第1章

細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程

照片中兩只可愛的小猴，分別叫“中中”和“華華”，它們誕生于2017年，一出生就轟動了全世界，這是我國科學(xué)家的研究成果。它們的誕生也意味著我國是世界上首個完成對靈長類動物克隆的國家。自1996年首只體細(xì)胞克隆哺乳動物多莉羊(Dolly)誕生以來，人類已經(jīng)成功克隆了馬、牛和豬等大型家畜，但為什么體細(xì)胞克隆猴的誕生能轟動世界呢?

上面這些成果的取得都有賴于細(xì)胞工程的發(fā)展，培育克隆動物只是細(xì)胞工程的一個方面。近年來，細(xì)胞工程領(lǐng)域成果迭出，方興未艾。細(xì)胞工程

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法,通過細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作,有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。原理方法操作水平目的植物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程哈伯蘭特提出細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)實驗嘗試沒有成功。斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強有力的支持?？平鹩谜婢睦w維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚?？柹T導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進了植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。1902年1958年1960年1964年1971年1974年

“其茅葺，其葉青青，猶綠衣郎，挺節(jié)獨立，可敬可慕。迨（dài）夫花開，凝情瀼露，萬態(tài)千妍，薰風(fēng)自來，四坐芬郁，豈非真蘭室乎！豈非有國香乎！”

——《金漳蘭譜》

蘭花種子通常發(fā)育不全，在自然條件下萌發(fā)率極低；傳統(tǒng)分株繁殖的方法又存在繁殖周期長、繁殖率低等問題，如果靠自然繁殖，蘭花的價格可想而知了。如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖，從而走入尋常百姓家呢？

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可以大量、快速地培育蘭花。植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)一、細(xì)胞的全能性1.定義：細(xì)胞經(jīng)過分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能，即細(xì)胞具有全能性。2.原因：細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。3.體現(xiàn)：細(xì)胞→完整個體或其他各種細(xì)胞注意：種子發(fā)育成植株，沒有體現(xiàn)細(xì)胞的全能性。并不是生物體內(nèi)所有細(xì)胞都能表現(xiàn)出全能性，例如：植物體內(nèi)的芽原基細(xì)胞只能發(fā)育為芽，葉原基細(xì)胞只能發(fā)育為葉。

4.細(xì)胞沒有體現(xiàn)全能性的原因：基因在特定時間和空間條件下會選擇性地表達。注意：具有全能性≠表現(xiàn)出全能性。一般來說，細(xì)胞分化程度越高，全能性越低，細(xì)胞的分裂能力越弱。二、植物組織培養(yǎng)技術(shù)1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部誘導(dǎo)分化產(chǎn)生了胚狀體，這是人類第一次獲得了人工胚狀體，并獲得個體植株。培養(yǎng)條件：①無菌；②營養(yǎng)物質(zhì)；③適宜環(huán)境條件（溫度、PH、光等）；④植物激素：細(xì)胞分裂素生長素等；⑤離體。植物組織培養(yǎng)技術(shù)

將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。外植體脫分化在一定的激素和營養(yǎng)等條件的誘導(dǎo)下，已分化細(xì)胞，失去其特有結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞的過程（P35）。細(xì)胞排列疏松且無規(guī)則、高度液泡化、呈不定形的薄壁細(xì)胞團塊（細(xì)胞未分化，沒有葉綠體）。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng),重新分化成芽、根等器官的過程（P35）。菊花的組織培養(yǎng)1.實驗原理：植物細(xì)胞一般具有全能性（理論基礎(chǔ)）；在一定的激素和營養(yǎng)等條件的誘導(dǎo)下，已經(jīng)分化的細(xì)胞可以經(jīng)過脫分化和再分化，形成胚狀體，長出芽和根，進而發(fā)育成完整的植株；外植體脫分化愈傷組織再分化根、芽等試管苗完整植株移栽植物激素中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素，它們的濃度、比例等都會影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向。細(xì)胞分裂素生長素芽分化愈傷組織根分化生長素/細(xì)胞分裂素比值結(jié)果高適中低促進芽的分化促進根的分化促進愈傷組織的形成整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基中的生長素和細(xì)胞分裂素含量并不是固定不變的。菊花的組織培養(yǎng)2.實驗?zāi)康模孩倭私庵参锝M織培養(yǎng)的基本原理。②

了解生長素和細(xì)胞分裂素的濃度、用量的比例對菊花愈傷組織形成和分化的影響。③

嘗試進行植物組織培養(yǎng)。3.材料用具：外植體：幼嫩的菊花莖段（分裂旺盛，容易誘導(dǎo)形成愈傷組織）體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精：對手、超凈工作臺、外植體進行消毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右的次氯酸鈉溶液：對外植體進行消毒無菌水：清洗外植體培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基（參見P116附錄1）包括無機營養(yǎng)成分（水和無機鹽）、有機營養(yǎng)成分（蔗糖、氨基酸、維生素等）、特定濃度和比例的激素（主要是生長素和細(xì)胞分裂素類似物）、瓊脂作為碳源和能源物質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓。菊花的組織培養(yǎng)4.實驗步驟：①制備外植體材料：幼嫩的菊花莖段消毒：酒精30s無菌水2-3次次氯酸鈉溶液30min2-3次無菌水洗切割：無菌操作思考：為什么進行消毒、無菌操作?防止雜菌生長與培養(yǎng)物競爭營養(yǎng)；另外也防止雜菌產(chǎn)生有害物質(zhì)毒害培養(yǎng)物。菊花的組織培養(yǎng)4.實驗步驟：②接種在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口。形態(tài)學(xué)上端朝上,形態(tài)學(xué)下端插入到培養(yǎng)基中③培養(yǎng)愈傷組織將接種了外植體的錐形瓶置于18～22℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。思考：培養(yǎng)愈傷組織（脫分化）為什么要在避光條件下培養(yǎng)?光照下容易誘導(dǎo)形成維管組織，而不易形成愈傷組織。菊花的組織培養(yǎng)4.實驗步驟：④誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)15-20d后，接種到誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基，再接種到誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，該過程需要在光照下進行，進一步誘導(dǎo)形成試管苗。誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根思考：1.為什么要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根呢？2.誘導(dǎo)生芽和生根（再分化）為什么要在光照下進行？芽產(chǎn)生的生長素和芽能進行光合作用有利于生根。葉綠素的合成需要在光照下進行。脫分化與再分化的比較脫分化再分化過程分裂、分化結(jié)果需要條件外植體→愈傷組織有分裂，無分化形成愈傷組織離體、適宜的營養(yǎng)；生長素與細(xì)胞分裂素比例適中；避光。離體、適宜的營養(yǎng)；生長素與細(xì)胞分裂素的比例高或低；光照。愈傷組織→幼苗有分裂，有分化形成根、芽或胚狀體菊花的組織培養(yǎng)4.實驗步驟：⑤試管苗移栽移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。菊花的組織培養(yǎng)5.結(jié)果分析與評價（1）接種培養(yǎng)后，檢查外植體的生長情況，統(tǒng)計有多少外植體被污染，試分析它們被污染的可能原因。培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；外植體消毒不徹底；操作過程不符合無菌操作要求等。（2）植物是自養(yǎng)生物，為什么用于植物組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中需要加入有機物作為碳源？

通常植物體本身進行光合作用產(chǎn)生糖類，不需要外部供給糖，但植物組織培養(yǎng)利用的是離體組織或細(xì)胞，在其脫分化過程中不能進行光合作用合成糖類，因此必須在培養(yǎng)基中添加糖類，作為碳源和能源物質(zhì)，同時維持細(xì)胞的滲透壓。（3）同微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？

微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，含有植物生長必需的大量元素和微量元素，還需要添加植物激素。菊花的組織培養(yǎng)欲培育地上長番茄和地下結(jié)馬鈴薯的“超級作物”。你有什么好妙招？利用傳統(tǒng)有性雜交方法能實現(xiàn)嗎？為什么？不能。因為番茄和馬鈴薯之間存在著生殖隔離。三、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)番茄細(xì)胞番茄細(xì)胞原生質(zhì)體馬鈴薯細(xì)胞馬鈴薯細(xì)胞原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁愈傷組織雜種植株移栽后的植株酶解法去壁纖維素酶和果膠酶誘導(dǎo)融合物理法：電融合法、離心法；化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志植物體細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)三、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交

將不同來源的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。注意：終點要形成新植物體。理論基礎(chǔ)：細(xì)胞膜具有一定的流動性和植物細(xì)胞的全能性意義：打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種。實例：白菜-甘藍思考：白菜（2n=20）,甘藍（2n=18）,白菜-甘藍染色體數(shù)和染色體組數(shù)?38條染色體，四個染色體組，異源四倍體。1.下圖是利用甲、乙兩種植物的各自優(yōu)勢，通過植物細(xì)胞工程技術(shù)培育高產(chǎn)、耐鹽的雜種植株的實驗流程圖。下列相關(guān)敘述錯誤的是（

）A.進行a處理時能用胰蛋白酶B.b是誘導(dǎo)融合后得到的雜種細(xì)胞C.c是培養(yǎng)后得到的具有耐鹽性狀的幼芽D.進行d選擇時要將植株種在高鹽環(huán)境中2.科學(xué)家在制備原生質(zhì)體時，有時使用蝸牛消化道提取液來降解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。據(jù)此分析，蝸牛消化道提取液中可能含有什么成分?一、概念檢測A纖維素酶和果膠酶

利用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的"番茄-馬鈴薯"雜種植株沒有如科學(xué)家所想象的那樣，地上結(jié)番茄，地下長馬鈴薯，這是為什么?

生物體內(nèi)基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以"番茄-馬鈴薯"雜種植株的細(xì)胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達相互干擾，它們不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達，雜種植株自然就不能地上結(jié)番茄、地下長馬鈴薯了。二、拓展應(yīng)用

青蒿素是有效治療瘧疾的藥物，幾乎不溶于水，且遇熱不穩(wěn)定，所以提取工藝一直難以突破。下圖表示科研人員獲得青蒿素含量較高的黃花蒿的植物組織培養(yǎng)流程。下列敘述不正確的是(

)A．選取黃花蒿的分生區(qū)組織作為外植體更易得到愈傷組織B．過程②和過程③分別代表脫分化和再分化過程C．從愈傷組織中提取青蒿素效果不理想，與相關(guān)基因的表達情況有關(guān)D．除向①②過程培養(yǎng)基添加營養(yǎng)物質(zhì)外，還需添加生長素和細(xì)胞分裂素B如圖所示為菊花組織培養(yǎng)的過程，下列敘述錯誤的是(

)A.①過程用酒精、次氯酸鈉等對生理狀況良好的嫩枝莖段進行表面消毒B.通過③過程葉肉細(xì)胞失去了其特有的結(jié)構(gòu)和功能C.④過程需要先誘導(dǎo)生根，長出根后再誘導(dǎo)生芽D.⑤過程移栽前需要先打開封口膜或瓶蓋讓試管苗適應(yīng)外界環(huán)境C如圖所示為菊花組織培養(yǎng)的過程，下列敘述錯誤的是(

)A．②過程應(yīng)將消過毒的成熟部位的莖段插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基B．③過程需要遮光，④過程需要給予適當(dāng)時間和強度的光照C．①過程需要用70%酒精和次氯酸鈉溶液對莖段進行消毒D．整個過程中至少要使用3個培養(yǎng)基A下圖所示為植物體細(xì)胞雜交的過程，下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)A．A細(xì)胞和B細(xì)胞誘導(dǎo)融合前要先去除細(xì)胞壁，可用纖維素酶和果膠酶處理B．從A、B細(xì)胞到C細(xì)胞的過程中，常用離心法，電融合法或聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合C．A細(xì)胞和B細(xì)胞融合完成的標(biāo)志是再生出新的細(xì)胞壁D．植物體細(xì)胞雜交的目的是獲得雜種細(xì)胞D下圖為用取自基因型為AaBb的胡蘿卜韌皮部細(xì)胞培育出胡蘿卜小苗的過程，下列敘述中不正確的是()A.a→b過程是通過細(xì)胞有絲分裂完成的B.b→c→d過程發(fā)生了細(xì)胞分化C.a→b過程中使用的培養(yǎng)基中應(yīng)含有機碳源和氮源D.雜合植株經(jīng)上述過程獲得的幼苗會出現(xiàn)性狀分離D如圖為A、B兩種二倍體植物體細(xì)胞雜交過程示意圖，請據(jù)圖回答下列問題：(1)步驟①常采用的方法是____________。步驟②常用的化學(xué)試劑是_________________，之后________(填“需要”或“不需要”)篩選雜種細(xì)胞。(2)在利用雜種細(xì)胞培育雜種植株的過程中，運用的技術(shù)手段是___