PAGE7-血紅蛋白的提取和分別[基礎(chǔ)對點(diǎn)]學(xué)問點(diǎn)一蛋白質(zhì)分別的原理和方法1.分別不同種類的蛋白質(zhì)依據(jù)的原理不包括()A．分子的形態(tài)和大小B．所帶電荷的性質(zhì)和多少、吸附性質(zhì)C．對其他分子的親和力D．蛋白質(zhì)分子的組成元素答案D解析分別不同種類的蛋白質(zhì)依據(jù)的原理包括分子的形態(tài)和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、吸附性質(zhì)、對其他分子的親和力和蛋白質(zhì)分子的溶解度等。蛋白質(zhì)分子的組成元素不是分別不同蛋白質(zhì)的依據(jù)。2．利用凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的原理是()A．蛋白質(zhì)分子與凝膠的親和力的大小B．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小C．蛋白質(zhì)所帶電荷的多少D．蛋白質(zhì)溶解度的大小答案B解析凝膠色譜法是依據(jù)相對分子質(zhì)量的大小來分別蛋白質(zhì)的有效方法，相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程長，移動(dòng)的速度慢，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動(dòng)的速度快，因此相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)得以分別。3．下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是()A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測樣品中各種分子的形態(tài)、大小及帶電性質(zhì)的差異等會(huì)影響其在電泳中的遷移速度C．進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D．常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳答案C解析電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程，在電場的作用下，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)，A正確，C錯(cuò)誤；由于待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形態(tài)的不同，會(huì)使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別，B正確；瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是兩種常見的電泳方法，D正確。4．SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳法中加入SDS的作用是()A．增大蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量B．使蛋白質(zhì)完全變性失活C．掩蓋不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別D．削減蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量答案C解析SDS的作用是使蛋白質(zhì)完全變性，SDS所帶負(fù)電荷量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋不同種類蛋白質(zhì)間電荷差別。學(xué)問點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分別試驗(yàn)操作5.分別血紅蛋白時(shí)，將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層。下列描述中，正確的是()A．第1層為無色透亮的甲苯層B．第2層為紅色透亮層，含血紅蛋白C．第4層為白色薄層固體，是脂溶性沉淀物D．第3層為暗紅色沉淀物，含未裂開的細(xì)胞答案A解析第1層為無色透亮的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層；第3層是紅色透亮液體，是血紅蛋白的水溶液；第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。6．關(guān)于凝膠色譜柱的裝填，除哪項(xiàng)外均為正確說明()A．交聯(lián)葡聚糖凝膠(G－75)“G”表示凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分別范圍，75表示凝膠得水值B．色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)覺有氣泡，必需重裝C．用300mL物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12hD．凝膠用自來水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液答案D解析本試驗(yàn)中運(yùn)用的交聯(lián)葡聚糖凝膠(G－75)，其中G表示凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分別范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g，A正確；氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果，因此，一旦發(fā)覺有氣泡，必需重裝，B正確；在凝膠色譜柱裝填完之后，應(yīng)在約50cm高的操作壓下，用300mL物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12小時(shí)，以使凝膠裝填緊密，C正確；凝膠溶脹時(shí)，應(yīng)運(yùn)用蒸餾水將其充分溶脹，制成凝膠懸浮液，D錯(cuò)誤。7．下列對在凝膠色譜柱上加入樣品和洗脫的操作的敘述，不正確的是()A．加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B．讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面C．打開下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后干脆連接緩沖液洗脫瓶起先洗脫D．待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集答案C解析待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，當(dāng)心加入緩沖液到適當(dāng)高度，之后再連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。8．在血紅蛋白的整個(gè)提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是()A．防止血紅蛋白被氧化B．血紅蛋白是一種兩性物質(zhì)，須要酸中和C．磷酸緩沖液會(huì)加速血紅蛋白的提取過程D．讓血紅蛋白處在肯定的pH范圍內(nèi)，維持其結(jié)構(gòu)和功能答案D解析在血紅蛋白的提取過程中，利用磷酸緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境，維持血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于視察(紅色)和探討(活性)。9．下列是有關(guān)血紅蛋白的提取和分別的相關(guān)操作，其中正確的是()A．可采集豬血作為試驗(yàn)材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時(shí)起先收集流出液答案A解析為防止紅細(xì)胞吸水漲破，洗滌時(shí)要用生理鹽水，B錯(cuò)誤；釋放出血紅蛋白后，以2000r/min的速度離心10min，C錯(cuò)誤；在分別時(shí)，要等到紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)起先收集流出液，D錯(cuò)誤。10．下列有關(guān)提取和分別豬血紅蛋白的試驗(yàn)，敘述錯(cuò)誤的是()A．用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，以防止紅細(xì)胞裂開B．用蒸餾水和甲苯處理紅細(xì)胞，使其釋放出血紅蛋白C．用生理鹽水透析血紅蛋白溶液，以保持血紅蛋白活性D．用磷酸緩沖液洗脫，有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動(dòng)答案C解析洗滌紅細(xì)胞時(shí)要用生理鹽水，以防止紅細(xì)胞裂開，A正確；在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞裂開，釋放出血紅蛋白，B正確；透析用的是磷酸緩沖液，C錯(cuò)誤；洗脫用的是磷酸緩沖液，有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動(dòng)，D正確。[實(shí)力提升]11．已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質(zhì)，其分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量狀況如圖所示。下列敘述正確的是()A．將樣品裝入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲也保留在袋內(nèi)B．若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，則用凝膠色譜柱分別時(shí)，甲的移動(dòng)速度最快C．將樣品以2000r/min的速度離心10min，若分子戊存在于沉淀中，則分子丙也存在于沉淀中D．若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分別樣品中的蛋白質(zhì)分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最遠(yuǎn)答案C解析透析的原理是相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)能透過半透膜，相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)不能透過，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲不肯定保留在袋內(nèi)，A錯(cuò)誤；用凝膠色譜柱分別蛋白質(zhì)時(shí)，相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)通過的路程長、移動(dòng)慢，B錯(cuò)誤；離心時(shí)相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)沉淀，若分子戊沉淀，則分子乙、丁、丙均已沉淀，C正確；用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分別蛋白質(zhì)時(shí)，電泳遷移率完全取決于分子大小，故電泳帶相距最遠(yuǎn)的是甲和丙，D錯(cuò)誤。12．凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡潔的分別技術(shù)，由于設(shè)備簡潔、操作便利，不須要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很好的分別效果，目前已經(jīng)在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)試驗(yàn)探討，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題：(1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是________，緣由是_______________________________________________________________。(2)自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由________________替代。(3)裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，緣由是______________________________________________________。(4)洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體________(填“相同”或“不同”)，洗脫時(shí)，對洗脫液的流速要求是________________________________。答案(1)aa相對分子質(zhì)量較大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快(2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗(3)氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果(4)相同保持穩(wěn)定解析用凝膠色譜技術(shù)分別各種大分子物質(zhì)時(shí)，大分子物質(zhì)先洗脫出來，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來。在色譜柱制作時(shí)可用尼龍網(wǎng)和尼龍紗代替多孔板。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果。洗脫時(shí)要用與浸泡凝膠的液體相同的液體，流速要穩(wěn)定。13．血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2或CO2的運(yùn)輸。請依據(jù)血紅蛋白的提取和分別流程圖回答問題。(1)將試驗(yàn)流程補(bǔ)充完整：A為________________，B為________________。凝膠色譜法是依據(jù)__________________來分別蛋白質(zhì)的有效方法。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除________，洗滌次數(shù)過少，無法完全除去；離心速度過高和時(shí)間過長會(huì)使________一同沉淀，達(dá)不到分別的效果。洗滌干凈的標(biāo)記是______________________________。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是______________。(3)在洗脫過程中加入物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液(pH為7.0)的目的是____________________________________________。假如紅色區(qū)帶______________，說明色譜柱制作勝利。答案(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對分子質(zhì)量的大小(2)雜蛋白(或血漿蛋白)白細(xì)胞離心后的上清液不再呈現(xiàn)黃色蒸餾水和甲苯(3)加速樣品在凝膠柱中的流淌勻稱一樣地移動(dòng)解析(1)樣品處理及粗分別過程為：紅細(xì)胞的洗滌→血紅蛋白的釋放→分別血紅蛋白溶液→透析，凝膠色譜操作過程為：凝膠色譜柱的制作→凝膠色譜柱的裝填→樣品的加入和洗脫，所以A表示血紅蛋白的釋放，B表示樣品的加入和洗脫，凝膠色譜法的原理是分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流淌快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流淌慢。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜質(zhì)蛋白，以利于后續(xù)步驟的分別純化，洗滌次數(shù)少，無法除去血漿蛋白，此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈，由于甲苯是表面活性劑的一種，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞裂開，蒸餾水能使紅細(xì)胞漲破。(3)磷酸緩沖液(pH為7.0)能夠模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)的一樣，洗脫時(shí)利用緩沖液，可以加快樣品在凝膠柱中的流淌，假如凝膠色譜柱裝填得很勝利、分別操作也正確的話，能清晰地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶勻稱、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；假如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分別的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。14．紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成的，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2和CO2。我們可以選用豬、牛、羊或其他哺乳動(dòng)物的血液進(jìn)行試驗(yàn)，來提取和分別血紅蛋白。依據(jù)材料回答下列問題：(1)試驗(yàn)前取簇新血液，要在采血器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，立刻進(jìn)行裂開離心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的是__________________________________________________________。(2)在對樣品進(jìn)行處理時(shí)，主要包括______________、血紅蛋白的釋放；對樣品進(jìn)行粗分別時(shí)主要包括：分別血紅蛋白溶液、透析等步驟。其中透析技術(shù)的原理是_______________________________。(3)同學(xué)甲利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，將得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分別，在電泳過程中，影響蛋白質(zhì)遷移速度的因素包括蛋白質(zhì)分子的________、________以及分子的形態(tài)等。而加入SDS后，使得蛋白質(zhì)的遷移率只取決于____________。(4)同學(xué)乙利用凝膠色譜法進(jìn)行血紅蛋白的分別(如圖1)，他在操作中加樣的正確依次是________，在執(zhí)行圖1中②所示操作時(shí)，色譜柱下端連接的尼龍管應(yīng)當(dāng)________(填“打開”或“關(guān)閉”)。(5)圖2是同學(xué)乙利用樣品分別得到的結(jié)果，則圖2中蛋白質(zhì)分子量最小的是________。答案(1)防止血液凝固(2)紅細(xì)胞的洗滌小分子可以自由進(jìn)出透析袋(半透膜)，而大分子不能通過(3)大小帶電性質(zhì)分子的大小(4)④①②③關(guān)閉(5)丙解析(1)簇新血液中加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固。(2)樣品的處理包括紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放等步驟。分別血紅蛋白所用的透析方法的原理是半透膜的半透性，即小