柳葉蠟梅（ChimonanthussalicifoliusH.H.Hu）是中國(guó)特有的一種半常綠灌木，主要分布在浙江省中南部、安徽省南部和江西省北部等地，是少數(shù)兼具觀賞性、食用性和藥理活性的植物[1-2]。研究表明，柳葉蠟梅葉中含有豐富的揮發(fā)油類物質(zhì)，而揮發(fā)油是柳葉蠟梅的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，具有消炎殺菌、抗病毒、抗氧化和提高機(jī)體免疫力等功效[3-6]，具有很大的開發(fā)潛力。目前，對(duì)柳葉蠟梅揮發(fā)油的研究主要集中在成分分析[7-12]方面，對(duì)于同時(shí)使用3種方法提取柳葉蠟梅揮發(fā)油的化學(xué)成分、抗氧化和抑菌性差異的研究較少。本研究旨在利用揮發(fā)油提取器法、同時(shí)蒸餾萃取法、水蒸氣蒸餾法提取柳葉蠟梅中的揮發(fā)油，并通過(guò)比較其得率、化學(xué)成分、抗氧活化和抑菌活性差異，為柳葉蠟梅的進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供參考。1材料與方法1.1材料與儀器1.1.1材料與試劑柳葉蠟梅干葉，慶元縣三禾元農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、黑曲霉菌（Aspergillusniger）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），杭州武洋生物科技有限公司。正己烷，分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)diammonuimsalt，ABTS]，高純?cè)噭?，合肥博美生物科技有限?zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，生物試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。1.1.2儀器與設(shè)備水蒸氣發(fā)生裝置，揮發(fā)油測(cè)定儀（規(guī)格5mL，精度0.1mL），四川蜀牛玻璃儀器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置，天長(zhǎng)市康鵬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（雙光束），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，AgilentTechnologiesInc。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1柳葉蠟梅揮發(fā)油的提取方法（1）揮發(fā)油提取器法提取柳葉蠟梅揮發(fā)油。取柳葉蠟梅干葉粉碎，過(guò)40目篩，稱取100g粉末置于2L蒸餾瓶中，加入12倍量的純水，充分浸泡混合，連接揮發(fā)油提取裝置。從冷凝管上端敞口處添加純水直到?jīng)]過(guò)揮發(fā)油提取器刻度線，電熱套170℃加熱10h，待冷卻后打開活塞收集揮發(fā)油，加入適量無(wú)水硫酸鈉于收集的揮發(fā)油中以去除水分[13]，濾出無(wú)水揮發(fā)油，稱重，計(jì)算揮發(fā)油得率。（2）同時(shí)蒸餾萃取法提取柳葉蠟梅揮發(fā)油。稱取100g柳葉蠟梅粉末置于2L蒸餾瓶中，加入12倍量的純水，充分浸泡混合，將含物料的2L蒸餾瓶置于同時(shí)蒸餾萃取裝置的重相一端，電熱套170℃加熱；量取200mL正己烷置于同時(shí)蒸餾萃取裝置輕相一端，水浴50℃加熱。連續(xù)提取10h后，收集萃取液，加入適量無(wú)水硫酸鈉于萃取液中以去除水分，過(guò)濾，20℃減壓濃縮，收集揮發(fā)油，稱重，計(jì)算揮發(fā)油得率。（3）水蒸氣蒸餾提取柳葉蠟梅揮發(fā)油。稱取100g柳葉蠟梅粉末置于2L蒸餾瓶中，連接至水蒸氣發(fā)生裝置，蒸餾提取10h。收集餾出液，用適量正己烷萃取3次，合并萃取液，20℃減壓濃縮，收集揮發(fā)油，稱重，計(jì)算揮發(fā)油得率。（4）揮發(fā)油得率計(jì)算。計(jì)算提取率，提取率=柳葉蠟梅揮發(fā)油質(zhì)量/柳葉蠟梅粉末總質(zhì)量×100%，每種方法平行操作6次。1.2.2GC-MS分析（1）GC條件。進(jìn)樣口溫度：230℃，進(jìn)樣量：1μL，分流比為20∶1，色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）。升溫程序：初始溫度為70℃，以10℃·min-1升至280℃，保持5min。（2）MS條件。電子電離源，離子源溫度150℃；溶劑延遲2min，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為50～500amu。采用NISTMSSearch2.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行揮發(fā)性成分的定性分析。經(jīng)CA-074預(yù)處理后再加LPS刺激，相比于單純使用LPS刺激，CA-074+LPS組小鼠的肝組織變性壞死顯著減輕，肝組織膨脹明顯緩解，僅有少量空泡存在。1.2.3抗氧化活性測(cè)定本研究選取DPPH法和ABTS法對(duì)柳葉蠟梅揮發(fā)油的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T39100—2020[14]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。（1）DPPH法測(cè)定抗氧化活性。DPPH法的實(shí)驗(yàn)原理為揮發(fā)油中抗氧化成分提供的1個(gè)電子可與DPPH·自由基配對(duì)結(jié)合，使DPPH·自由基的特征性紫色變?yōu)闊o(wú)色或黃色，而后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)后的吸光度，可以用來(lái)判定揮發(fā)油的抗氧化能力。稱取DPPH用適量無(wú)水乙醇避光超聲充分溶解，用無(wú)水乙醇配制成5μg·mL-1的DPPH溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取柳葉蠟梅揮發(fā)油用無(wú)水乙醇配制成1mg·mL-1、3mg·mL-1、5mg·mL-1、10mg·mL-1、15mg·mL-1、20mg·mL-1、30mg·mL-1和40mg·mL-1的供試品溶液。每個(gè)濃度下，取3只試管，第一支中加入1mL樣品溶液，3mLDPPH溶液，第二支中加入1mL樣品溶液，3mL無(wú)水乙醇，第三支加入1mL無(wú)水乙醇，3mLDPPH溶液，室溫避光反應(yīng)60min，于517nm處測(cè)定吸光度，分別為A1、A0、A2，DPPH的自由基清除率=[1-（A1-A0）/A2]×100%。以清除率（Y）對(duì)藥物濃度（X）進(jìn)行回歸擬合[15]，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度（IC50）。（2）ABTS法測(cè)定抗氧化活性。揮發(fā)油中抗氧化成分與ABTS-自由基反應(yīng)后使其褪色，在734nm處的吸光值降低，反應(yīng)后的吸光度用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定，來(lái)判定揮發(fā)油的抗氧化能力。稱取ABTS母液，用95%乙醇稀釋至吸光度值在0.7±0.02（OD734nm），作為測(cè)定溶液，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。取柳葉蠟梅揮發(fā)油用無(wú)水乙醇配制成1mg·mL-1、3mg·mL-1、5mg·mL-1、10mg·mL-1、15mg·mL-1、20mg·mL-1、30mg·mL-1和40mg·mL-1的供試品溶液。每個(gè)濃度下，取兩支試管，第一支中加入0.4mL樣品溶液，3.6mLABTS溶液，室溫避光反應(yīng)5min，第二支中加入0.4mL無(wú)水乙醇，3.6mLABTS溶液，室溫避光反應(yīng)5min，于734nm處測(cè)定吸光度，分別為A1、A0，自由基清除率=[（A0-A1）/A0]×100%。以清除率（Y）對(duì)藥物濃度（X）進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度（IC50）。1.2.4抑菌性測(cè)定（1）菌種活化及菌懸液制備。于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和黑曲霉菌5種菌種磁珠，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h，真菌在28℃下培養(yǎng)48h后，分別挑取對(duì)應(yīng)菌落轉(zhuǎn)接在0.9%的無(wú)菌生理鹽水中，制成106～107CFU·mL-1的菌懸液，備用。1.3數(shù)據(jù)處理提取實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。采用NISTMSSearch2.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行揮發(fā)性成分的定性分析，按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算求得各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量。采用WPS表格對(duì)抗氧化和抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。2結(jié)果與分析2.1不同方法的提取率不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油提取率見表1，所提取的揮發(fā)油均為淡黃色油狀物，其中，揮發(fā)油提取器法的提取率最高，蒸餾萃取法次之，水蒸氣蒸餾法得率最低。表1不同方法提取的揮發(fā)油提取率表2.2柳葉蠟梅揮發(fā)油的化學(xué)成分對(duì)不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，3種方法的總離子流色譜圖見圖1、圖2、圖3，不同方法提取的揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量見表2。由圖1、圖2、圖3和表2可知，3種提取方法鑒定出的化學(xué)成分差異較小，而相對(duì)含量差別較大。揮發(fā)油提取器法鑒定出22種化合物，占揮發(fā)油含量的99.33%，含量排在前5的成分依次為桉葉油醇（48.593%）、黑蟻素（14.34%）、喇叭烯氧化物-(I)（8.006%）、石竹素（7.309%）、α-蒎烯（3.777%）。同時(shí)蒸餾萃取法鑒定出24種化合物，占揮發(fā)油含量的98.968%，含量排在前5的成分依次為桉葉油醇（41.994%）、黑蟻素（16.884%）、石竹素（9.126%）、喇叭烯氧化物-(I)（7.670%）、γ-欖香烯（3.071%）。水蒸氣蒸餾法鑒定出27種化合物，含量排在前5的成分依次為桉葉油醇（29.378%）、黑蟻素（20.495%）、喇叭烯氧化物-(I)（11.003%）、石竹素（10.063%）、γ-欖香烯（3.946%）。3種提取方法共鑒定出28種化合物，共有化合物有21種，相對(duì)含量比例不同，21種共有成分相對(duì)含量分別為99.333%、98.116%、96.275%，高含量的共有成分中，黑蟻素、石竹素具有較高的藥理活性。水蒸氣蒸餾法鑒定出成分多于其他2種方法。圖1揮發(fā)油提取器法譜圖圖2水蒸氣蒸餾法譜圖圖3同時(shí)蒸餾萃取法譜圖表2不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量表2.3柳葉蠟梅揮發(fā)油的抗氧化性2.3.1柳葉蠟梅揮發(fā)油的DPPH自由基清除能力由圖4可知，3種方法提取的揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除率與劑量呈現(xiàn)出依賴關(guān)系。對(duì)數(shù)回歸方程及IC50值見表3。由圖4和表3可知，3種方法提取的揮發(fā)油清除DPPH自由基能力為水蒸氣蒸餾法＞同時(shí)蒸餾萃取法＞揮發(fā)油提取器法。圖4不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油清除DPPH自由基能力圖表3不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基能力對(duì)數(shù)回歸方程及IC50值表2.3.2柳葉蠟梅揮發(fā)油的ABTS自由基清除能力不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油清除ABTS自由基能力見圖5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，3種方法提取的揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除率與劑量呈現(xiàn)出依賴關(guān)系。對(duì)數(shù)回歸方程及IC50值見表4。由圖5和表4所得，3種方法提取的揮發(fā)油清除ABTS自由基能力為水蒸氣蒸餾法＞同時(shí)蒸餾萃取法＞揮發(fā)油提取器法。圖5不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油清除ABTS自由基能力圖表4不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油對(duì)ABTS自由基能力對(duì)數(shù)回歸方程及IC50值表2.4柳葉蠟梅揮發(fā)油的抑菌性由表5可知，3種方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制作用，對(duì)大腸埃希氏菌和霉菌無(wú)明顯抑制作用。其中，揮發(fā)油提取器法和水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最為明顯，同時(shí)蒸餾萃取法提的揮發(fā)油對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑制作用最為明顯。表5不同方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油對(duì)5種菌的抑菌圈直徑表3結(jié)論與討論采用揮發(fā)油提取器法、同時(shí)蒸餾萃取法、水蒸氣蒸餾法3種方法對(duì)柳葉蠟梅揮發(fā)油進(jìn)行提取；采用GC-MS對(duì)3種柳葉蠟梅揮發(fā)油成分進(jìn)行分析；以對(duì)DPPH自由基能力和ABTS自由基清除能力作為判定指標(biāo)，研究3種揮發(fā)油體外抗氧化活性；以抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究3種揮發(fā)油體外抑菌性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用揮發(fā)油提取器法提取柳葉蠟梅揮發(fā)油得率較高，同時(shí)蒸餾萃取法和水蒸氣蒸餾法得率稍低，可能與提取后萃取濃縮損耗有關(guān)。3種方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油化學(xué)成分均以萜類化合物為主，其中以桉葉油醇含量最高，與楊華等[8]、史小娟等[17]研究結(jié)果類似。其中，以水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油鑒定出的化合物種類最多。3種方法提取的柳葉蠟梅揮發(fā)油均有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與揮發(fā)油濃度呈正相關(guān)關(guān)系，3種方法提取的揮發(fā)油對(duì)抗氧化活性大小順序均為水蒸氣蒸餾法＞同時(shí)蒸餾萃取法＞揮發(fā)油提取器法，可能與揮發(fā)油中黑蟻素含量有關(guān)，研究表明[18]，黑蟻素具有一定的抗氧化性。3種揮發(fā)油成分中，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油黑蟻素相對(duì)含量占比最高。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種方法