廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）編制說明一、項(xiàng)目來源根據(jù)《關(guān)于下達(dá)2016年第六批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定（修訂）項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂質(zhì)監(jiān)函〔2016〕324號(hào)）文件精神，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)提出，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)起草廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（項(xiàng)目編號(hào)為2016-06065）。二、項(xiàng)目背景及目的意義厚藤Ipomoeapes-caprae(L.)Sweet為旋花科(Convolvulaceae)番薯屬(Ipomoea)多年生匍匐蔓生草本植物，廣布于全球熱帶及亞熱帶沿海地區(qū)，在我國廣泛分布于浙江、臺(tái)灣、福建、廣東、廣西、海南等熱帶和亞熱帶海灘上。厚藤為廣西特色海洋中藥，同時(shí)還具有多種實(shí)用價(jià)值，可用于食品、飼料等行業(yè)，市場(chǎng)遠(yuǎn)景廣闊。因此，為了更好地保護(hù)和應(yīng)用這一植物資源，提高其質(zhì)量和創(chuàng)匯能力，促進(jìn)其推廣應(yīng)用，我們提出了制定《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》的建議。三、項(xiàng)目編制過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組本項(xiàng)目實(shí)行在項(xiàng)目主持人負(fù)責(zé)下的小組負(fù)責(zé)制，各個(gè)實(shí)施單位指定研究小組組長和成員后，對(duì)項(xiàng)目任務(wù)進(jìn)行分解和分配，明確各小組的責(zé)任、項(xiàng)目實(shí)施計(jì)劃，對(duì)小組成員的職責(zé)和進(jìn)度進(jìn)行細(xì)化，確保項(xiàng)目高效如期進(jìn)行。在標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目下達(dá)后及時(shí)成立了以廣西中醫(yī)藥大學(xué)侯小濤教授主持，鄧家剛、郝二偉、杜正彩、秦健峰、馮小慧為參與成員的標(biāo)準(zhǔn)編制小組，及時(shí)部署了標(biāo)準(zhǔn)編制的工作方案和時(shí)間進(jìn)度表。在標(biāo)準(zhǔn)起草前，研究了厚藤的相關(guān)文獻(xiàn)資料，并對(duì)課題研究成果進(jìn)行了全面整理和總結(jié)討論。在編制過程中，還深入廣西各大主要產(chǎn)區(qū)廣泛資源調(diào)查，同時(shí)咨詢了相關(guān)權(quán)威專家，力爭(zhēng)編制工作過程科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)，方法、技術(shù)路線正確。（二）收集整理文獻(xiàn)資料以及前期工作基礎(chǔ)迄今為止，標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員對(duì)厚藤相關(guān)研究進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)收集以及進(jìn)行了一系列藥效篩選及化學(xué)成分的初步研究。厚藤不僅是具有綠化、防風(fēng)固沙、抵御自然災(zāi)害、恢復(fù)生態(tài)等功能的海灘景觀植物，也是中國南方沿海的民間常用海洋中藥、京族習(xí)用植物藥?！吨腥A海洋本草》、《中華本草》、《廣西藥用植物名錄》等多部著作中均有該植物藥用的記載，中醫(yī)認(rèn)為其味辛、苦，性微寒，歸肺、肝、胃、大腸經(jīng)，具祛風(fēng)除濕、消癰散結(jié)、拔毒消腫的功效，民間應(yīng)用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腰腿痛及瘡癤、痔瘡、海蜇引起的皮炎。厚藤在其他多個(gè)國家民間醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有悠久的應(yīng)用歷史，如：澳大利亞土著人用于治療傷口、蟲毒引起的皮膚炎癥、淋巴結(jié)結(jié)核、高血壓、偏頭痛，墨西哥民間用于治療腎炎，泰國民間用于治療水母毒素引起的炎癥，巴西民間用于治療疝氣、排尿障礙、淋病，巴基斯坦也將其作為代茶飲。現(xiàn)代研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。厚藤具有悠久的傳統(tǒng)應(yīng)用歷史和明確的藥理活性，且資源豐富易得，但至今未有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究以海洋中藥厚藤為對(duì)象，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究：建立了厚藤的薄層色譜鑒別法；測(cè)定了厚藤的水分、總灰分、浸出物的含量；建立了HPLC法測(cè)定六個(gè)成分的方法；采用以綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的總含量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝；結(jié)合化學(xué)計(jì)量法建立HPLC及UPLC指紋圖譜，生成指紋圖譜共有模式，本課題可為該海洋中藥的臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制和產(chǎn)品開發(fā)等提供參考。（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對(duì)收集的資料以及前期研究基礎(chǔ)進(jìn)行整理研究之后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會(huì)議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)該部分的主體內(nèi)容確定為范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存。（四）調(diào)研及形成征求意見稿在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)厚藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，并結(jié)合廣西厚藤質(zhì)量控制實(shí)際要求的基礎(chǔ)上，按照簡(jiǎn)化、統(tǒng)一等原則編制完成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（草案）。2016年7月，廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》獲自治區(qū)質(zhì)監(jiān)局批準(zhǔn)立項(xiàng)。2016年8月-12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組組織部門有關(guān)專家征求廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（草案）意見。2017年1月-2018年12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組按照專家意見進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的完善。2019年1月-12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在南寧市組織全區(qū)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍?duì)廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行征求意見。經(jīng)過多次討論、研究，最終形成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《厚藤質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和編制說明。四、標(biāo)準(zhǔn)主要章節(jié)內(nèi)容及確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)涉及的技術(shù)原理及依據(jù)采用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)厚藤的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)進(jìn)行分析測(cè)定，對(duì)厚藤進(jìn)行質(zhì)量控制是本標(biāo)準(zhǔn)制定的出發(fā)點(diǎn)。水分的測(cè)定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832中第二法的規(guī)定測(cè)定?？偦曳值臏y(cè)定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2303的規(guī)定測(cè)定。浸出物的測(cè)定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2201的規(guī)定測(cè)定，用50%乙醇溶液作溶劑?？Х人岬暮繙y(cè)定：采用高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0512）測(cè)定。（二）、標(biāo)準(zhǔn)涉及技術(shù)的具體實(shí)施方案按照廣西壯族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)編制工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員于項(xiàng)目實(shí)施期間，深入廣西防城港市、廣西北海市、廣西欽州市、海南陵水黎族自治縣、海南?？谑行阌^(qū)等地區(qū)開展資源調(diào)查、樣品采集。厚藤采集于廣西及海南，總計(jì)10批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)李永華教授鑒定為旋花科植物厚藤Ipomoeapes-caprae（L.）Sweet的干燥莖葉，新鮮藥材置烘箱中55℃烘干，粉碎，藥材粉末過55目篩備用，批號(hào)如表1所示；表1不同產(chǎn)地厚藤的樣品來源信息編號(hào)產(chǎn)地采收時(shí)間IP-1廣西城港市防城區(qū)2016/03/26IP-2廣西防城港市防城區(qū)江山半島—三塊石2016/06/24IP-3廣西防城港市防城區(qū)江山半島—脯魚灣2016/06/24IP-4廣西防城港市防城區(qū)江山半島—白浪灘2016/06/24IP-5廣西防城港市防城區(qū)江山半島—白沙灣2016/06/24IP-6廣西防城港市防城區(qū)-北侖河口紅樹林自然保護(hù)區(qū)2016/07/10IP-7廣西北海市合浦縣白沙鎮(zhèn)獨(dú)山村2016/10/15IP-8海南陵水黎族自治縣陵水英州鎮(zhèn)清水灣2017/02/17IP-9廣西欽州市三娘灣2017/06/12IP-10海南?？谑行阌^(qū)2017/07/151.水分含量測(cè)定參照2015版《中國藥典》第四部（通則0832)水分測(cè)定法第二法烘干法，測(cè)定10批不同產(chǎn)地厚藤的水分，根據(jù)公式：水分含量W5%=（W2—W4）/W，計(jì)算供試品中含水分含量，結(jié)果如表2所示，10批厚藤藥材的水分含量的最大值（10.64%）上浮10%即水分含量上限，所以，暫定厚藤的水分含量不得過12%。表210批厚藤藥材的水分含量（烘干法）結(jié)果（n=2）藥材編號(hào)樣品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ樣品重瓶重W2/ɡ干燥5h后總重W3/ɡ干燥1h后總重W4/ɡ水分含W5量/%平均值/%1-12.004069.604371.608371.400271.394910.6510.521-22.000367.367769.368069.163369.160210.392-12.000367.365469.365769.176769.16989.799.832-22.000566.645168.645668.453268.44839.863-12.000566.773568.774068.609368.60388.518.543-22.000868.194170.194970.026870.02358.574-12.000965.655167.656067.455467.453410.1310.234-22.000566.601468.601968.401868.395310.335-12.000268.483470.483670.285770.282010.0810.145-22.000966.016668.017567.817267.813510.206-12.000067.564469.564469.362669.352410.6010.426-22.000666.785868.786468.586468.581610.247-12.000167.901569.901669.695769.690710.5410.557-22.000268.267370.267570.060770.056310.568-12.000667.698669.699269.493169.485510.6810.648-22.000866.644068.644868.442368.432710.609-12.000068.064070.064069.875369.86679.869.909-22.000867.984869.985669.795769.78699.9310-12.000367.571469.571769.411869.40838.178.1910-22.000268.098270.098469.937769.93428.212.總灰分的測(cè)定參照2015版《中國藥典》第四部總灰分測(cè)定法（通則2302），測(cè)定10批不同產(chǎn)地厚藤的總灰分，根據(jù)公式：總灰分W5%=（W4—W1）/W，計(jì)算供試品中總灰分的百分含量，結(jié)果如表3所示，根據(jù)10批厚藤的總灰分含量最大值（14.46%）上浮10%即總灰分上限，所以，暫定厚藤的總灰分含量不得過16%。表310批厚藤藥材的總灰分含量結(jié)果（n=3）藥材編號(hào)樣品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ樣品重+瓶重W2/ɡ灰化5h后總重W3/ɡ灰化1h后總重W4/ɡ總灰分W5/%平均值/%RSD/%1-13.002338.950341.952639.196339.19678.218.120.971-23.001040.259043.260040.499040.50068.051-33.001940.123943.125846.160540.36758.112-13.000939.660942.661839.876939.87697.207.160.942-23.000939.489042.489939.705539.70497.192-33.001839.596642.598439.813239.80917.083-13.000239.854542.854740.162540.161110.2210.140.753-23.002239.914242.916440.218240.216510.073-33.001740.228943.230640.534440.532810.124-13.001838.704241.706038.979438.97749.109.070.334-23.001840.554243.556040.827840.82569.044-33.000939.266142.267039.540539.53849.075-13.001538.686741.688239.018539.019511.0911.090.155-23.001239.763842.765040.096940.096111.075-33.000339.711242.711540.045340.044411.116-13.000738.952641.953339.382939.382714.3314.460.746-23.001540.258343.259840.693740.693714.516-33.001340.123343.124640.559240.559414.537-13.001839.657442.659239.992639.992911.1811.150.507-23.001239.480942.482139.816539.816711.197-33.000739.585942.586639.919639.918611.098-13.000739.855442.856140.107340.10708.388.370.188-23.000639.91542.915640.165740.16578.358-33.001140.230543.231640.481040.48178.379-13.001838.704641.706439.041439.038611.1311.060.869-23.000940.555343.556240.891340.888611.119-33.001439.266542.267939.598139.595210.9510-13.000438.687541.687938.966938.96469.249.190.4310-23.001439.764242.765640.042140.03959.1710-33.001239.7142.711239.987639.98509.163.浸出物的測(cè)定參照2015版《中國藥典》第四部浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下水溶性浸出物測(cè)定法，除另有規(guī)定外，以一定濃度的乙醇代替水為溶劑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)50%、70%、95%乙醇濃度及冷浸法、熱浸法進(jìn)行了考察，結(jié)果如表4。結(jié)果表明，50%乙醇的浸出物均比其他濃度要高，后續(xù)試驗(yàn)將50%乙醇作為溶劑。10批厚藤的熱浸法醇溶性浸出物含量均比冷浸法高，將最低測(cè)定值下浮10%作為含量下限值，綜上，厚藤藥材適宜采用50%乙醇進(jìn)行醇溶性進(jìn)行醇溶性浸出物檢查，規(guī)定厚藤的冷浸法醇溶性浸出物不得少于15%，熱浸法醇溶性浸出物不得少于20%。表4厚藤藥材醇溶性浸出物（熱浸法）的乙醇濃度考察結(jié)果（n=2）藥材編號(hào)乙醇濃度/%樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%2-150%2.000277.486877.71030.447122.3522.792-22.000580.054180.28640.464523.222-370%2.000577.736377.91850.364418.2218.472-42.000177.341777.52900.374518.722-595%2.000180.274880.38610.222811.1411.092-62.000377.135477.24580.220711.03表510批厚藤藥材醇溶性浸出物（冷浸法）的含量結(jié)果（n=3）藥材編號(hào)樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-14.000491.991792.12180.650116.2516.370.641-24.000480.052880.18430.657816.441-34.0008102.6985102.82990.657016.422-14.000292.723992.86230.692017.3017.360.462-24.0001102.3960102.53560.698117.452-34.000271.265871.40460.693817.343-14.000677.343777.49340.748218.7018.910.993-24.000880.275880.42830.762919.073-34.000777.137077.28860.758118.954-14.000877.500977.71841.087427.1828.052.734-24.000292.388492.61501.133228.334-34.000477.737577.96661.145428.635-14.000658.013858.20740.968224.2023.941.365-24.000956.549056.74130.961824.045-34.000551.887552.07610.943023.576-14.000658.013958.19990.929923.2423.390.576-24.000356.548056.73550.937823.446-34.000751.884952.07290.940123.507-14.000758.013358.20050.935823.3923.320.257-24.000556.547156.73350.932023.307-34.000151.883652.06990.931323.288-14.000977.486877.67500.940723.5123.650.538-24.000680.050980.24040.947523.698-34.000777.735977.92600.950523.769-14.000377.343677.51440.854321.3521.570.909-24.000480.275780.44870.864621.619-34.000677.136877.31070.869621.7410-14.000158.014958.22541.052626.3126.320.3110-24.000356.549156.76031.056126.4010-34.000451.885152.09501.049526.23表610批厚藤藥材醇溶性浸出物(熱浸法)的含量結(jié)果（n=3）藥材編號(hào)樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-12.000891.992392.21690.449022.443022.771.451-22.000580.052680.28020.455322.75831-32.0005102.6976102.92870.462223.10422-12.000692.723192.96530.484424.211724.301.032-22.0008102.3943102.64030.491924.58422-32.000877.136677.37780.482424.10843-12.000377.487077.742060.510125.499225.622.173-22.000480.051680.313860.524526.22183-32.000077.737277.988440.502625.12904-12.000477.342477.67270.660633.021432.672.184-22.000680.275180.60640.662833.12914-32.000571.265771.58430.637131.84705-12.000977.341277.641530.600730.020530.071.105-22.000380.274580.572170.595429.76655-32.000877.136477.440750.608730.42186-12.000277.340777.61700.552527.623228.212.226-22.000280.274880.55610.562628.12826-32.000971.264771.55360.577728.87007-12.000791.990192.25400.527826.37887-22.000680.052580.31100.517025.842226.111.037-32.0005102.6963102.95730.522026.09558-12.000792.723993.00280.557927.884228.531.968-22.0003102.4030102.69120.576328.81078-32.000477.136377.42530.578028.89429-12.000591.992792.25280.520226.003526.070.809-22.000780.052480.31550.526326.30389-32.0002102.6989102.95790.518125.900410-12.000392.724093.021120.594329.708529.551.0510-22.0008102.3959102.69350.595229.749110-32.000471.265771.557640.583929.19124.響應(yīng)面法優(yōu)化厚藤中6種成分的提取工藝及含量測(cè)定響應(yīng)面法(ResponseSurfaceMethod，RSM)，通過對(duì)多因素的多個(gè)水平進(jìn)行連續(xù)分析，利用回歸方程擬合出考核指標(biāo)與多個(gè)因素水平間的函數(shù)關(guān)系，并以三維曲線圖的形式展示。試驗(yàn)者可通過關(guān)系系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)分析、等高線圖及三維曲線圖直觀分析，判斷模型的科學(xué)性，通過軟件DesignExpert8.0.6計(jì)算得到最佳提取工藝。中藥提取中影響因素的變化通常為非線性的，響應(yīng)面法適用于非線性函數(shù)關(guān)系的因素的優(yōu)化，所以，響應(yīng)面法具有很好的適用性；其次，較其他優(yōu)化方法，響應(yīng)面法的試驗(yàn)點(diǎn)具有更好的連續(xù)分析性，提供更多的函數(shù)數(shù)據(jù)，因此在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥食品及生命科學(xué)領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均是厚藤中的活性成分，具有顯著的膠原酶抑制劑活性，可能對(duì)人體胚胎發(fā)育、傷口愈合、防止皮膚老化及抑制腫瘤發(fā)生等多種重要生理過程起重要作用。本研究將以上六種成分的含量為考核指標(biāo)，采用響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)厚藤藥材的指標(biāo)成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定不同產(chǎn)地及不同采集時(shí)間總計(jì)20批厚藤中6種成分的含量。4.1色譜條件：色譜柱：AnglientHC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1％磷酸水溶液（B）；流速：1.0mL/min；柱溫：30±5℃；進(jìn)樣量：5μL；洗脫梯度：0~10min，7%~8%A；10~20min，8%~12%A；20~30min，12%~16%A；30~40min，16%~17%A；40~50min，17%~19%A；50~65min，19%~24%A；65~67min，24%~95%A；67~70min，95~95%A。檢測(cè)波長：0~15min，λ=325nm；15~55min，λ=353nm；55min~70min，λ=325nm；進(jìn)樣量：5μL。綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)照品及厚藤樣品色譜圖見圖1、2。圖1混合對(duì)照品HPLC圖峰S1：綠原酸峰S2：咖啡酸峰S3：異槲皮苷峰S4：異綠原酸B峰S5：異綠原酸A峰S6：異綠原酸C圖2樣品HPLC圖峰1：綠原酸峰2：咖啡酸峰3：異槲皮苷峰4：異綠原酸B峰5：異綠原酸A峰6：異綠原酸C4.2單因素優(yōu)化試驗(yàn)以綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的總含量為考察指標(biāo)，考察提取方法、提取溶劑、溶劑濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比、提取溫度等對(duì)厚藤中成分提取率的影響。4.2.1提取溶劑及方法的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計(jì)兩組8份，兩組分別以75%甲醇、75%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，每組內(nèi)分別采用85℃水浴回流、超聲法，提取3次，每次2h，抽濾，合并濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算含量，比較不同提取方法及溶劑的提取率，結(jié)果如圖3，其中乙醇作為提取溶劑、以加熱回流為提取方法的提取率最高，因此采用乙醇回流提取法。圖3不同提取方法及溶劑對(duì)提取率的影響4.2.2溶劑濃度的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計(jì)10份，分別以50%、60%、70%、80%、90%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次2h，抽濾，合并濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算含量，比較不同濃度乙醇的提取率。圖4不同乙醇濃度對(duì)厚藤酚酸類成分提取率的影響結(jié)果如圖4，當(dāng)乙醇濃度小于60%時(shí)，提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，提取率隨著乙醇濃度的增加而減少，可能由于乙醇濃度越大，提取出的非酚酸類雜質(zhì)所占比重越大，酚酸類成分相對(duì)減少。所以，在單因素試驗(yàn)后續(xù)，乙醇濃度定為60%，響應(yīng)面試驗(yàn)乙醇濃度的中心范圍為50%~90%。4.2.3提取時(shí)間的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計(jì)兩組10份，以60%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次分別提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，抽濾，合并濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算含量，比較不同提取時(shí)間的提取率。圖5不同提取時(shí)間對(duì)厚藤酚酸類成分提取率的影響結(jié)果如圖5所示，當(dāng)提取時(shí)間大于1.5h時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定，可能是由于提取1.5h時(shí)，厚藤植物細(xì)胞中的酚酸類成分已經(jīng)釋放完全，并達(dá)到溶解平衡，再延長時(shí)間對(duì)提取率的影響不大。所以，在單因素試驗(yàn)后續(xù)提取時(shí)間定為1.5h，響應(yīng)面試驗(yàn)提取時(shí)間的中心范圍為1h~2h。4.2.4提取次數(shù)的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計(jì)五組10份，以60%乙醇為提取溶劑，加入60mL，每組采用85℃水浴回流提取1次、2次、3次、4次、5次，每次分別提取1.5h，抽濾，合并濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算含量，比較