21.2多肽—、多肽的結(jié)構(gòu)和命名

一分子α-氨基酸的氨基和另一分子α-氨基酸的羧基之間縮水所生成的酰胺化合物稱為肽(peptide,此名詞來自于希臘語“消化”，因?yàn)殡氖紫仁怯刹糠窒牡鞍踪|(zhì)得到的）。肽分子中的酰胺鍵稱為肽鍵(peptidelinkages)。

由兩個(gè)或三個(gè)氨基酸形成的肽叫做二肽或三肽。由多個(gè)氨基酸形成的肽稱為多肽。在肽分子中每個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)部分稱為氨基酸單位(殘基）。

在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸也是通過肽鍵連接起來的。實(shí)際上,蛋白質(zhì)就是相對分子質(zhì)量很大（約一萬以上）的多肽。所以了解多肽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是研究蛋白質(zhì)的重要基礎(chǔ)。

開鏈狀的肽總有兩個(gè)末端。含游離氨基的一端稱為N端，通常寫在左邊;含游離羧基的一端稱為C端，寫在右邊。肽的命名是從N端開始，由左至右依次將每個(gè)氨基酸單位寫成“某氨?！?，最后一個(gè)氨基酸單位的羧基是完整的，寫為“某氨酸”。例如:

在肽的命名中，還經(jīng)常用縮寫符號來表示氨基酸單位,符號之間用短線隔開。上面的三肽為:Ala-Gly-Phe。

二、多肽結(jié)構(gòu)的測定

多肽(或蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)與其生物功能密切相關(guān)?？梢源騻€(gè)簡單的比喻，多肽與氨基酸的關(guān)系相當(dāng)于英文單詞與字母的關(guān)系。各種字母(26個(gè))的特定排列可以得到特定含義的詞，各種氨基酸(約二十多種)在肽鏈中的排列順序可以決定一個(gè)肽(或蛋白質(zhì)）的生物功能。例如，如果將food(食物）中的字母d用1代替，該詞的含義隨之變化(fool,傻子）。類似地，如在催產(chǎn)素(一種9肽）中，它的亮氨酸被異亮氨酸代替所形成的肽，則嚴(yán)重喪失刺激乳汁分泌和催產(chǎn)能力。

確定多肽結(jié)構(gòu)是一項(xiàng)非常復(fù)雜而細(xì)致的工作。英國化學(xué)家桑格（F.Sanger)花了十年的時(shí)間在1955年首次測定出牛胰島素的氨基酸順序。[F.Sanger,1918年出生于英國，在Cambridge大學(xué)獲博士學(xué)位，他的牛胰島素測定工作獲1958年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)Q他又因在含

5375個(gè)核苷對的DNA測定工作與P.Berg和W.Gilbert分享1980年Nobel獎(jiǎng)。]桑格的工作為多肽結(jié)構(gòu)測定奠定了基礎(chǔ)。近四十多年來，隨著分離、分析技術(shù)的發(fā)展，有許多蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)相繼被確定。如：降壓素（9肽）、牛催產(chǎn)素（9肽）、增壓素（10肽）、核糖核酸酶（124肽）、糜蛋白酶(241肽）、甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(333肽)等。

以下僅簡單介紹測定多肽結(jié)構(gòu)的一般步驟和方法。確定多肽的結(jié)構(gòu)，應(yīng)從兩方面著手。

首先測定組成多肽的氨基酸種類和數(shù)目；然后測定這些氨基酸在肽鏈中排列的順序。1.完全水解

完全水解的目的是為了測定組成多肽的氨基酸種類。將多肽在6mol/L的鹽酸中，100°C?120°C溫度下加熱10?24小時(shí)，多肽可完全水解成氨基酸。用電泳、層析法或氨基酸自動分析儀將水解混合物進(jìn)行分離、鑒定，并測定其相對含量。然后根據(jù)相對分子質(zhì)量（用物理化學(xué)方法測定)計(jì)算出各氨基酸可能的分子數(shù)目。

色氨酸在酸性水解時(shí)，會發(fā)生分解（吡咯環(huán)被破壞），但在堿性溶液（2mol/LNaOH，100°C)中水解，能夠測定色氨酸。測定多肽結(jié)構(gòu)一般都用酸性水解，這是因?yàn)閴A性水解會使精氨酸、光氨酸、絲氨酸、蘇氨酸都遭受破壞，而且其他氨基酸易發(fā)生外消旋。

氨基酸在肽鏈中的排列順序是多肽結(jié)構(gòu)測定的核心，也是比較棘手的問題，一般可用端基

分析和部分水解相結(jié)合的方法來完成。2.端基分析

所謂端基分析(terminalanalysis)就是通過一定的化學(xué)方法確定肽鏈的N端或C端氨基酸的種類。(1)N端分析

測定N端的方法較多，主要介紹以下兩種：A.桑格法（Sangermethod)2，4-二硝基氟苯（DNFB)與肽鏈N端的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，生成二硝基苯基（DNP)衍生物9。9在酸中水解時(shí)，肽鏈斷裂，但DNP鍵保留，N端氨基酸轉(zhuǎn)化為N-二硝基苯基取代的衍生物。后者很容易分離，可用光譜法鑒定。DNFB不僅可以和α-NH2作用，它也可與氨基酸分子中其他氨基反應(yīng)，生成相應(yīng)DNP衍生物。DNFB是英國化學(xué)家桑格1945年發(fā)現(xiàn)的，因此稱為桑格試劑。他首先用于測定牛胰島素的結(jié)構(gòu)，隨后，桑格試劑即成為測定肽鏈N端的重要試劑。桑格法的缺點(diǎn)是在水解時(shí)，整個(gè)肽鏈都被破壞，所以在肽鏈上只能進(jìn)行一次N端分析。B.愛德曼（Edman)降解法

異硫氰酸苯酯與N端氨基反應(yīng)生成苯基硫脲衍生物。在有機(jī)溶劑中用無水氯化氫處理，N端氨基酸以咪唑衍生物形式從肽鏈上斷裂下來。可用萃取法分離，用氣一液分配色譜法，以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物做參照，進(jìn)行鑒定。

由上式可以看出，在用HC1(無水）處理苯基硫脲衍生物時(shí)，肽鏈的其余部分不受影響而被保留下來，這樣又獲得了一個(gè)新的N端氨基。用同樣的方法可確定下一個(gè)氨基酸組分，如此循環(huán)重復(fù)，能連續(xù)測定從N端到C端的氨基酸順序。這種方法是瑞士化學(xué)家愛德曼于1950年提出來的，因此稱為愛德曼降解法。一般情況下，它能有效地鑒定約40個(gè)端基氨基酸?，F(xiàn)在已可用儀器自動進(jìn)行鑒定。利用這種方法曾在肌紅蛋白（153肽）的結(jié)構(gòu)測定中成功地分析了N端的前60個(gè)氨基酸。

此外還有丹酰氯[5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯]和N端游離氨基反應(yīng)，經(jīng)水解后所生成的產(chǎn)物能發(fā)生熒光，可用紙層析或薄層層析法分離鑒定。（2）C端分析A.羧肽酶法

羧肽酶(carboxypeplidase)是催化C端氨基酸水解的特效酶。也就是說，在羧肽酶作用下，只有靠近游離羧基的那個(gè)肽鍵發(fā)生水解，而其他肽鍵不變。由此可以確定C端氨基酸的種類。

水解所生成的余肽(肽的剩余部分），在羧肽酶作用下可繼續(xù)水解。與愛德曼法相似，重復(fù)進(jìn)行，可依次確定C端的下一個(gè)氨基酸，但這種方法只能重復(fù)有限的幾次。

羧肽酶水解是C端分析的主要方法。B.酰肼法

在一般條件下，羧酸與肼不作用，而酰胺與肼反應(yīng)可生成酰肼。當(dāng)多肽與肼一起加熱時(shí)，除C端氨基酸外，所有的氨基酸都以它們的酰肼衍生物釋放出來。C端氨基酸可用紙色譜法進(jìn)行鑒定。

用端基分析法一般只能確定相對分子質(zhì)量較小的多肽的結(jié)構(gòu)。對于相對分子質(zhì)量較大的多肽(或蛋白質(zhì))還要使用部分水解法，先將多肽水解成若干較小的肽碎片，分別用端基分析法確定這些肽碎片的氨基酸順序。然后再根據(jù)它們彼此重疊部分而“拼搭”出整個(gè)肽鏈的結(jié)構(gòu)。3.部分水解

蛋白酶對肽鍵的水解有催化作用，但每一種蛋白酶只能水解一定類型的肽鍵，選擇性很強(qiáng)。例如:糜蛋白酶(chymotrypsin)只能斷開苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸羧基上的肽鍵;胰蛋白酶(trypsin)只能斷開精氨酸及賴氨酸羧基上的肽鍵；胃蛋白酶（pepsin)只能斷開苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸氨基上的肽鍵。我們正是利用這些特殊蛋白酶的選擇性催化作用，使多肽進(jìn)行部分水解，斷裂成若干肽碎片，為多肽結(jié)構(gòu)測定提供一定的信息和方便。

假定有一個(gè)多肽，經(jīng)酸性水解，分離、鑒定水解產(chǎn)物，它含有8種氨基酸:丙、亮、賴、苯丙、脯、絲、酪、纈，其含量比都是1:1。經(jīng)相對分子質(zhì)量測定證明它是由上述8種氨基酸組成的八肽。從端基分析知道N端為丙，C端為亮。該肽用糜蛋白酶水解時(shí)生成酪氨酸、一個(gè)三肽和一個(gè)四肽。三肽經(jīng)端基分析得知N端為丙，C端為苯丙。四肽的N端為賴，C端為亮。三肽在胃蛋白酶作用下水解為苯丙和一個(gè)二肽（丙—脯）。四肽在胰蛋白酶作用下水解為賴氨酸和一個(gè)三肽，該三肽的N端是絲。根據(jù)以上測定結(jié)果我們可以“拼搭”出該八肽的結(jié)構(gòu)為：

丙—脯—苯丙—酪—賴—絲—纈—亮三、多肽的合成

確定了多肽(或蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)，對化學(xué)家來說所面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是多肽的合成。多肽的合成主要是基于氨基酸之間脫水形成酰胺鍵(肽鍵）的反應(yīng)。該反應(yīng)本身并不復(fù)雜，但多肽的合成工作卻相當(dāng)困難。即使合成一個(gè)最簡單的二肽（如甘一丙），也不是那么容易。當(dāng)甘氨酸和丙氨酸一起反應(yīng)時(shí)，除生成所期望的甘一丙二肽外，還會有丙一甘、甘一甘、丙一丙三種二肽副產(chǎn)物。因?yàn)榘被崾请p官能團(tuán)化合物，甘氨酸、丙氨酸的羧基和氨基可以兩兩交叉反應(yīng)。

欲從這多種二肽混合物中將少量的甘—丙二肽分離出來是極其困難的。況且生成的二肽分子中仍有游離的羧基和氨基，它們之間還能進(jìn)一步縮合，生成其他化合物。

由此可以看出，要使氨基酸在指定的羧基和氨基之間形成肽鍵，以合成所需要的肽，必須把其他氨基和羧基保護(hù)（封鎖)起來，使它們不參加生成肽鍵的反應(yīng)。所用的保護(hù)試劑必須滿足以下兩個(gè)條件:（1)它易于接到被保護(hù)的基團(tuán)上去；（2)完成保護(hù)任務(wù)后，保護(hù)基團(tuán)易于脫掉而不影響肽鍵。

氨基和羧基的保護(hù)是多肽合成的關(guān)鍵。尋找合適的保護(hù)劑曾經(jīng)是化學(xué)家的主要難題?，F(xiàn)在難題已經(jīng)得到解答，化學(xué)家們陸續(xù)找到了一些較好的保護(hù)劑，使多肽合成工作得到了很大的發(fā)展。1.氨基的保護(hù)

保護(hù)氨基主要用以下兩種試劑:

(1)氯甲酰芐酯(2)叔丁氧羰基疊氮

叔丁氧?；珊唽憺锽OC。該保護(hù)基對催化氫化是穩(wěn)定的。在多肽合成中，根據(jù)具體情況可分別選用Cbz或Boc兩種保護(hù)方法。2.羧基的保護(hù)

羧基可與甲醇、乙醇或芐醇生成醋而得到保護(hù)。因?yàn)轷サ乃獗弱０啡菀?，所以?dāng)肽鍵形成后，可用稀堿在室溫下水解去掉保護(hù)基。

如果用芐醇保護(hù)，則所生成的芐酯還可用氫解的方法將保護(hù)基去掉:3.肽鍵的形成

分別將不同的氨基酸中的氨基和羧基進(jìn)行保護(hù)后，就可以按指定順序合成多肽。為了更有效地形成肽鍵，還需要對參與形成肽鍵的羧基進(jìn)行活化。常用的活化劑是二環(huán)己基碳化二亞（dicyclohexylcarbodiimide)，即DCC。DCC與羧基能形成一種活潑的異脲衍生物，后者可立即與第二個(gè)已經(jīng)保護(hù)好羧基的氨基酸反應(yīng)而生成肽鍵。目前這是應(yīng)用最廣泛的一種活化羧基的方法。下邊以合成二肽為例，說明合成的一般步驟。

在這里，當(dāng)肽鍵形成后，可以用氫解法同時(shí)將N保護(hù)劑和C保護(hù)劑去掉。反應(yīng)中生成的二環(huán)己基脲脫水后又可轉(zhuǎn)化為DCC，繼續(xù)使用。

如果需要進(jìn)一步加長肽鏈，則只把其中一個(gè)保護(hù)基去掉，形成一種新的含有游離羧基或氨基的化合物。然后按上述方法把特定氨基酸一個(gè)個(gè)依次連接上去。

以上介紹的僅是多肽合成要考慮的主要問題及其解決方法，實(shí)際上在合成中還有很多復(fù)雜的問題，特別是保持氨基酸原有構(gòu)型的問題對所得多肽生理活性至關(guān)重要。而在構(gòu)成肽鏈或脫去保護(hù)基的反應(yīng)中，常常會發(fā)生外消旋化。此外由于合成步驟長，副產(chǎn)物多，在分離提純方面也有不少的困難。

我國科學(xué)工作者經(jīng)過艱苦努力，于1965年首次合成了具有全部生理活性的結(jié)晶牛胰島素(其結(jié)構(gòu)見圖21-1)。這是我國科學(xué)史上的重大成就，它標(biāo)志著我閏合成化學(xué)水平達(dá)到了一定的高度。

胰島素是動物胰臟分泌出來的激素，它能降低血液葡萄糖的濃度。它是一種51肽，含有兩個(gè)長肽鏈，A鏈(21個(gè)氨基酸單位）和B鏈(30個(gè)氨基酸單位）通過S—S鍵相連。4.多肽的固相合成

在一般多肽合成中，每生成一個(gè)肽鍵，都要經(jīng)過氨基和羧基的保護(hù)，縮合脫水（包括羧基活化），去保護(hù)基等步驟。都必須純化中間體，除去過量的試劑和副產(chǎn)物，操作非常繁雜費(fèi)時(shí)。為簡化操作，縮短合成時(shí)間，人們進(jìn)行了多方面探索。1962年麥里費(fèi)爾德（Merrifield)提出一種新的合成方法—多肽固相合成（solid-phasesynthesis)。[R.B.Merrifield，1921年出生于美國，在California大學(xué)獲博士學(xué)位，任Rockefeller大學(xué)化學(xué)教授。由于他在多肽固相合成上的出色工作獲1984年NobeL化學(xué)獎(jiǎng)。]

固相合成的步驟是先將保護(hù)好NH2的氨基酸與樹脂表面的官能團(tuán)反應(yīng)生成酯。這樣就把該氨基酸固定在樹脂上。去掉N保護(hù)劑后，再與另一個(gè)氨基酸（保護(hù)了NH2,活化了羧基）反應(yīng)生成肽鍵。再去N保護(hù)劑，接下一個(gè)氨基酸，多次重復(fù)，直至預(yù)期數(shù)目的氨基