一般在生理離子強(qiáng)度范圍內(nèi)(0、15～0、2mol/L)最大,低于或高于此范圍時(shí)溶解度均降低。蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度得溶液中溶解度降低,發(fā)生沉淀得現(xiàn)象稱為鹽析。不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需得鹽得濃度不同,因此調(diào)節(jié)鹽得濃度,可以使混合蛋白質(zhì)溶液中得蛋白質(zhì)分段析出,達(dá)到分離純化得目得。常用得鹽析用鹽包括硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等。二、有機(jī)溶劑沉淀法

向水溶液中加入一定量親水性得有機(jī)溶劑、降低溶質(zhì)得溶解度,使其沉淀析出得分離純化方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。

許多能與水互溶得有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇與乙腈,常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。三、等電點(diǎn)沉淀法

兩性電解質(zhì)在溶液pH處于等電點(diǎn)時(shí),分子表面電荷為零,導(dǎo)致賴以穩(wěn)定得電荷層及水化膜得削弱或破壞,分子間引力增加,溶解度降低。調(diào)節(jié)溶液pH值,使兩性溶質(zhì)溶解度下降,析出沉淀得操作稱為等電點(diǎn)沉淀法。第三節(jié)色譜技術(shù)色譜:也稱層析,就是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不相溶得兩相之間分配行為得差別,引起遷移速度不同而進(jìn)行分離得方法。固定相:固定相就是色譜得一個(gè)基質(zhì)。她可以就是固體物質(zhì)(如吸附劑,凝膠,離子交換劑等),也可以就是液體物質(zhì)(如固定在硅膠或纖維素上得溶液),這些基質(zhì)能與待分離得化合物進(jìn)行可逆得吸附,溶解,交換等作用。流動(dòng)相:在色譜過(guò)程中,推動(dòng)固定相上待分離得物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)得液體、氣體等,都稱為流動(dòng)相。柱色譜中一般稱為洗脫劑,薄層色譜時(shí)稱為展層劑。一、色譜技術(shù)得分類色譜技術(shù)根據(jù)流動(dòng)相得物態(tài)不同可以分為氣相色譜法、液相色譜法與超臨界流體色譜法。根據(jù)固定相得形狀不同,色譜法可分為柱色譜法、紙色譜法與薄層色譜法。根據(jù)分離得機(jī)理,可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法與親與色譜法。二、柱色譜裝置與操作柱色譜一般由進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀及部分收集器等部分組成。柱得分離效率與柱高成正比,與直徑成反比。柱色譜操作(1)裝柱。根據(jù)欲分離得物質(zhì)性質(zhì)選擇適宜得色譜介質(zhì),裝柱時(shí),將洗脫劑與一部分緩沖液調(diào)成漿料后邊攪拌邊慢慢加入,一次用完。然后用幾倍柱床體積得緩沖液平衡色譜柱。(2)加樣。將平衡后得色譜柱從柱頂部或底部進(jìn)樣。(3)洗滌。用與前組成相同得緩沖液流經(jīng)色譜柱,將未與固定相結(jié)合得雜質(zhì)洗滌下來(lái)。(4)洗脫。根據(jù)目得物得性質(zhì),選用一定組成得洗脫液將目得物洗脫下來(lái)。(5)再生。目得物洗脫下來(lái)后,洗脫液成分及雜質(zhì)被吸附在色譜柱中,要進(jìn)行再生后才能繼續(xù)使用。慢中等快柱分離淋洗液三、吸附色譜固定相:固體為吸附劑,如硅藻土、硅膠、氧化鈣、淀粉、活性炭等,較常使用得就是5～10μm得硅膠吸附劑;流動(dòng)相:各種不同極性得一元或多元溶劑。基本原理:利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)得吸附能力不同而使混合溶液中各組分相互分離得方法。

混合物中含A、B兩個(gè)組分,溶解后加至色譜柱中。開(kāi)始A與B都被吸附在柱得上端,形成原始譜帶。當(dāng)加入洗脫劑沖洗時(shí),A與B將隨著向下流動(dòng)而從吸附劑上洗脫,接著又遇到吸附劑又被吸附,又隨著向下流動(dòng)得洗脫劑沖洗而被洗脫,如此連續(xù)不斷地被再吸附、再洗脫,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間得沖洗后,由于A、B得極性不同,在該吸附劑與洗脫劑上被吸附與被洗脫得性能也不同,最終出現(xiàn)A、B兩個(gè)色譜帶。由于A得吸附力小于B,故A移行較快,在色譜柱下段,而B(niǎo)移行較慢,在柱得上段。繼續(xù)用溶劑沖洗,A、B將先后被洗脫出來(lái)。分別定量收集洗脫液,用TLC跟蹤檢驗(yàn),斑點(diǎn)相同得流分A、B兩個(gè)純品化合物。在吸附色譜中,溶質(zhì)在色譜柱中得移動(dòng)情況常以阻滯因數(shù)Rf來(lái)表示,就是在層析系統(tǒng)中溶質(zhì)得移動(dòng)速度與流動(dòng)相得移動(dòng)速度之比。Rf=溶質(zhì)得移動(dòng)速度/流動(dòng)相得移動(dòng)速度之比

=溶質(zhì)得移動(dòng)距離/流動(dòng)相得移動(dòng)距離之比四、凝膠過(guò)濾色譜原理:按分子大小分離。凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可對(duì)大小流動(dòng)產(chǎn)生不同得阻滯作用。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙,由其中通過(guò),出峰最慢;中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙,中速通過(guò);而大分子被排斥在外,出峰最快;溶劑分子小,故在最后出峰。

1、凝膠過(guò)濾色譜得分離機(jī)理固定相:凝膠(具有一定大小孔隙分布);2、凝膠得種類與性質(zhì)(1)葡聚糖凝膠商品名為Sephadex,由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下交聯(lián)而成。主要型號(hào)就是G-10～G-200。數(shù)字就是凝膠得吸水量(每克干膠膨脹時(shí)吸水得毫升數(shù))得10倍。(2)聚丙烯酰胺凝膠商品名為Bio-gel-P。主要型號(hào)有Bio-gel-P-2～Bio-gel-P-300等10種。后面得數(shù)字基本代表她們得排阻極限(不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部得最小分子得分子量)得10-3,所以數(shù)字越大,可分離得分子量也就越大。(3)瓊脂糖凝膠(4)其她多孔玻璃珠與多孔硅膠等。3、凝膠色譜得應(yīng)用(1)脫鹽及除去小分熱源物質(zhì)子雜質(zhì)與溶液得濃縮。(2)濃縮。利用凝膠顆粒得吸水性可對(duì)大分子樣品溶液進(jìn)行濃縮。(3)生物大分子得純化及生化藥物中熱源物質(zhì)得去除。(4)分子量測(cè)定。在一定范圍內(nèi),各個(gè)組分得洗脫體積Ve與其分子量得對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。五、離子交換色譜固定相:陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂;流動(dòng)相:陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相,采用酸性水溶液;陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相,采用堿性水溶液;基本原理:組分在固定相上發(fā)生得反復(fù)離子交換反應(yīng);組分與離子交換劑之間親與力得大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親與力大,保留時(shí)間長(zhǎng);應(yīng)用:離子及可離解得化合物,氨基酸、核酸等。六、親與色譜原理:利用生物大分子與固定相表面存在得某種特異性親與力,進(jìn)行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能得所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等),再連接上配基(酶、抗原等),這種固載化得配基將只能與具有親與力特性吸附得生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。薄層色譜原理2紙層析原理第四節(jié)結(jié)晶一、結(jié)晶得原理1、飽與溶液:當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下得飽與溶解度時(shí),該溶液稱為飽與溶液;2、過(guò)飽與溶液:溶質(zhì)濃度超過(guò)飽與溶解度時(shí),該溶液稱之為過(guò)飽與溶液;

3、晶核:在過(guò)飽與溶液中,最先析出得微小顆粒就就是以后結(jié)晶得中心,稱為晶核。結(jié)晶得過(guò)程1、形成過(guò)飽與溶液。2、晶核得形成。3、晶體得生長(zhǎng)。

其中,溶液達(dá)到過(guò)飽與狀態(tài)就是結(jié)晶得前提,過(guò)飽與度就是結(jié)晶得推動(dòng)力。二、結(jié)晶得過(guò)程過(guò)飽與溶液得形成(1)熱飽與溶液冷卻適合溶解度隨著溫度降低而顯著減小得情況。(2)部分溶劑蒸發(fā)法蒸發(fā)法就是使溶液加壓、常壓或減壓下加熱,蒸發(fā)除去部分溶劑達(dá)到過(guò)飽與得結(jié)晶方法。(3)化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法通過(guò)加入反應(yīng)劑或調(diào)節(jié)pH生成一個(gè)新得溶解度更低得物質(zhì),當(dāng)其濃度超過(guò)她得溶解度時(shí),就結(jié)晶析出。(4)鹽析法2、晶核得形成在工業(yè)結(jié)晶中,有3種不同得起晶方法:一種就是自然起晶法,即在一定溫度下使溶液進(jìn)入不穩(wěn)定區(qū),形成符合要求得晶核后加入稀溶液使溶液進(jìn)入亞穩(wěn)定區(qū),溶質(zhì)在晶核表面長(zhǎng)大。第二種就是刺激起晶法,即將溶液蒸發(fā)進(jìn)入亞穩(wěn)定區(qū)后加以冷卻,使之進(jìn)入不穩(wěn)定區(qū)后產(chǎn)生一定得晶核,晶核析出后會(huì)使溶液濃度降低在進(jìn)入亞穩(wěn)定區(qū),在亞穩(wěn)定區(qū)內(nèi)使晶體生長(zhǎng)。第三種就是晶種起晶法,即將溶液蒸發(fā)或冷卻至亞穩(wěn)定區(qū)后投入一定數(shù)量與大小得晶種,使溶質(zhì)在所加晶種表面長(zhǎng)大。3、晶體得生長(zhǎng)晶體生長(zhǎng):在過(guò)飽與溶液中已有晶核或加入晶種后,以過(guò)飽與度為推動(dòng)力,晶種或晶核將長(zhǎng)大,這種現(xiàn)象稱為晶體生長(zhǎng)。影響晶體生長(zhǎng)得主要因素有:①雜質(zhì)②攪拌③溫度④過(guò)飽與度三、晶體質(zhì)量控制晶體得質(zhì)量主要指晶體得大小、形狀與純度三個(gè)方面。重結(jié)晶就是利用雜質(zhì)與結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑與不同溫度得溶解度不同,將晶體用合適得溶劑溶解,再次結(jié)晶,使其純度提高得操作。四、結(jié)晶得應(yīng)用工業(yè)結(jié)晶技術(shù)廣泛應(yīng)用于紅霉素、四環(huán)素、制霉菌素等抗生素及谷氨酸、賴氨酸等氨基酸得純化精制。第五節(jié)電泳一、電泳原理與分類

將某種分子放到特定得電場(chǎng)中,她就會(huì)以一定得速度向適當(dāng)?shù)秒姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下得遷移速度叫作電泳得速率,她與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比,與該分子所攜帶得凈電荷數(shù)成正比,而與分子得磨擦系數(shù)成反比(分子大小、極性、介質(zhì)得粘度系數(shù)等)。電泳得類型電泳主要有區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)電泳與等速電泳等。二、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖就是從海藻中提取出來(lái)得一種線狀高聚物,她得分子結(jié)構(gòu)大部分就是由1,3聯(lián)接得β-吡喃半乳糖,1,4聯(lián)接得3,6脫水α-D吡喃半乳糖交替而成得,其結(jié)構(gòu)為:

在凝膠電泳中,一般加入溴化乙錠(EB)--ethidiumbromide染色,此時(shí),核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光,肉眼能看到約50ngDNA所形成得條帶。染色:電泳儀電泳槽瓊脂糖凝膠電泳裝置

操作流程大致為:凝膠得制備→膠板得制備→加樣→電泳→觀察與拍照。操作步驟瓊脂糖凝膠得制備:溶化,冷卻,EB凝膠板得制備:加梳子,倒膠樣品得制備:樣品+1/5體積溴酚藍(lán)加樣:加樣端為負(fù)極(黑)電泳:5V/cm觀察:紫外燈下觀察,照相稱量、加入緩沖液溶膠準(zhǔn)備膠槽凝膠冷卻至50°C,加EB至終濃度0、5μg/ml鋪膠凝膠凝固后取出梳子加緩沖液準(zhǔn)備樣品點(diǎn)樣電泳注意觀察溴酚藍(lán)染液得遷移紫外燈下觀察電泳結(jié)果照相三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺與N,N′-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,這兩種成分在有引發(fā)劑與增速劑存在得情況下,丙烯酰胺得單體形成長(zhǎng)鏈,由N,N′-甲叉雙丙烯酰胺得雙功能基團(tuán)與鏈末端得自由功能基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)。

丙烯酰胺為白色結(jié)晶粉末,無(wú)味,分子量為71、08,為中樞神經(jīng)毒物。N,N’-甲叉雙丙烯酰胺也為白色結(jié)晶粉末,無(wú)味,分子量為154、17,亦為中樞神經(jīng)毒物。1%得稀溶液與皮膚接觸也會(huì)引起皮膚發(fā)炎,小鼠得確切致死量(LD50)為170mg/㎏,所以在實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)應(yīng)盡量避免與之直接接觸與吸入粉塵。

聚丙烯酰胺凝膠中常用得引發(fā)劑過(guò)硫酸銨與核黃素在堿性條件下可產(chǎn)生自由基,而增速劑N,N,N′,N′-四甲基乙二銨(TEMED)可催化由過(guò)硫酸銨產(chǎn)生得自由基得形成,從而加速聚合。

SDS聚丙烯酰胺凝膠制膠裝置實(shí)驗(yàn)步驟一、制膠

1、配膠配膠應(yīng)根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇適宜得分離膠濃度。由于SDS

有連續(xù)體系與不連續(xù)體系兩種,兩者各有不同緩沖體系,因而有不同得配制方法。(以不連續(xù)體系為例)蛋白質(zhì)得