DB35DB35/T1854—2019蜜蜂以色列急性麻痹病毒病診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforIsraeliacuteparalysisvirusofhoneybees福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 5 7 8 91GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscriptionPolymeraTBE：三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TrihydroxymethylAminomethane-BoricAcid-以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一種常見(jiàn)的蜜蜂病毒病，可侵染各個(gè)發(fā)育時(shí)期的蜜蜂個(gè)體IAPV屬于小核糖核酸病毒總科（Picornaviridae），病毒基因組是由9的兩個(gè)開(kāi)放讀碼框被一個(gè)由184個(gè)核苷酸組成的基因間區(qū)域分開(kāi)?？?′端的開(kāi)放讀碼框編碼翻譯與RNA譯用于加工不同衣殼蛋白的、由944個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)性多聚蛋白。IAPV有兩個(gè)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，一個(gè)位于5′端非翻譯區(qū)，另一個(gè)位于兩個(gè)開(kāi)放閱讀框之間的基因間區(qū)域，在衣殼蛋白的起始翻譯合成25.1.2在巢脾上只剩下蜂王、幼蟲(chóng)和一些未成年工蜂以及花粉等殘留食物，且在蜂箱內(nèi)并無(wú)5.1.3蜜蜂個(gè)體感染早期腹部、胸部逐漸變黑，翅膀顫抖，在蜂箱外的空地上轉(zhuǎn)圈，既不采6.1.1.8冰箱（2℃~8℃和-80℃)。3探針I(yè)APV-P序列為5′-FAM-CGGAACGCCGCATGTGTTACCA-BHQ1-3′。應(yīng)2℃~8℃保存；若樣品24h內(nèi)不能送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)-20℃或更低溫度保存。選取不超過(guò)200mg～300mg待鑒定幼蟲(chóng)蟲(chóng)體或成蜂蜂體，置于D清洗；4℃,10000r/min離心10min，棄上清液，沉淀室溫干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉4/3/后加入樣品孔中進(jìn)行電泳。在電泳時(shí)設(shè)立D使用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察核酸條帶并判斷結(jié)果，經(jīng)核酸擴(kuò)增電泳后如出現(xiàn)一條大小約270bp的DNA片段，應(yīng)對(duì)其切膠回收后進(jìn)行測(cè)序，也可直接送PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，參考序列參見(jiàn)附錄B，同源性達(dá)待檢樣品經(jīng)核酸擴(kuò)增電泳后，在大小約270bpDN5//變性2min；之后95℃變性15s，60℃退火30s，收集熒光陽(yáng)性對(duì)照樣品有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，而且Ct值≤30；陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，而且Ct值＞4067溶液的配制三羥甲基氨基甲烷（Tris）54.0g8 aaggctcagctaggatgacacgcctgtacactgtcgacattagttaagttacaattacacgtcttttgccggtcaactgattatgatttttgtataacgacaaacagtgatgaactgtataactcatcaataacaaaatggattctatcttgatcgaagtctagtagatccccaatatagccctgaaaagcttgagggacgagatagctctataaatactagtggacgaagcgagttccgtattgtgtacgttgggagtattgctttcttgttgtgaatcaccagg