37Real-timefluorescencequantitativeRT-PCR/PCRdetectiontechniqueforfoot-and-mouthdiseasevirus,bovineviraldiarrheavirusandrhinotracheitisvirusinaerosoloflarge-scalecattlefarms2021-12-27發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。1規(guī)?；?chǎng)氣溶膠中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR/PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物4縮略語25.1除非另有說明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，水應(yīng)符合GB/T5.2體積比25:24的酚：氯仿溶液，應(yīng)2℃~8℃保存見A.1。5.3體積比24:1的氯仿：異戊醇溶液，應(yīng)2℃~8℃保存見A.2。5.7TE緩沖液，配制見A.6。錄B。6.4冰箱，2℃~8℃和-20℃兩種。應(yīng)用空氣微生物采樣箱，使用國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI采集樣本。樣品采集后立即用1%甲醛溶液滅活處理。3所提取物為氣溶膠采集液，可能含有病毒。操作者必須帶口罩和一次性手套，RNA提取盡量在人少），可采用經(jīng)驗(yàn)證的病毒RNA提），13000r/min、15min，取上），可采用經(jīng)驗(yàn)證的病毒核酸提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提避免移液器取樣損失，建議按n+1個(gè)反應(yīng)配制，計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分4在樣品處理區(qū)進(jìn)行。分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟中制備的RNA溶液5μL和9結(jié)果判定9.1結(jié)果分析條件的設(shè)定9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.3結(jié)果判定檢測(cè)通道均無Ct值，且無特征性擴(kuò)增曲線，9.3.3可疑5溶液配制取Tris-飽和酚有機(jī)相（下層溶液）50mL和氯仿48mL混勻，2℃~8℃保存。取氯仿48mL和異戊醇2mL混勻，2℃~8℃保存。A.30.5mol/LTris-HCl(pH稱取6.055gTris置于100mL燒杯中，加A.40.5mol/LEDTA（pH加0.1%DEPC水定容至50mL，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存。A.72mol/LNaAc（PH5.6ATGACACAGGAAAACATTCCFermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板7/30sec，72℃/30sec，33個(gè)循環(huán)；第三階段，72℃/5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的取牛病毒性腹瀉病毒細(xì)胞培養(yǎng)物200μL，參照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasReverFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)液見序結(jié)果BLAST比對(duì)同B.3，正確的重組質(zhì)粒命名為pEAST-T3-BVDV，作為檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的陽性質(zhì)B.5牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)取牛傳染性鼻氣管炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物200μL，參照7.2.2提取病毒DNA。以牛傳染性鼻氣管炎病載體克隆、重組質(zhì)粒篩選、DNA測(cè)序及測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)同B.3，正確的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為pEAST-T3-IBRV，作為檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)8空氣微生物采樣箱，Porton空氣微生物采樣器，三），設(shè)備安裝：首先安裝三腳架，空氣微生物采樣器放置高度為距地面1.5m，將30mL滅菌氣口上，另一端連接到Porton空氣微生物采樣器收集參數(shù)：采用液體沖擊式采樣方式，采樣流量為12.5L/min，采樣時(shí)間為30min。收集標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)牧場(chǎng)一般在產(chǎn)房、動(dòng)物房、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和奶廳4個(gè)位置樣品的滅活處理與分裝：氣溶膠采樣器采集結(jié)束后，直接將30mL樣本收集到50mL離心管內(nèi)，采樣送往有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，采集的兩份樣品，一份用于直接檢測(cè)，另一份-20℃保存氣溶膠現(xiàn)場(chǎng)采集完畢