QB/TXXX—20XX蛋白酶活力的測(cè)定本文件規(guī)定了醬油和黃豆醬的菌種、種曲、成曲酶活力的測(cè)定方法。本文件適用于醬油和黃豆醬的菌種、種曲、成曲酶活力的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義3.1中性蛋白酶活力單位neutralproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為7.2的條件下，在1min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個(gè)中性蛋白酶活力單位。3.2酸性蛋白酶活力單位acidicproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為3.0的條件下，在1min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個(gè)酸性蛋白酶活力單位。3.3堿性蛋白酶活力單位alkalineproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為10.5的條件下，在1min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個(gè)堿性蛋白酶活力單位。4原理蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等在堿性條件下，可將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。采用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)660nm）測(cè)定其吸光度，進(jìn)而計(jì)算蛋白酶活力。5試劑和材料5.1試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。5.1.1鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）。QB/TXXX—20XX5.1.2鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）。5.1.3硫酸鋰（Li2SO4）。5.1.4溴（Br）。5.1.5無水碳酸鈉（Na2CO3）。5.1.6三氯乙酸（CCl3COOH）。5.1.7磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H20）。5.1.8硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）5.1.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。5.1.10干酪素。5.1.11氫氧化鈉（NaOH）。5.1.12酪氨酸（C9H11NO3）。5.1.13鹽酸（HCl）。5.1.14乳酸（C3H6O3）。5.1.15乳酸鈉（C3H5NaO3）。5.2試劑配制5.2.1福林試劑（Folin試劑可購買市售產(chǎn)品或自行配制，配制方式為：于2000mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸160mL，文火回流10h。取去冷凝器，緩慢加入硫酸鋰（Li2SO4）50g（防止過熱狀態(tài)下加入硫酸鋰反應(yīng)劇烈，導(dǎo)致溶液噴出）、水50mL，混勻，加入2～3滴液溴，再煮沸15min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加2～3滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL，用細(xì)菌漏斗（No4～5）或中性濾紙過濾，置于棕色瓶中保存，有效期為1年。此溶液使用時(shí)加2倍水稀釋，即成已稀釋的福林試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。5.2.2碳酸鈉溶液（0.4mol/L）：稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，定容至1000mL。5.2.3三氯乙酸（TCA）溶液（0.4mol/L）：稱取三氯乙酸（CCl3COOH）65.4g，定容至1000mL。5.2.4磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H20）31.2g，定容至1000mL，即成A液。稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.63g，定容至1000mL，即為B液。取A液28mL和B液72mL，再用水稀釋1倍，即為磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）。5.2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）:稱取80%～90%乳酸10.6g，定容至1000mL，即成A液。稱取70%乳酸鈉16g，定容至1000mL，即為B液。取A液16mL和B液1mL，再用水稀釋1倍，即為乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）。5.2.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5）：稱取硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）9.54g，氫氧化鈉（NaOH）1.60g，加水900mL，攪拌均勻，用1mol/L鹽酸溶液或0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至10.5±0.05，定容至1000mL。5.2.7酪蛋白溶液（0.2g/L準(zhǔn)確稱取干酪素2g（精確至0.002g加入氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）10mL并在水浴中加熱使溶解（必要時(shí)用小火加熱煮沸然后用磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）定容至100mL即成，此溶液用于檢測(cè)中性蛋白酶活力。配制時(shí)將磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）更換為乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）或硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5），則對(duì)應(yīng)的酪蛋白溶液分別用于檢測(cè)酸性蛋白酶活力、堿性蛋白酶活力。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，否則極易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)，保存期不超過三天。5.2.8酪氨酸溶液（100μg/mL準(zhǔn)確稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g（精確至0.0001g逐步加入6mL鹽酸溶液（1mol/L）使其溶解，用鹽酸溶液（0.2mol/L）定容至100mL，其濃度為1000μg/mL，再吸取此液10mL，以鹽酸溶液（0.2mol/L）定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。6儀器和設(shè)備6.1天平：感量為0.1mg。6.2分光光度計(jì)：波長(zhǎng)660nm。QB/TXXX—20XX6.3恒溫水浴鍋。6.4移液管：1mL、2mL、5mL、10mL等。7分析步驟7.1中性蛋白酶活力的測(cè)定7.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按表1配制不同濃度的酪氨酸溶液，并分別吸取1mL酪氨酸溶液于1～6號(hào)試管中，分別加入碳酸鈉（0.4mol/L）5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后于40℃±1℃水浴中保溫發(fā)色20min。保溫結(jié)束后立即取出，采用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)660nm）測(cè)定吸光度，測(cè)定三次并取平均值。將1～6號(hào)試管所測(cè)得的吸光度減去1號(hào)試管所測(cè)得的吸光度，則為凈吸光度。以凈吸光度為橫坐標(biāo)，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用線性回歸方程計(jì)算吸光度為1時(shí)酪氨酸的量（即K值）。K值應(yīng)在95～100范圍內(nèi)，否則需重新按照6.1的要求進(jìn)行操作。表1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成分成分試管編號(hào)123456100μg/mL酪氨酸溶液，mL02468用水定容的體積，mL86420酪氨酸最終濃度，μg/mL04060807.1.2樣品稀釋液的制備7.1.2.1酶制劑稱取酶制劑樣品0.100g（精確至0.001g加入磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）并定容至100mL；吸取稀釋液5mL，加入磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）稀釋至25mL，即成5000倍的樣品稀釋液。7.1.2.2成曲酶稱取充分研細(xì)的成曲樣品5g（精確至0.001g），加水至100mL，于40℃±1℃水浴中保溫1h，期間每隔20min攪拌1次。保溫結(jié)束后立即取出，用磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）定容至適當(dāng)體積（根據(jù)酶活力確定定容體積），搖勻后采用中速定性濾紙過濾，濾液備用。7.1.3樣品測(cè)定取15×100mm試管3支，編號(hào)1、2、3（也可做2只），分別加入樣品稀釋液1mL，置于40℃±1℃水浴預(yù)熱2min，再加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白溶液（0.2g/L）1mL，再次置于40℃±1℃水浴保溫并精確計(jì)時(shí)10min。保溫結(jié)束后立即加入三氯乙酸（0.4mol/L）2mL以終止反應(yīng)，并繼續(xù)保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾。另取15×150mm試管3支，編號(hào)1、2、3，每管中加入濾液1mL，再加碳酸鈉（0.4mol/L）5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后于40℃±1℃水浴保溫發(fā)色20min后，立即取出，采用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)660nm）測(cè)定吸光度。7.1.4空白試驗(yàn)取15×100mm試管3支，編號(hào)（1）、（2）、（3）（也可做2只），測(cè)定方法同7.1.3，唯在加酪蛋白溶液（0.2g/L）前先加三氯乙酸（0.4mol/L）2mL，使酶失活，再加入酪蛋白溶液（0.2g/L）。樣品的平均吸光度減去空白試驗(yàn)的平均吸光度，則為凈吸光度。表2酶解酪蛋白步驟各溶液添加順序試劑試管編號(hào)試劑試管編號(hào)123QB/TXXX—20XX預(yù)熱酶液，mL111預(yù)熱酶液，mL111預(yù)熱0.2g/L酪蛋白溶液，mL1110.4mol/L三氯乙酸，mL22240℃±1℃水浴保溫并精確計(jì)時(shí)10min40℃±1℃水浴保溫并精確計(jì)時(shí)10min0.4mol/L三氯乙酸，mL222預(yù)熱0.2g/L酪蛋白溶液，mL1117.2酸性蛋白酶活力的測(cè)定將4.2.7及7.1中“磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）”改為“乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）”，其他操作與7.1相同。7.3堿性蛋白酶活力的測(cè)定將4.2.7及7.1中“磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）”改為“硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5）”，其他操作與7.1相同。8分析結(jié)果的表述試樣的蛋白酶活力按式（1）計(jì)算：X=×4×N×……（1）式中：X