儀器分析(第四版)第三章

高效液相色譜法：

特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。

高壓：150-350*105Pa

高速：迅速

高效：大于30000塔板/米

高靈敏：10-9g（紫外檢測）、10-11g（熒光檢測）第三章高效液相色譜分析法HPLC§3-1高效液相色譜法的特點

儀器分析(第四版)第三章一、HPLC與GC差別1．分析對象的區(qū)別

GC：

適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品；但對高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測

占有機物的20%

HPLC：

適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測占有機物的80%儀器分析(第四版)第三章2．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）3．流動相差別的區(qū)別

GC：流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。

HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。改變流動相極性和pH值也對分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。又稱淋洗液、洗脫劑儀器分析(第四版)第三章對流動相的要求：1）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、純化2）與固定液不反應(yīng)，不引起柱效損失和保留特性變化3）對樣品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的4）與檢測器匹配：

UV（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）熒光，電化學(xué)儀器分析(第四版)第三章流動相極性合適極性的流動相，組分保留時間適當(dāng)水>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>醋酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>氯丙烷>甲苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>庚烷>煤油可采用二元或多元組合的溶劑系統(tǒng)作為流動相，以獲得合適的溶劑強度（極性）底劑：決定基本的色譜分離情況洗脫劑：調(diào)節(jié)試樣組分滯留并對某幾個組分具有選擇性的分離作用儀器分析(第四版)第三章1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）、梯度洗提裝置3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置一、高效液相色譜儀流程圖§3-2高效液相色譜儀儀器分析(第四版)第三章液相色譜儀器分析(第四版)第三章二高效液相色譜儀的主要部件1．泵：輸送流動相，提高柱前壓力，獲得高速液流

壓力一般為15~35MPa

要求：流量穩(wěn)定，壓力平穩(wěn)無脈動，流速可調(diào)恒壓泵：流量精度不穩(wěn)，如氣動放大泵恒流泵：適用于梯度洗提，常用，如往復(fù)式柱塞泵儀器分析(第四版)第三章特點：不受整個色譜體系中其余部分阻力微變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相；流量可調(diào)；死體積?。ㄟm宜梯度洗提）；缺點：輸出有脈動（可用脈沖阻尼器或雙泵頭互補），對紫外檢測器影響不大往復(fù)式柱塞泵儀器分析(第四版)第三章優(yōu)點：供給無脈沖、穩(wěn)定流量的輸出，適用于勻漿法填裝色譜柱缺點：液缸體積大，不適于頻繁更換流動相；不適于梯度洗提；補充溶劑過程，避免出現(xiàn)色譜峰氣動放大泵儀器分析(第四版)第三章2．洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗提：流動相中含有兩種（或以上）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，通過流動相中極性的變化來改變被分離組分的容量因子k和選擇性因子，以提高分離效果適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）儀器分析(第四版)第三章低壓梯度：常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笥帽幂斎耄ㄍ馓荻龋└邏禾荻龋簩⑷軇┯酶邏罕迷鰤汉筝斎肷V系統(tǒng)的梯度混合室，混合后送入色譜柱（內(nèi)梯度）儀器分析(第四版)第三章儀器分析(第四版)第三章3．進樣裝置要求：將試樣“濃縮”瞬時注入色譜柱上端柱擔(dān)體的中心成一小點1）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊→進樣室）

GC系統(tǒng)壓力較小，可以

HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣，tR不精確（早期）儀器分析(第四版)第三章2）閥進樣：不必停泵，六通閥注射器中試樣量比定量管中容積大3~5倍優(yōu)點：進樣量準確，適用于定量分析；進樣量可調(diào)儀器分析(第四版)第三章4．色譜柱：直徑4~6mm，柱長10~30cm

填料粒度5~10μm柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，R，n影響因素：填料的性能發(fā)展：減小填料顆粒度；減小柱徑

填料方法：干法（20μm

以上）濕法：勻漿法，以一合適的溶劑或混合溶劑作為分散介質(zhì)，使填料微粒在介質(zhì)中高度分散，形成勻漿，高壓下將勻漿壓入柱管中，制成均勻、緊密的高效柱柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗儀器分析(第四版)第三章4．檢測器

1）紫外光度檢測器（最廣泛）：適于吸收紫外光的物質(zhì)原理：被分析試樣組分對特定波長紫外線的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵循比爾定律種類：固定波長（單波長和多波長）、可變波長特點:靈敏度高，最小檢測達10-9g·mL-1，對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗提缺點：溶劑受限

儀器分析(第四版)第三章儀器分析(第四版)第三章熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)原理：具有對稱共軛結(jié)構(gòu)的有機芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長較長的熒光；或不發(fā)射熒光的物質(zhì)通過化學(xué)衍生轉(zhuǎn)變成能發(fā)出熒光的物質(zhì)儀器分析(第四版)第三章3）示差折光檢測器：

借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的差別測定靈敏度低，溫度要求嚴格

4）電化學(xué)檢測器：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中解離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測定解離物質(zhì)含量

5）化學(xué)發(fā)光

6）蒸發(fā)光散射檢測器不揮發(fā)性溶質(zhì)對光的散射現(xiàn)象儀器分析(第四版)第三章§3-3基本理論和條件選擇基礎(chǔ)理論熱力學(xué)理論：塔板理論動力學(xué)理論：速率理論一、塔板理論儀器分析(第四版)第三章1.二、速率理論（與GC對比）2.u>0.5cm/s，B/u可忽略儀器分析(第四版)第三章儀器分析(第四版)第三章三、影響分離的因素儀器分析(第四版)第三章1.固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm）首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2.流動相及其流速的選擇：選粘度小、低流速、合適極性的流動相3.柱溫的選擇：選室溫250C左右四、HPLC法中分離條件的選擇儀器分析(第四版)第三章一、液固吸附色譜法（LSC）

二、液液分配色譜法（LLC）

三、離子色譜法（IC）

四、空間排阻色譜法（SEC）

§3-4

各類高效液相色譜法簡介儀器分析(第四版)第三章1．分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異（競爭吸附）

分離前提：K（吸附平衡系數(shù)）不等或k不等一、液固吸附色譜法（LSC）

流動相為液體，固定相為固體吸附劑Xm+nSaXa+nSmK=[Xa][Sm]n[Xm][Sa]n儀器分析(第四版)第三章2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）

（1）硅膠表孔硅膠（薄殼硅膠）全多孔硅膠無定形5~6μm

球形3~4μm

堆積硅珠3~4μm硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物儀器分析(第四版)第三章（2）高分子多孔小球：原理：吸附+分配兼小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物儀器分析(第四版)第三章3．流動相：各種不同極性的一元或二元溶劑底劑（烷烴）+有機極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---4．出柱順序：強吸附組分后出柱，弱吸附組分先出柱5．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子吸附性、極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)吸附性、極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間儀器分析(第四版)第三章1．分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分

反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分3．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用二、液液分配色譜法（LLC）儀器分析(第四版)第三章利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團鍵合在載體表面特點：表面沒有液坑，傳質(zhì)快不易流失，壽命長熱穩(wěn)定性好化學(xué)性能好載樣量大可鍵合不同官能團，選擇性靈活適于梯度洗脫4、化學(xué)鍵合固定相儀器分析(第四版)第三章（一）正相鍵合相色譜1．分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2.固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動相：極性小底劑+有機極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱6．適用：

分析極性大物質(zhì)、糖類等儀器分析(第四版)第三章（二）反相鍵合相色譜1．固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）2．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性底劑+有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF3．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑4．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱5．適用：非極性~中等極性組分儀器分析(第四版)第三章1．離子對色譜法（IPC）

將一種或多種與溶質(zhì)分子電荷相反的離子加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合成疏水型離子對化合物，在兩相間分配三、離子色譜法（IC）KXY=[X+Y-]有機相[X+]水相

[Y-]水相溶質(zhì)的分配系數(shù)為DX=[X+Y-]有機相[X+]水相=KXY[Y-]水相儀器分析(第四版)第三章1）離子對試劑：烷基磺酸類→分析堿陽離子烷基磺酸鈉烷基銨類→分析酸陰離子四丁基季胺鹽2）按流動相和固定相行性質(zhì)分正相離子對色譜法反相離子對色譜法3）適用：較強的有機酸、堿儀器分析(第四版)第三章2．反相離子抑制色譜

在反相離子色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達到改善分離的目的1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)pH一定的緩沖溶液2）k的影響因素：選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HActR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑儀器分析(第四版)第三章調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<3.0腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì)

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物儀器分析(第四版)第三章3．離子交換色譜法（IEC）

離子交換樹脂上可解離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，根據(jù)離子對交換劑的親和力不同而分離。凡是在溶劑中能夠解離的物質(zhì)通常都可用離子交換色譜法進行儀器分析(第四版)第三章

被分析物質(zhì)解離后產(chǎn)生的離子與樹脂上帶有相同電荷的離子進行交換，達到平衡陽離子交換陰離子交換溶劑中溶劑中溶劑中溶劑中儀器分析(第四版)第三章陰離子交換的平衡常數(shù)為KX=[-NR4+X-][Cl-][-NR4+Cl-][X-]分配系數(shù)為DX=[-NR4+X-][X-]=KX[-NR4+Cl-][Cl-]分配系數(shù)D越大，溶質(zhì)的離子與離子交換劑的作用越強，保留值越大儀器分析(第四版)第三章固定相薄膜型離子交換樹脂（薄殼型）離子交換鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合在惰性擔(dān)體表面陽離子交換樹脂（強酸、弱酸型）陰離子交換樹脂（強堿、弱堿型）儀器分析(第四版)第三章4．離子色譜法

在離子交換色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展，常用于水溶液中陰離子的分析1）固定相:離子交換樹脂2）流動相：電解質(zhì)溶液3）檢測器：常用電導(dǎo)檢測器4）化學(xué)抑制型離子色譜高電導(dǎo)洗脫液（如NaOH）非抑制型離子色譜低電導(dǎo)洗脫液（苯甲酸鹽等）儀器分析(第四版)第三章化學(xué)抑制型離子色譜由于洗脫液中OH-濃度大，且電導(dǎo)值較高，待測離子濃度變化引起的電導(dǎo)變化小，采用抑制柱交換洗脫陰離子Br-為例NaOH轉(zhuǎn)換成水，本底影響消除，Br-成相應(yīng)的酸，H+的離子淌度是Na+的7倍，電導(dǎo)變化明顯儀器分析(第四版)第三章四、空間排阻色譜法根據(jù)分子大小進行分離1）分離機理：類似于分子篩固定相：凝膠；具有一定大小的孔穴大分子不能進入孔穴，受到排阻，直接通過柱子，先被洗脫；很小的分子滲透在所有膠孔中，后被洗脫，保留值最大；中等大小的分子可滲透某些孔穴，