第2節(jié)動物細(xì)胞工程

第2課時(shí)動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體【本節(jié)聚焦】1.什么是動物細(xì)胞融合技術(shù)？2.單克隆抗體是如何制備的？在臨床上有哪些應(yīng)用？第二章

細(xì)胞工程問題探討植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)可以跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類型。那么，有沒有技術(shù)讓不同種動物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢于一身的動物細(xì)胞呢？問題探討知識回顧：必修一第三章第1節(jié)現(xiàn)在學(xué)習(xí)：什么是細(xì)胞融合？人細(xì)胞和小鼠細(xì)胞如何融合在一起的呢？以前學(xué)習(xí)：這一實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)的其他實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，細(xì)胞膜具有流動性。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：動物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。2.結(jié)果：形成的雜交細(xì)胞具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息。3.原理：細(xì)胞膜的流動性。4.誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的常用方法物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)融合法生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法——動物細(xì)胞融合特有5.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)6.拓展：生物法－滅活病毒誘導(dǎo)法⑵滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理：⑴滅活含義：

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。⑶融合實(shí)質(zhì)及完成的標(biāo)志:

指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力（不感染細(xì)胞），但是并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核的融合一、動物細(xì)胞融合技術(shù)

[旁欄思考]19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)的病毒誘導(dǎo)了多個體細(xì)胞的融合，形成多核細(xì)胞。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)7.應(yīng)用(1)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)總結(jié)：植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志意義結(jié)果細(xì)胞膜具的流動性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法電融合法；聚乙二醇（PEG）融合法；滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能獲得雜種植株獲得雜交細(xì)胞課堂練習(xí)不同種的細(xì)胞也能融合√1.如圖表示仙臺病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的部分過程，下列敘述正確的是A.細(xì)胞A和細(xì)胞B必須為同種細(xì)胞才能融合B.細(xì)胞C同時(shí)有細(xì)胞A和細(xì)胞B的遺傳物質(zhì)C.該融合過程體現(xiàn)了細(xì)胞膜具有選擇透過性D.此過程的原理是動物細(xì)胞具有全能性體現(xiàn)細(xì)胞膜具有流動性原理是細(xì)胞膜的流動性動物細(xì)胞融合不能產(chǎn)生完整個體一、動物細(xì)胞融合技術(shù)2.對比動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，下列論述合理的是A.均可使用PEG、電融合或滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合B.兩者都可以跨越種屬間的生殖隔離C.兩者都可以體現(xiàn)細(xì)胞的全能性D.在適宜的條件下，均可產(chǎn)生完整個體動物細(xì)胞融合特有動物細(xì)胞融合未體現(xiàn)√二、單克隆抗體及其應(yīng)用1.常規(guī)抗體的制備及特點(diǎn)(1)制備方法：向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。動物體內(nèi)抗原漿細(xì)胞抗體（血清）反復(fù)注射抗原不純抗體不純多種(2)特點(diǎn)：產(chǎn)量低，純度低，而且特異性差。為了解決這一難題，科學(xué)家進(jìn)行了多年的研究和探索。二、單克隆抗體及其應(yīng)用（１）動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種；（２）每個B淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）只分泌一種特異性抗體?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)：在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細(xì)胞是不可能無限增殖的。思路：遺憾：怎樣解決這一問題呢？一個B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞群克隆如何獲得大量的單一抗體？單一抗體二、單克隆抗體及其應(yīng)用動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)抗體骨髓瘤細(xì)胞（能無限增殖）一個B淋巴細(xì)胞（只分泌一種特異性抗體）1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計(jì)了一個極富創(chuàng)造性的實(shí)驗(yàn)方案：雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體單克隆抗體由于這一貢獻(xiàn)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體的制備過程注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合用特定的抗原對小鼠進(jìn)行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞。多種雜交細(xì)胞如BB、B瘤、瘤瘤等二、單克隆抗體及其應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞（多種）融合的細(xì)胞自身融合的B細(xì)胞B瘤自身融合的骨髓瘤細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長。第一次篩選未融合的B淋巴細(xì)胞二、單克隆抗體及其應(yīng)用知識拓展：第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞。資料：已知細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能分裂增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能合成DNA，死亡雜交瘤細(xì)胞能無限增殖，生長培養(yǎng)基中加入氨基喋呤（HAT選擇培養(yǎng)基）B淋巴細(xì)胞能合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖骨髓瘤細(xì)胞能合成DNAD途徑能無限增殖任務(wù)：請根據(jù)以上信息，設(shè)計(jì)一種方法，從培養(yǎng)基中篩選出雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞能合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖二、單克隆抗體及其應(yīng)用篩選原因：由于小鼠體內(nèi)提取的B淋巴細(xì)胞有很多種，形成的雜交瘤細(xì)胞也有很多種雜交瘤細(xì)胞(多種)能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞多孔培養(yǎng)板將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個進(jìn)行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）用標(biāo)記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結(jié)合即為陽性孔）第二次篩選陽性孔多孔細(xì)胞培養(yǎng)板抗體檢測板克隆化培養(yǎng)抗體檢測二、單克隆抗體及其應(yīng)用抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)單克隆抗體體內(nèi)或體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔從腹水中獲取培養(yǎng)液中獲取多種B淋巴細(xì)胞（產(chǎn)生特定抗體）注射特定抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞（能無限增殖）骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合多種細(xì)胞第一次篩選特定的選擇性培養(yǎng)基雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)、抗體檢測第二次篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體腹水培養(yǎng)液二、單克隆抗體及其應(yīng)用B細(xì)胞B-B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體的制備過程（1）注射特定抗原目的：得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞（2）第一次篩選①目的：

②方法：

③原理：獲得雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長（3）雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體的制備過程（4）第二次篩選①目的：

②方法：

③原理：（5）培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞的情況下，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進(jìn)行多次篩選）克隆化培養(yǎng)：細(xì)胞增殖抗體檢測：抗原與抗體能夠特異性結(jié)合在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖（6）獲取單克隆抗體的方式①體外培養(yǎng)：

②體內(nèi)培養(yǎng)：

從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體的制備過程①技術(shù)：動物細(xì)胞融合、動物細(xì)胞培養(yǎng)（7）應(yīng)用到的細(xì)胞工程技術(shù)及原理②原理：細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞增殖（8）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備。培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法Ⅰ.優(yōu)點(diǎn)：Ⅱ.缺點(diǎn)：規(guī)模小，產(chǎn)量少Ⅰ.優(yōu)點(diǎn)：可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)①腹腔培養(yǎng)②體外培養(yǎng)不需培養(yǎng)基，易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低Ⅱ.缺點(diǎn)：需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的應(yīng)用（1）作為診斷試劑（最廣泛的應(yīng)用）資料1:用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的"早早孕診斷試劑盒"，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。女性懷孕后會分泌一種糖蛋白,-人絨毛膜促性腺激素(HCG)，尿液中會檢出HCG的存在。用抗HCG單克隆抗體制備的試紙可以測試女性是否懷孕。(抗原-抗體雜交法)優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的應(yīng)用（2）用于運(yùn)載藥物和治療疾病(主要用于癌癥的治療)資料2：使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細(xì)胞毒素）三部分組成。優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小二、單克隆抗體及其應(yīng)用1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論：抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療。②一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒。②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？二、單克隆抗體及其應(yīng)用4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？你可以課后搜集資料，然后以“單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用”為主題，出一期黑板報(bào)或制作電子板報(bào)宣傳相關(guān)知識。

單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用涉及治療、診斷等方面。單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。在臨床診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細(xì)胞因子的測定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應(yīng)用為例，用放射性同位素或熒光標(biāo)記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體，可以用這些抗體來對體內(nèi)的腫瘤進(jìn)行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等。曲妥珠單抗課堂練習(xí)1.新型冠狀病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)與人呼吸道黏膜上皮細(xì)胞ACE2受體結(jié)合，入侵細(xì)胞后可引起肺炎。針對此環(huán)節(jié)研發(fā)單克隆抗體是治療新冠肺炎的研究熱點(diǎn)之一，下列相關(guān)敘述錯誤的是A.①過程需多次向小鼠體內(nèi)注射S蛋白，以便于從

脾臟中獲得致敏的B淋巴細(xì)胞B.②過程可通過電融合法使兩個細(xì)胞融合C.經(jīng)③過程篩出的細(xì)胞既能無限增殖又能產(chǎn)生識別

S蛋白的單克隆抗體D.S蛋白的單克隆抗體能夠阻斷病毒入侵正常細(xì)胞以減弱對機(jī)體的毒害√不一定全部都能無限增殖課堂練習(xí)2.抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC)通過將細(xì)胞毒素與單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，過程如圖所示。下列敘述不正確的是A.抗體進(jìn)入細(xì)胞后激活溶酶體酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡B.ADC可通過胞吞方式進(jìn)入腫