基于響應(yīng)面法的肉蓯蓉多糖提取工藝優(yōu)化分析TOC\o"1-3"\h\u11111.材料與方法 摘要：目的本實(shí)驗(yàn)為了提高肉蓯蓉多糖的提取率和含量，優(yōu)化了肉蓯蓉多糖的提取工藝。方法采用水提醇沉法提取肉蓯蓉多糖，以肉蓯蓉多糖提取率和含量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)方法觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)多糖提取率及含量的影響，并通過響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行分析與優(yōu)化。結(jié)果最佳提取工藝為：超聲時(shí)間20min、料液比1∶20（g/ml）、超聲功率200W，提取率為8.32%，含量為27.8%。結(jié)論采用水提醇沉法提取管花肉蓯蓉多糖來優(yōu)化超聲提取法方法可行，并且能有效提高多糖提取率。關(guān)鍵詞：水提醇沉；肉蓯蓉多糖；超聲輔助提??；響應(yīng)面優(yōu)化肉蓯蓉（CistanchedeserticolaMa）別名大蕓、蓯容、金筍、地精，肉蓯蓉為多年生全寄生草本植物[1]。肉蓯蓉首次被記載是在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，至今已有一千多年的歷史，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉具有多種有益于人體健康的功效，如加強(qiáng)血液循環(huán)能力、滋陰補(bǔ)陽[2]、潤(rùn)腸通便、延緩衰老、護(hù)肝明目[3]、調(diào)節(jié)人體免疫力、清除人體自由基及游離細(xì)胞、加強(qiáng)記憶力和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[4]。我國(guó)的肉蓯蓉主要分布于陜甘寧小部分及新疆與內(nèi)蒙古大部分的戈壁灘沙漠中，我國(guó)肉蓯蓉屬植物有5種，其中有一種為變種[5]。由于肉蓯蓉種類不被人所熟悉，選取標(biāo)準(zhǔn)參差不齊，人工栽培肉蓯蓉的生產(chǎn)質(zhì)量一直堪憂[6]。肉蓯蓉由于其含水量高，呼吸代謝快由導(dǎo)致其有效成分流失嚴(yán)重，選取好的肉蓯蓉來干燥能夠有效提高市場(chǎng)中肉蓯蓉商品的質(zhì)量[7]。肉蓯蓉中含有大量多糖類化合物，其具有抗衰老、抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫力的作用[8]。響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，周期短、預(yù)測(cè)性優(yōu)、回歸方程準(zhǔn)確度高。響應(yīng)面法高效便捷，此方法把實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)學(xué)模型相結(jié)合，對(duì)有特征性的各方案進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合所有因素和響應(yīng)值兩者間的函數(shù)關(guān)系，可以大量的節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間并且提升應(yīng)用的可靠性。對(duì)所有具有交互作用的因素、函數(shù)以及等高線分析，能夠高效的確定多種因素系統(tǒng)的最佳條件。本實(shí)驗(yàn)用水提醇沉超聲輔助法提取肉蓯蓉多糖，應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)方法觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)多糖提取率的影響，并通過響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行分析與優(yōu)化。可以為肉蓯蓉多糖的研究提供方向。1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1肉蓯蓉實(shí)驗(yàn)所用藥材選自新疆烏魯木齊市干果市場(chǎng)的管花肉蓯蓉飲片。1.1.2試劑試劑批號(hào)廠家80%乙醇9058-58-1上海藍(lán)季生物科技有限公司無水乙醇器9014-01-1天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司丙酮20170520天津市鑫鉑特化工有限公司乙醚140314天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司表1要試劑的名稱及批號(hào)和廠家注：所用試劑均為分析純1.1.3主要儀器表2主要儀器的名稱及廠家儀器名稱廠家高速多功能粉碎機(jī)上海市夢(mèng)祥電器有限公司KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器江蘇金怡儀器科技有限公司B-220型恒溫水浴鍋江陰市保利科研器械有限公司AL-104型電子天平上海菁海儀器有限公司RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀江蘇金怡儀器科技有限公司SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司LabTech真空抽濾泵萊伯泰科有限公司2.試驗(yàn)方法2.1肉蓯蓉的前處理取一些干燥的肉蓯蓉飲片置于高速多功能粉碎機(jī)中，打成粉末備用。2.2肉蓯蓉多糖的提取取肉蓯蓉粉末4g，按料液比1∶8加80%乙醇，回流提取2h，抽濾，取濾渣，待濾渣自然干燥后，按料液比1∶20加蒸餾水，用保鮮膜封口預(yù)留透氣孔，置于超聲儀器提取功率175W，提取溫度70℃，超聲提取時(shí)間20min，抽濾得濾液。重復(fù)上述提取過程一次，合并兩次的濾液，濃縮至原來體積的1/4。在所得液體中加入三倍量的無水乙醇，冷藏12h。抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚沖洗，放至干燥后，稱重[9-11]。2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考張媛媛[12]繪制曲線關(guān)于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制并稍作修改精密稱取0.050g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶于去離子水，定容置500ml，得到濃度為0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，定容至100ml容量瓶。配置一定濃度內(nèi)濃度梯度內(nèi)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用苯酚-硫酸法在波長(zhǎng)488nm下測(cè)量吸光度，計(jì)算以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的多糖的提取率。取稀釋后的多糖粗溶液1ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，按以下公式計(jì)算含量。多糖含量%=×100%（式1）c為待測(cè)溶液中多糖濃度；n為稀釋倍數(shù)；v為提取液體積；m為肉蓯蓉多糖質(zhì)量。2.4單因素的確定2.4.1確定超聲時(shí)間稱取肉蓯蓉粉5份，各4g，液料比1:20，超聲功率175W，采用2.2中肉蓯蓉多糖提取方法分別超聲提取10min、15mim、20min、25min、30min，得產(chǎn)物并標(biāo)號(hào)記為1-5,計(jì)算其提取率和含量。2.4.2確定料液比稱取肉蓯蓉粉5份，各4g，提取時(shí)間20min、超聲功率175W，采用2.2中肉蓯蓉多糖提取方法分別在液料比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30得條件下進(jìn)行超聲提取，得產(chǎn)物并標(biāo)號(hào)記為6-10，計(jì)算其提取率和含量。2.4.3確定超聲功率稱取肉蓯蓉粉5份，各4g，料液比1：20、提取時(shí)間20min，采用2.2中肉蓯蓉多糖提取方法在超聲功率分別為125W、150W、175W、200W、225W條件下進(jìn)行超聲提取得產(chǎn)物并標(biāo)號(hào)記為11-15，計(jì)算其提取率和含量。2.5響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，選擇超聲波時(shí)間、料液比和超聲功率作為影響因素。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)采用DesignExpert8軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用多元二項(xiàng)回歸擬合[13]。以肉蓯蓉多糖提取率為響應(yīng)值，由F檢驗(yàn)決定，概率P值越小(F>F0)，響應(yīng)變量的顯著性越高[14]。2.6最佳條件下超聲輔助肉蓯蓉多糖提取率通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳的一組三個(gè)因素，在該因素下做三組平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算出在此條件下肉蓯蓉多糖提取率及含量。結(jié)果和分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖1可知，以葡萄糖溶液C濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=5.93C-0.0082,R2=0.9995，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02-0.10mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精度準(zhǔn)確，可以用做肉蓯蓉多糖濃度的計(jì)算。3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果3.2.1改變超聲時(shí)間提取率與含量變化圖2多糖提取率與含量隨時(shí)間變化圖從圖2看出肉蓯蓉多糖在10min-20min之間提取率和含量都逐步升高，在20min時(shí)達(dá)到峰值，超過20min以后肉蓯蓉多糖的提取率和含量都會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。原因是因?yàn)槌晻r(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致提取產(chǎn)物中部分水溶性多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞，使肉蓯蓉多糖提取率下降[15]。過長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)把肉蓯蓉多糖中其余雜質(zhì)分離出到溶液中，所以肉蓯蓉多糖含量下降。3.2.2改變料液比提取率與含量變化圖3多糖提取率與含量隨料液比變化圖由圖3知，在料液比1:10至1:20之間多糖提取率和含量逐漸升高，在料液比為1:20時(shí)達(dá)到了峰值，料液比大于1:20以后多糖的提取率和含量都都會(huì)降低。這是因?yàn)槿馍惾囟嗵窃谒械娜芙舛仁怯邢薜?，所以在其溶解度達(dá)到飽和的時(shí)候出現(xiàn)了肉蓯蓉多糖提取率和含量的峰值。但是隨著料液比持續(xù)增加，這導(dǎo)致了部分肉蓯蓉多糖重新溶解，使得多糖提取率和含量都下降。3.2.3改變超聲功率提取率與含量變化圖4多糖提取率與含量隨超聲功率變化圖從圖4上發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉多糖的提取率在125W-200W時(shí)隨著超聲功率的增加而升高，含量在125W-175W時(shí)隨超聲功率的升高而上升，分別在200W與175W時(shí)達(dá)到了峰值，到達(dá)峰值后再升高功率，肉蓯蓉多糖的提取率和含量都出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檫^高得超聲功率破壞了肉蓯蓉多糖的結(jié)構(gòu)，所以導(dǎo)致了提取率和含量的下降。3.2.4最佳條件下的提取率超聲時(shí)間20min、料液比1∶20和超聲功率200W是根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，此下肉蓯蓉多糖提取率為8.26%，含量為27.6%。3.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果3.3.1確定各因素的水平如表3，由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果推出三個(gè)因素的水平，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。表3因素及水平編碼表因素水平-101（A）超聲時(shí)間（min）152025（B）料液比（g/ml）1∶151∶201∶25（C）超聲功率（W）1752002253.3.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果將表3所設(shè)計(jì)出得因素與水平編碼輸入到DesignExpert8軟件中，由軟件根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)所選取的三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見表4表4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC多糖提取率%多糖含量%10008.2527.720008.3625.430116.2426.740008.5627.350008.8525.961104.324.87-1015.1228.08-1-103.7125.990008.7125.610-10-13.9327.211-1104.6825.9120-1-15.9626.7131-104.7526.3140-115.9827.51501-16.2927.3161015.2426.31710-15.1627.03.3.3回歸方程的建立和顯著性分析使用DesignExpert8軟件進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立適合所有變量的二次回歸方程模型。方程模型為：Y=8.55+0.25A+0.14B+0.16C-0.36AB-0.28AC-0.018BC-2.72A2-1.47B2-0.96C2表5回歸模型方差分析結(jié)果誤差源平方和自由度均方FPModel49.8195.5375.50<0.0001A0.5110.516.890.0342B0.15905C0.1910.192.620.1494AB0.5010.506.880.0343AC0.3110.314.200.0795BC1.225E-00311.225E-0030.0170.9008A231.16131.16425.14＜0.0001B29.0419.04123.37＜0.0001C23.9013.9053.270.0002殘差0.5170.073失擬誤差0.2730.0901.500.3435純誤差0.2440.060總誤差50.3216由表5可知，此模型P值＜0.0001，則表明該模型極顯著。方差的失擬誤差P值是0.3435>0.05,說明該模型失擬誤差小，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差在合理范圍內(nèi)[16]。該表中A2、B2、C2，P值均小于0.01（極顯著），A、AB，P值均小于0.05（顯著），B、C、BC，P值均大于0.05（不顯著），由方差分析可知影響肉蓯蓉多糖提取率和含量的因素里：超聲時(shí)間的影響大于超聲功率的影響，料液比的影響在前兩者之下。3.3.4最佳工藝參數(shù)的確定由上述響應(yīng)面的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取肉蓯蓉多糖的最佳因素是超聲時(shí)間20.20min，料液比1：20.21，超聲功率201.85W，提取率在這三個(gè)因素水平下預(yù)估為8.56%，含量為28.2%。結(jié)合現(xiàn)實(shí)條件將三個(gè)因素定為：提取時(shí)間20min、料液比1:20、超聲功率200W。在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)并分析其結(jié)果得肉蓯蓉多糖的平均提取率為8.32%，含量為27.8%。與預(yù)估結(jié)果8.56%和28.2%較為接近，證實(shí)了此模型可以有效的預(yù)測(cè)肉蓯蓉多糖的提取率及其含量。3.3.5分析響應(yīng)面曲面及等高線圖超聲時(shí)間、料液比、超聲功率這三個(gè)因素相互作用，從而影響了肉蓯蓉多糖的提取率。并且其中各項(xiàng)因素之間的影響程度可從響應(yīng)面圖中看出。在響應(yīng)面圖中，曲線越彎曲代表該因素對(duì)肉蓯蓉多糖提取率的影響越大，當(dāng)?shù)雀呔€為橢圓時(shí)，說明所選因素之間的相互作用顯著。當(dāng)?shù)雀呔€為圓形時(shí)，說明相互作用不顯著[17-19]。圖5超聲時(shí)間和料液比互交結(jié)果由圖5可知，肉蓯蓉多糖的提取率隨超聲時(shí)間和料液比的增大而增大；當(dāng)多糖提取率達(dá)到最高點(diǎn)后。肉蓯蓉多糖的提取率開始呈下降趨勢(shì)，響應(yīng)面圖的弧度較大，說明超聲時(shí)間與料液比這兩個(gè)因素對(duì)肉蓯蓉多糖的提取率有較大影響。圖中圓形的等高線說明超聲時(shí)間與料液比相互作用不顯著。等高線在超聲時(shí)間軸的變化集中，則說明超聲時(shí)間與料液比影響效果顯著。圖6超聲時(shí)間和超聲功率互交結(jié)果由圖6可知，肉蓯蓉多糖的提取率隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加而增加，當(dāng)多糖提取率達(dá)到最高點(diǎn)后，再延長(zhǎng)超聲時(shí)間或增加超聲功率，肉蓯蓉多糖的提取率開始降低。圖中的輪廓趨近于橢圓形，所以，超聲時(shí)間和超聲功率兩個(gè)因素之間的相互作用顯著性高。根據(jù)響應(yīng)面兩側(cè)的彎曲程度，響應(yīng)面3D曲面圖坡度較大，結(jié)果表明，超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)肉蓯蓉多糖的提取率有較大影響。圖7料液比和超聲功率互交結(jié)果由圖7可知，肉蓯蓉多糖的提取率隨料液比和超聲功率的增大而增大。當(dāng)多糖提取率達(dá)到最高點(diǎn)后，繼續(xù)增大料液比和超聲功率則會(huì)降低多糖得提取率。圖中輪廓呈橢圓形，所以超聲功率與料液比的相互作用明顯，從圖中可以看出，響應(yīng)面的坡度比較平緩，則說明這兩個(gè)因素對(duì)肉蓯蓉多糖提取率影響不大。4討論肉蓯蓉多糖在我們的日常生活中十分重要，根據(jù)研究數(shù)據(jù)結(jié)果表明肉蓯蓉多糖具有抗氧化、降低血糖、預(yù)防癌癥、提高免疫力的作用[20]。提取肉蓯蓉多糖的方法有酶解法、酸提取法和水提醇沉法等。酶解法提取肉蓯蓉多糖會(huì)加入蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的去除效果差；酸提取法中，酸性物質(zhì)會(huì)斷裂糖苷鍵從而使多糖的提取率降低，所以本實(shí)驗(yàn)使用水提醇沉法提取肉蓯蓉多糖；水提醇沉法的操作簡(jiǎn)單，成本低、安全高效，所以時(shí)常被使用在中藥制劑的研發(fā)中。我國(guó)中藥生產(chǎn)企業(yè)將水提醇沉法作為首選。醇沉可以減少人們服用中藥的劑量；乙醇同時(shí)也具有殺滅病菌的作用，通過醇沉處理的中藥材不會(huì)輕易變質(zhì)。肉蓯蓉多糖是一種水溶性多糖，水溶性多糖不溶于乙醇，因此可以將肉蓯蓉多糖從提取物中分離出來。所以采用水提醇沉法提取肉蓯蓉多糖[21]。本試驗(yàn)主要將超聲時(shí)間、料液比、超聲功率三個(gè)因素各自作為變量，探求在改變超聲條件下肉蓯蓉多糖提取率及其含量的變化。同時(shí)考察三個(gè)因素下最佳條件時(shí)超聲輔助提取肉蓯蓉多糖提取率為8.32%，含量為27.8%為進(jìn)一步對(duì)肉蓯蓉多糖的資源利用供理論依據(jù)，發(fā)掘肉蓯蓉更多使用價(jià)值。5結(jié)論本實(shí)驗(yàn)以肉蓯蓉為原料，用水提醇沉法超聲輔助提取肉蓯蓉多糖，再結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，采用DesignExpert8軟件，設(shè)計(jì)出提取工藝條件。建立了所選取的3個(gè)因素與肉蓯蓉多糖提取率和含量之間的模型關(guān)系式，確定了最佳提取工藝條件為：超聲時(shí)間20min，料液比1:20（g/mL），超聲功率200W，在這些條件下獲得的肉蓯蓉多糖的提取率為8.32％，含量為27.8％。該優(yōu)化方案提取時(shí)間短，多糖提取率高，是有效可行的。參考文獻(xiàn)[1]高建德,劉雄,朱曉玉,等.復(fù)合酶提取肉蓯蓉多糖的工藝優(yōu)化與動(dòng)力學(xué)分析[J].甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,34(5):26-30.[3]WuY,LiL,WenT,etal.Protectiveeffectsofechinacosideoncarbontetrachlorideinducedhepatotoxicityinrats[J].Toxicology,2007,232:50-56．[4]夏美茹,張青,孫志惠,等.肉蓯蓉中功能因子測(cè)定及提取研究進(jìn)展[J].行業(yè)綜述,2020,15(7):22-25.[5]王嘉,楊雯,王棟,等.肉蓯蓉屬多糖的提取及含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué),2019,17(7):1055-1059.[6]斯琴巴特爾,劉杰,等.淺談肉蓯蓉的臨床價(jià)值及人工種植情況[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2019,19(93):260,271.[8]劉雄,李成明,高建德,等.肉蓯蓉的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2013,20(5):575-577.[9]丁玲,王東,張中林,等.不同商品地山藥多糖含量的分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,11(4):187-188.[10]李蕓芳,李竣.天然藥物化學(xué)開放性實(shí)驗(yàn)教改初探-以皺皮木瓜多糖提取及單糖組成測(cè)定為例[J].綠色科技,2019(17):264-267.[11]