ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3095—2018犬非結核細菌性肺炎診斷技術規(guī)范ThetechnicalSpecificationfordiagnosticbacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniaeforcanine遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3095—2018目次前1言............................................................................II范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................1術語和定義........................................................................1233.1肺炎pneumonia...............................................................1非結核細菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniae....1感染infection...............................................................16SrRNA.......................................................................14診斷..............................................................................14.14.2流行病學特點..................................................................2臨床癥狀診斷..................................................................24.2.1呼吸系統(tǒng)癥狀..............................................................2發(fā)熱及相關癥狀............................................................2其它方面癥狀...............................................................3影像學特征....................................................................2外周血檢查特征................................................................2病原學檢測....................................................................24.5.1細菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢....................................................2生化試驗..................................................................2致病性檢驗................................................................3分子生物學鑒定.............................................................34.5.456診斷結果判定......................................................................3初步診斷......................................................................4確診..........................................................................4鑒別診斷..........................................................................4附錄A（資料性附錄）細菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和結果判定依據(jù)..............5附錄B（資料性附錄）犬細菌性肺炎的鑒別診斷.........................................10IDB21/T3095—2018前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。本標準起草單位：錦州醫(yī)科大學、鞍山動物檢疫站、本溪市動物疫病預防控制中心等單位。本標準主要起草人：周鐵忠、畢聰明、盛鵬飛、李春宵、陳勇、張建平、馬強、趙巖、郭維軍、楊麗、趙剛、劉建華、朱緒銀、高蕾、李德臣、金娜、高柏華、張娜、宋志永、宋寶強、高峰、孫傳祿、徐暢、何禮。IIDB21/T3095—2018犬非結核細菌性肺炎診斷技術規(guī)范12范圍本標準規(guī)定了犬非結核細菌性肺炎診斷的技術方法、診斷依據(jù)和鑒別診斷。本標準適用于我省動物診療單位及獸醫(yī)工作者對犬非結核細菌性肺炎的診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。但是，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究使用這些文件的最新版本。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，可由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過敏及藥物所致。按病因可分為細菌性肺炎（肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌、金黃色葡萄球菌等），非典型病原體所致肺炎（支原體、衣原體、軍團菌），病毒性肺炎，肺真菌性肺炎，其他病原體所致肺炎（立克次氏體、弓形體、肺寄生蟲等），理化因素所致肺炎。細菌性肺炎指由肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌、金黃色葡萄球菌等主要病原菌引起的肺炎，不包括結核分枝桿菌所致的肺結核。為了嚴格區(qū)分本標準將細菌性肺炎定義為“非結核細菌性肺炎”。病原微生物侵入動物機體，并在一定部位定居，生長繁殖，從而引起機體一系列病理反應，這個過16SrRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中；16SrRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長（包含約50個功能域）等特征，所以，16SrRNA基因檢測技術可做為病原菌檢測和鑒定的主要方法，應用該技術可以實現(xiàn)對病原菌進行快速、微量、準確簡便地分類鑒定和檢測。41DB21/T3095—2018依據(jù)流行病學特點、臨床癥狀及影像學特征等作出初步診斷，確診需做病原學檢測。4.1流行病學特點在發(fā)病前有接觸感染病原微生物的病犬或帶菌犬，如引入新的病犬未隔離就混群，或居住或到過細菌性肺炎流行的區(qū)域；發(fā)病率高，但致死率低，主要為4月齡以內的幼犬發(fā)病，成年犬少見發(fā)??；發(fā)病前有春秋季節(jié)交替、環(huán)境溫度突變、長途運輸?shù)葢ひ蛩兀瑢е碌挚沽ο陆?，誘發(fā)條件性致病菌大量繁殖而發(fā)病。4.2臨床癥狀診斷呼吸系統(tǒng)癥狀4.2.1表現(xiàn)為咳嗽，痰液膿汁樣黃白色或鐵銹樣或帶血，有時流鼻汁；呼吸急促，呼吸困難，如舌頭青紫及鼻翼扇動，重者呈點頭狀呼吸、呼氣時間延長、出現(xiàn)胸壁吸氣性凹陷或呻吟等；胸部聽診肺泡呼吸音消失，支氣管呼吸濕啰音，健康部位則肺泡音高朗，繼發(fā)胸膜炎可聽到胸膜摩擦音；胸部叩診有局灶性或大面積濁音區(qū)。4.2.2發(fā)熱及相關癥狀體溫升高至39.5℃以上，表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退或廢絕，結膜潮紅或藍紫。4.2.3其它方面癥狀重癥肺炎引發(fā)心力衰竭，出現(xiàn)心率加快，心率不齊，脈搏微弱，可視粘膜明顯發(fā)紺，顏面眼瞼或雙下肢水腫等癥狀。引發(fā)缺氧中毒性腦病時出現(xiàn)煩躁、眼球上竄、凝視，昏睡、昏迷、驚厥等癥狀，發(fā)生缺氧中毒性腸麻痹時出現(xiàn)頻繁嘔吐、嚴重腹脹等癥狀。胸部X線檢查顯示肺紋理增粗，片狀、斑片狀、大片狀陰影和實變影，可伴有支氣管充氣征、液氣采集犬前肢頭靜脈（前臂頭靜脈）或后肢隱靜脈或頸靜脈血液樣本1.0ml，采用血液分析儀或人工計數(shù)方法進行外周血白細胞計數(shù)和分類計數(shù)。應用血細胞分析儀計數(shù)方法按其說明書處理血液樣本，進樣檢測，儀器自動分析、打印結果。人工計數(shù)方法取1滴外周血，滴于潔凈無油脂的玻片制取血涂片，應用瑞氏（Wright's）染色法和姬姆薩（Giemsa）染色法進行染色，通過顯微鏡觀察染色血涂片，計算血液中各類白細胞的數(shù)量和百分率。細菌性肺炎白細胞計數(shù)明顯升高，其中中性粒細胞比例顯著升高，并有核左移現(xiàn)象。無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察有無菌落生長；挑取單個菌落進行染色、鏡檢，觀察細菌的形態(tài)。2DB21/T3095—2018挑取單個分離菌接種于細菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察、記錄生化反應結果。4.5.3致病性檢驗將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18～24h，并計算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，每只腹腔注射菌液0.25ml(2.1×10CFU/ml)菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦8心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。取發(fā)病死亡小鼠的肺、肝接種血液瓊脂平板等培養(yǎng)基，均生長出與原分離菌相同的菌。病原學檢測有關試驗使用蒸餾水按國家標準《GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》要求準備。4.5.4分子生物學鑒定應用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌，首先合成用于擴增細菌16SrRNA基因序列的通用引物：27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ；1492r:5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ。目的基因1492bp按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細菌基因組DNA，然后在PCR反應管中按相應反應體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、ddH2O（10μL）等試劑；應用PCR擴增儀按相應反應條件進行擴增。PCR反應條件：94℃預變5min；94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應。對PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說明及步驟對PCR擴增產物進行回收和純化，回收產物作為測序模板進行測序，測序要求測通。對所測出的基因序列進行同源性比對分析，即登陸NCBI網站（）的Blastn在線軟件，粘貼測序所得的16SrRNA基因序列，獲取與該基因同源高的序列和相應的細菌名稱，若同源性大于97%，可以確定為同種細菌。圖1鑒定菌株16SrRNAPCR電泳圖注：M．DL2000DNAMarker;1.陽性對照；2-6.陽性擴增產物；N.陰性對照細菌性肺炎主要致病菌分離培養(yǎng)和形態(tài)特征、生化鑒定以及分子生物學鑒定具體方法和結果判定依據(jù)見附錄153DB21/T3095—20185.15.2初步診斷根據(jù)流行病學特征和典型臨床癥狀，結合外周血、X線影像學特征，可作出初步診斷。確診依據(jù)病原學檢測結果，確定是何種細菌感染，做出確診。6鑒別診斷需要與細菌性肺炎進行鑒別的重點疾病包括上呼吸道感染、犬副流感病毒感染、肺炎支原體肺炎、肺炎衣原體肺炎、軍團菌性肺炎、真菌性肺炎、病毒性肺炎、肺結核。其它需要鑒別的疾病還包括肺部腫瘤、肺水腫、肺氣腫、理化因素所致非感染性肺炎等。需要與細菌性肺炎鑒別的重點疾病的具體鑒別診斷要點見附錄2A4DB21/T3095—2018附錄A（資料性附錄）細菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和結果判定依據(jù)一、鏈球菌的分離鑒定1.細菌學鑒定1.1細菌的分離培養(yǎng)無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和腦心浸出液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在血液瓊脂平板上應生長出濕潤無色透明邊緣整齊的光滑型菌落。菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)，直徑約5.0mm；在腦心浸出液培養(yǎng)基上為灰白色光滑菌落。1.2細菌形態(tài)觀察挑取血瓊脂平板中的單個菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌的形態(tài)，結果應為革蘭陽性鏈球菌。鏈球菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢參考圖片：圖A.1圖A.2圖A.3鏡檢下分離菌形態(tài)結構5DB21/T3095—20181.3生化試驗分離菌經24h鮮血瓊脂平板純培養(yǎng)后，進行糖發(fā)酵試驗和其他生化試驗，結果應如表A.1中所列。表A.1鏈球菌的生化反應結果項目結果項目結果項目結果V-P試驗--+++--山梨醇+-+--++甜醇-+--+++6.5%NaCl淀粉酶試驗葡萄糖阿拉伯糖半乳糖棉籽糖菊糖果糖肌醇蔗糖木糖水楊素海藻糖柳醇衛(wèi)矛醇麥芽糖乳糖鼠李糖2.分子生物學鑒定2.1應用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌，首先合成用于擴增細菌16SrRNA基因序列的通用引物：27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ；1492r:5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ。目的基因1492bp2.2按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細菌基因組DNA，然后在PCR反應管中按相應反應體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、ddH2O（10μL）等試劑；2.3應用PCR擴增儀按相應反應條件進行擴增。PCR反應條件：94℃預變5min；94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應。對PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說明及步驟對PCR擴增產物進行回收和純化，回收產物作為測序模板進行測序，測序要求測通。2.4對所測出的基因序列進行同源性比對分析，即登陸NCBI網站（）的Blastn在線軟件，粘貼測序所得的16SrRNA基因序列，獲取與該基因同源高的序列和相應的細菌名稱，若同源性大于97%，可以確定為鏈球菌同種細菌。圖A.4鑒定菌株16SrRNAPCR電泳圖6DB21/T3095—2018取10只小鼠隨機分為2組，即試驗組和對照組，每組5只。無菌吸取上述經生化鑒定的分離菌的血清肉湯純培養(yǎng)物腹腔注射實驗組小白鼠，每只注射0.2ml（4×108CFU/ml）對照組每只小白鼠腹腔注射0.2ml無菌肉湯。注射后小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對死亡小鼠的心血、腦、肝臟、脾臟進行細菌分離鑒定。觀察到試驗組小鼠注射24h后應表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙豎起，呼吸急促、采食減少等現(xiàn)象；對照組小鼠無此現(xiàn)象。試驗組小鼠72h后全部死亡。將死亡小鼠剖檢，將臟器分離培養(yǎng)，應得到細菌的培養(yǎng)特性、細菌形態(tài)、生化特性應均與接種細菌一致，表明分離菌為致病性鏈球菌。二、葡萄球菌的分離鑒定1.細菌學鑒定1.1形態(tài)學檢查無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液直接涂片，經革蘭氏染色后鏡檢?？梢奊+球菌，圓形或卵圓形，直徑約1μm，呈葡萄串狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。葡萄球菌涂片鏡檢參考圖如下：圖A.5葡萄球菌革蘭氏染色后鏡檢形態(tài)將上述病料于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后，再接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18~24h后觀察，并挑取可疑菌落，涂片鏡檢。該菌在鮮血瓊脂平板上形成圓形、突起、邊緣整齊、表面光滑的白色菌落，未見有色素沉著，菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)。菌落形態(tài)與鏈球菌類似。1.3鑒別培養(yǎng)將鏡檢后的可疑菌落接種于高甘露醇瓊脂平板37℃培養(yǎng)24~48h培養(yǎng)觀察結果。在高甘露醇瓊脂平板上形成1mm左右、凸起、黃色菌落，有金黃色色素產生，菌落周圍的培養(yǎng)基由紅色變成黃色。1.4純培養(yǎng)將純培養(yǎng)菌分別接種于H2S反應管和葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、尿素等微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24～48h后觀察結果。該菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖，不產生H2S，不分解尿素。7DB21/T3095—2018應用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產物測序與DNA序列分析將所得到的序列與GenBank中FJ899095.1金黃色葡萄球菌株16SrRNA序列進行對比，同源性達到96%以上即可以確定。金黃色葡萄球菌PCR擴增產物電泳目的條帶參考圖如下：圖A.6金黃色葡萄球菌16SrRNA序列基因PCR檢測圖注：M．DM2000;1、3陽性樣本；2.陽性對照（CQHC4CSA002）；4.陰性對照3.致病性檢驗3.1血漿凝固酶試驗無菌采取健康家兔的血液，肝素抗凝，離心后去血細胞，取上層血漿備用。將新鮮兔血漿用滅菌生理鹽水作1:4稀釋，分裝于小試管中，每管0.5ml；取12h分離菌株肉湯培養(yǎng)液0.5ml，接種于含有0.5ml血漿的試管中，37℃培養(yǎng)，每0.5h觀察1次，觀察6h判定結果；同時用已知的血漿凝固酶陽性和陰性的葡萄球菌及肉湯培養(yǎng)基作對照。已知的陽性菌株和待檢菌株均使血漿呈膠凍狀凝固，而陰性菌株和肉湯培養(yǎng)基均無上述變化，則結果可判為陽性。取清潔級小鼠5只，分離菌株24h肉湯培養(yǎng)液（1.5×108CFU/ml）；經不同途徑接種：1只小鼠皮下注射菌液1.0ml；1只小鼠腹腔注射菌液1.0ml；2只小鼠分別從靜脈注射菌液0.5ml；1只小鼠由靜脈注射滅菌生理鹽水1ml作為空白對照。分別隔離觀察，皮下注射菌液小鼠24h后注射部位皮膚應發(fā)生潰瘍性壞死；腹腔接種菌液的小鼠48h后接種部位應局部出現(xiàn)化膿灶；靜脈接種菌液的2只小鼠，均應在24～48h死亡。病鼠剖檢后，應可見肝臟、腎臟等臟器腫大，腦組織軟化、空虛，與自然病變相似，取病灶部的病料培養(yǎng)后均分離到接種菌；對照的小鼠應健康存活，剖檢后其器官組織未見上述病變。發(fā)病或死亡者再進行病原菌分離鑒定。三、支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上生長出圓形、光滑、米黃色的小菌落。挑取單個菌落進行染色、鏡檢，觀察細菌的形態(tài)。結果為革蘭氏陰性中等大小桿菌，多呈單個存在。8DB21/T3095—2018挑取單個分離菌接種于細菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18~24h，觀察、記錄生化反應結果。該菌分解氨基酸，不分解糖類，不產硫化氫，枸櫞酸鹽、脲酶、氧化酶試驗為陽性，ONPG、VP、吲哚試驗為陰性。2.分子生物學鑒定應用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產物測序與DNA序列分析純化、回收PCR產物，送交測序公司測序，利用NCBI的BLAST工具對分離菌的16SrRNA的基因序列進行同源性比對。結果顯示該菌株與序列(GenBank序列號：AP014582.1)同源性為96%以上，則可確定分離菌株為支氣管敗血波氏桿菌。3.致病性檢驗將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18~24h，并計算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，每只腹腔注射菌液0.25ml（2.1×108CFU/ml）菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。試驗小鼠于接種菌液后出現(xiàn)精神萎靡，食欲、飲欲廢絕，被毛雜亂等臨床癥狀，在48h內全部死亡。對照組小鼠在觀察期內，全部健康存活。死亡小鼠眼觀主要病變?yōu)榉闻K、肝臟和腸等出血、壞死。取死亡小鼠的肺、肝接種胰蛋白胨大豆瓊脂平板，均生長出與原分離菌相同的菌。9DB21/T3095—2018BB附錄B（資料性附錄）犬細菌性肺炎的鑒別診斷一、犬細菌性肺炎應與如下重點疾病進行鑒別診斷1.上呼吸道感染環(huán)境溫度不穩(wěn)定是本病的主要原因，不同年齡犬均可發(fā)生，幼犬發(fā)病率相對較高?；既啾憩F(xiàn)為輕度咳嗽，少數(shù)病例出現(xiàn)干嘔或吐出未消化的食物。體溫正常，肺部聽診無明顯變化。氣管聽診，聲音粗糲。臨床觸診喉部和氣管敏感，人工誘咳后持續(xù)咳嗽，甚至繼發(fā)干嘔；血常規(guī)檢查無明顯變化，少數(shù)病例白細胞水平輕度升高；血清C反應蛋白（CRP）輕度升高；X線檢查可見氣管內影像增強，肺部影像無明顯變化。2.犬副流感病毒感染本病是由副粘病毒科，副粘病毒屬的犬副流感病毒（CanineParainfluenzaVirus,CPIV）引起的犬呼吸道性傳染病，可以侵害任何年齡的犬。此病的病程為一周以上，少數(shù)病例可長達數(shù)月之久。大多數(shù)犬可隨著機體抵抗力的提高而逐漸康復，少數(shù)犬會因為治療不及時繼發(fā)支氣管肺炎?；既憩F(xiàn)為干咳，咳嗽隨著運動增加和氣管、喉部誘咳或食物以及寒風的刺激而加??；精神、食欲等均正常；一般不發(fā)熱；肺部聽診和血常規(guī)檢查無明顯變化；血清C反應蛋白（CRP）水平輕度升高；X線檢查可見氣管內影像增強，肺部影像無明顯變化。通過病原分離鑒定和分子生物學檢測病毒核酸可區(qū)分其它病原。本病由支原體（Mycoplasma）引起，潛伏期較長?；既w況良好時，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)病初期，臨床癥狀與犬上呼吸道感染相似。該病起病較慢，少數(shù)病例伴有發(fā)熱、無力等癥狀。血常規(guī)檢查一般無明顯變化，個別病例出現(xiàn)白細胞數(shù)輕度升高，中性粒細胞比率升高。長期的咳嗽是本病的主要臨床特征，尤以凌晨時咳嗽最為重劇，經治療后，咳嗽還可持續(xù)1-2周；X線檢查可見氣管內影像增強。應用支原體膠體金抗體檢測卡檢測患犬血液中支原體抗體可作為重要診斷依據(jù)。通過通過病原分離鑒定和分子生物學檢測方法可區(qū)分其它病原。本病由衣原體（Chlamydia）引起，潛伏期較長?；既w況良好時，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)病初期，臨床癥狀與犬上呼吸道感染、犬支原體肺炎相似。即起病較慢，少數(shù)病例伴有發(fā)熱、無力等癥狀。血常規(guī)檢查一般無明顯變化，個別病例出現(xiàn)白細胞數(shù)輕度升高，中性粒細胞比率升高。長期的咳嗽，尤以凌晨時咳嗽最為重劇。經治療后，咳嗽還可持續(xù)1-2周。X線檢查可見氣管內影像增強。應用支原體膠體金抗體檢測卡檢測患犬血液中支原體抗體可作為重要診斷依據(jù)。通過通過病原分離鑒定和分子生物學檢測方法可區(qū)分其