第八章

基因工程下游技術(shù)2011-10-3018第八章基因工程下游技術(shù)一、概述生物技術(shù)是利用生物的某些功能或潛能進(jìn)行有效益的生產(chǎn)的工程技術(shù)。利用大腸桿菌、酵母等生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的蛋白及重要藥物等都是應(yīng)用生物技術(shù)的例子。目前，世界上用生物技術(shù)生產(chǎn)的藥物及生物制品逾數(shù)千種，年產(chǎn)值達(dá)數(shù)百億美元。生物技術(shù)產(chǎn)品中如抗生素、人生長(zhǎng)激素、人干擾素、乙型肝炎疫苗等在我國(guó)均已投產(chǎn)。生物技術(shù)通常分成發(fā)酵工程、細(xì)胞工程、酶工程、基因工程和蛋白質(zhì)工程等。生物技術(shù)以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，以基因工程為核心，將多種基礎(chǔ)科學(xué)聯(lián)合并使之產(chǎn)業(yè)化。2011-10-3028第八章基因工程下游技術(shù)基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它利用人工方法從某一種生物中取得特定的DNA片段，稱目的基因。將目的基因通過(guò)基因載體運(yùn)送到受體宿主活性細(xì)胞中，并使之無(wú)性繁殖（稱之為“克隆”）和行使正常功能（稱之為“表達(dá)”），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)。一般說(shuō)來(lái)，基因工程是專指用生物化學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系統(tǒng)（病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w）的DNA結(jié)合成一個(gè)復(fù)制子。這樣形成的雜合分子可以在復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無(wú)性繁殖使之成為克隆。然后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。2011-10-3038第八章基因工程下游技術(shù)生物技術(shù)工業(yè)經(jīng)過(guò)多年努力，創(chuàng)造了35種重要治療藥物，年銷售額已超過(guò)70億美元。全球已有生物技術(shù)制藥公司2000多家，其中美國(guó)有1300家，歐洲有700家。1997年美國(guó)的生物技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)費(fèi)用為76億美元、歐洲為18億美元。目前主要生物技術(shù)公司多分布在美國(guó)，如Amgen、Geneticsinstitute、Genzyme、Genentech和Chiron，還有Biogen也發(fā)展較快。經(jīng)上市的生物技術(shù)藥物主要含3大類，即重組治療蛋白質(zhì)、重組疫苗和診斷或治療用的單克隆抗體。我國(guó)基因工程藥物產(chǎn)業(yè)化的品種從無(wú)到有，已發(fā)展有10多種，它們是rHUIFNαlb、rHUIFNα2a、rHUIFNα2b、rHUIFNγ、重組乙肝疫苗等。2011-10-3048第八章基因工程下游技術(shù)二、基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程原始材料上游過(guò)程發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化下游過(guò)程產(chǎn)品應(yīng)用2011-10-3058第八章基因工程下游技術(shù)原始材料

菌種、載體、工具酶、培養(yǎng)基等上游過(guò)程

對(duì)菌種加以改造，提高生產(chǎn)能力或者導(dǎo)入外源基因等以獲得工程菌，基因工程是方法之一。發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化

通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件如溫度、營(yíng)養(yǎng)、供氣量等進(jìn)行發(fā)酵或大規(guī)模培養(yǎng)，利用工程菌的生物合成、加工和修飾等獲得目的產(chǎn)物。儲(chǔ)備菌種→種子罐培養(yǎng)作為發(fā)酵的菌種→發(fā)酵（涉及發(fā)酵罐、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化等）。動(dòng)植物的細(xì)胞培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)、固體培養(yǎng)；自動(dòng)化控制。2011-10-3068第八章基因工程下游技術(shù)利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝。就其選用的生物材料而言,前者含有帶外源基因的重組載體;而后者是單一的微生物細(xì)胞;從發(fā)酵工藝考慮,生物工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)目的是希望能獲得大量的外源基因產(chǎn)物,盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的表達(dá)。外源基因的高水平表達(dá),不僅涉及宿主,載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系,而且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān),因此僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,需要對(duì)影響外源基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析,探索出一套適于外源基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝。2011-10-3078第八章基因工程下游技術(shù)工程菌高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)是近幾年來(lái)發(fā)酵工業(yè)的重要目標(biāo)與方向之一,是工程菌能否以盡可能低的成本實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。高細(xì)胞密度培養(yǎng)可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的濃度,利于提取與純化,在同樣的生產(chǎn)量下可縮小反應(yīng)器的體積。1宿主菌的選擇

1.1重組菌的穩(wěn)定性 1.2啟動(dòng)子的選擇與誘導(dǎo)

2培養(yǎng)條件的選擇營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溶氧、溫度、pH3培養(yǎng)方式

分批、連續(xù)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)2011-10-3088第八章基因工程下游技術(shù)下游過(guò)程指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)過(guò)程，包括固液分離技術(shù)（離心、過(guò)濾、沉淀等）、細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）、蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥、冰凍干燥等），是運(yùn)用生物化學(xué)、物理學(xué)方法分離、純化產(chǎn)品，最終將產(chǎn)品推向市場(chǎng)并獲得社會(huì)或經(jīng)濟(jì)效益的過(guò)程。三、下游過(guò)程2011-10-3098第八章基因工程下游技術(shù)基因工程產(chǎn)業(yè)化除上游構(gòu)建工程菌之外,下游必須建立生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細(xì)胞破碎、目的產(chǎn)物的分離、純化、恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)使之具有生物活性、表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工等。就基因工程產(chǎn)業(yè)化而言,下游技術(shù)的研究與建立是十分重要的,又是十分耗時(shí)的,需要遠(yuǎn)比上游研究多得多的投資。2011-10-30108第八章基因工程下游技術(shù)（1）菌體的處理。微生物或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)品是細(xì)胞或培養(yǎng)液，均應(yīng)將它們分開(kāi)，分別處理。發(fā)酵過(guò)程除增殖大量菌體外還有許多殘?jiān)煸诎l(fā)酵液中，可通過(guò)適當(dāng)加熱，調(diào)整酸堿度或添加絮凝劑，使菌體與發(fā)酵液分離。懸浮液中的菌體通過(guò)過(guò)濾或離心法將之分開(kāi)。除加助濾劑外可用真空過(guò)濾以提高效率。離心法常用自動(dòng)間歇排渣離心機(jī)或噴射型離心機(jī)。菌體分離后要經(jīng)滅活處理并將菌體破碎。物理破碎可用研磨法或擠壓法制成勻漿，超聲波振蕩法使介質(zhì)引起空化而產(chǎn)生沖擊波。酶處理可以專一地催化細(xì)胞壁水解，裸露的原生質(zhì)體在低滲條件下進(jìn)一步破裂而釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。（2）胞外產(chǎn)物——上清液的處理。除去菌體后的上清液可通過(guò)加熱或調(diào)整pH以除去雜質(zhì)蛋白，如絮凝劑萃取法分離青霉素G；用等電點(diǎn)法將谷氨酸(味精)沉淀；一些酶制劑可用一定濃度的硫酸銨鹽析析出。色譜分離法采用不同的樹(shù)脂及溶劑系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)物在該系統(tǒng)中不同的分配而被吸附或凝聚而得以分離。其中親和色譜法用于酶或蛋白的分離和精制效果良好。（3）最后純化產(chǎn)品經(jīng)分裝凍干，包裝后即為成品。2011-10-30118第八章基因工程下游技術(shù)與傳統(tǒng)方式相似,重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異,在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計(jì)之前,都需要盡可能多地先對(duì)提純的體系,目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了解。如目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、帶電性、碳?xì)滏溁蜃杂蓭€基存在情況等。另外還需對(duì)影響目標(biāo)蛋白活性的因素有了解,如溫度、ｐH、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑、重金屬離子、機(jī)械剪切力等,以保證純化后的蛋白活性。當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠層析（色譜技術(shù)）和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細(xì)胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在,因此到目前為止還沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái),而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序,以獲得較高純度的制品。2011-10-30128第八章基因工程下游技術(shù)2011-10-30138第八章基因工程下游技術(shù)1.粗分離1.1破碎細(xì)胞大腸桿菌：凍融、超聲、溶菌酶動(dòng)物，植物細(xì)胞：勻漿、研磨1.2抽提1.pH：選擇合適pH的緩沖液如Tris、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽緩沖體系等，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。一般緩沖液濃度為20-50mM。2.溫度：低溫如4-10℃，蛋白酶活性較低。3.離子強(qiáng)度：如0.1-0.2MNaCl或KCl.4.其他成分：還原劑如NaHSO4、維生素C；巰基保護(hù)劑DTT、巰基乙醇；金屬螯合劑EDTA、EGTA；蛋白酶抑制劑PMSF等。2011-10-30148第八章基因工程下游技術(shù)1.3初步分離

1.分離細(xì)胞器：離心、超離心

2.除核酸：酶法DNase、RNase；超聲

3.除脂肪：丙酮、脂肪酶1.4粗分蛋白

1.鹽析：NaCl、(NH4)2SO4沉淀

2.有機(jī)溶劑抽提：甲醇、乙醇、丙酮

3.等電點(diǎn)沉淀：除去雜蛋白

4.熱變性：除去雜蛋白1.5除鹽

1.超濾

2.凝膠過(guò)濾

3.凍干

2011-10-30158第八章基因工程下游技術(shù)

處理介質(zhì)↓裝柱↓平衡↓上樣↓洗滌↓洗脫↓介質(zhì)再生2.細(xì)分離--層析法、色譜法

一般步驟：2011-10-30168第八章基因工程下游技術(shù)2.1凝膠過(guò)濾：將蛋白質(zhì)按照分子量的大小分開(kāi)原理

以分子大小和形狀為分離基礎(chǔ)的。具體說(shuō)就是利用不同大小分子通過(guò)凝膠滯留時(shí)間的差別來(lái)分離混合物的柱層析方法。另外一種說(shuō)法是分離是以分子體積的大小為基礎(chǔ)的,分子體積即分子溶劑化后的體積,受分子形狀和相對(duì)分子質(zhì)量?jī)煞矫嬉蛩氐挠绊?。有時(shí)加入變性劑(尿素、鹽酸胍等)以破壞蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu),使分離主要受控于相對(duì)分子質(zhì)量的大小。2011-10-30178第八章基因工程下游技術(shù)介質(zhì)：

(1)Sephadex:(交聯(lián)葡聚糖)G25,G50,G75,G100Bio-gel:(聚丙烯酰胺)P-6，P-30，P-60，P-100Sepharose:(瓊脂糖)2B,4B,6B(2)Sephacryl（葡聚糖-聚丙烯酰胺):S100,S200,S300(3)Sepharose、Superose:HPLC(4)superdex(瓊脂糖-葡聚糖):HPLC2011-10-30188第八章基因工程下游技術(shù)2011-10-30198第八章基因工程下游技術(shù)2.2離子交換層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)。離子交換介質(zhì)：

(1)離子交換樹(shù)脂

(2)纖維素類：DEAE-、CM-(3)葡聚糖類Sephadex：SephadexC-25、SephadexC-50(4)瓊脂糖類Sepharose：分辨率較高

(5)MonoBeads類:HPLC

陽(yáng)離子：強(qiáng)酸型S-、SM-、SE、SP-;弱酸型C-、CM-

陰離子：強(qiáng)堿型TEAE-、QAE-、SE、SP-;中等堿型：DEAE-

螯合型：BA、CAI-、A、SAHP2011-10-30208第八章基因工程下游技術(shù)離子交換層析是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體說(shuō)就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同,用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。離子交換又分為陰離子交換和陽(yáng)離子交換。洗脫方式：陽(yáng)離子交換主要是改變pH,它主要應(yīng)用于等電點(diǎn)大于5的蛋白質(zhì);而陰離子交換主要是改變鹽濃度,適用于大部分蛋白質(zhì)。離子交換層析處理量大,附載系數(shù)高,一步縮小樣品體積很多。其去除雜質(zhì)能力強(qiáng),如對(duì)熱原質(zhì)、核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白及電荷性有差別的蛋白均可去除。離子交換層析的洗脫一般分3種:同步洗脫、分步洗脫

、梯度洗脫。2011-10-30218第八章基因工程下游技術(shù)2011-10-30228第八章基因工程下游技術(shù)2.3親和層析原理：利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行分離。介質(zhì)準(zhǔn)備：

載體選擇：Sepharose4B、SepharoseCL4B、SepharoseFastFlow、SepharoseHighPerformance

空間臂：偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或ε－氨基己酸。

配基選擇：抗原―抗體、酶―抑制劑、酶―底物、激素―受體、金屬結(jié)合蛋白―螯和劑、含巰基蛋白―Hg或含巰基分子凝集素―糖蛋白

偶聯(lián)：I溴化氰法：與α－氨基或ε－氨基偶聯(lián)。效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。

II環(huán)氧氯丙烷法：與－NH2

、―OH、―SH偶聯(lián)偶聯(lián)時(shí)需強(qiáng)烈條件，如pH11，50℃，適于特別穩(wěn)定的蛋白2011-10-30238第八章基因工程下游技術(shù)親和層析是以蛋白質(zhì)特殊結(jié)構(gòu)為分離基礎(chǔ)的。具體說(shuō)就是利用蛋白質(zhì)和介質(zhì)特殊的生物親和性或?qū)Ｒ恍院推渌鞍踪|(zhì)分離的柱層析方法。如酶-底物或抑制物,抗原-抗體。親和層析的三個(gè)基本條件是:偶聯(lián)凝膠:起支架作用；

配體:在支持物和分離物間起聯(lián)接作用,和分離物特異的親和吸附具有專一性,并且是可逆的。

間臂:由于生物大分子空間位阻作用,需加一間臂,長(zhǎng)度很重要,太短不起作用,太長(zhǎng)增加非特異性吸附,降低親和作用效率,親和層析具有分離純化目標(biāo)單一,回收率很高的特點(diǎn)。從理論上來(lái)講,其得到的是相當(dāng)純的物質(zhì),這種分離能力是其他任何柱層析都難以相比的,但由于親和層析柱制作工藝復(fù)雜,同時(shí)在色譜洗脫過(guò)程中配體不可避免的脫落,不但柱子的使用壽命有限,而且產(chǎn)品必須經(jīng)特別處理才可注射或服用,因此成本比較昂貴,一般不放在純化工藝的前面。2011-10-30248第八章基因工程下游技術(shù)2.4金屬螯合層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)中組氨酸等氨基酸殘基和介質(zhì)中特殊金屬離子進(jìn)行金屬螯合作用,形成絡(luò)合物以分離蛋白質(zhì)。洗脫方式：pH梯度洗脫、競(jìng)爭(zhēng)配體洗脫、有機(jī)溶劑洗脫、螯合劑洗脫。金屬螯合層析純化蛋白質(zhì)時(shí),金屬與蛋白質(zhì)表面暴露的氨基酸殘基作用，在分離相應(yīng)的蛋白質(zhì)時(shí)分離率和回收率也較高,它一般放在純化工藝的中后期。某些蛋白質(zhì)、氨基酸和一些金屬離子的特異親和力舉例如下:Cu2+與含氮化合物、單核苷酸、人乳鐵白;Ni+與含酪氨酸、色氨酸的蛋白質(zhì)或多肽;

Zn2+與含組氨酸、半胱氨酸的蛋白質(zhì)或多肽。2011-10-30258第八章基因工程下游技術(shù)液相層析技術(shù)是目前蛋白質(zhì)分離中最常用的技術(shù)之一,在基因工程產(chǎn)品下游處理中占有主要的地位。比較典型的系統(tǒng)和介質(zhì)Amershampharmaciabiotech蛋白液相層析系統(tǒng)(FPLC)AKTA系統(tǒng)高效液相色譜2.5液相層析技術(shù)2011-10-30268第八章基因工程下游技術(shù)2.6其它下游分離技術(shù)細(xì)胞破碎的常用方法

高壓勻漿法

高速珠磨法

超聲破碎

化學(xué)滲透（如EDTA、甲苯、TritonX-100、鹽酸胍、Urea)

酶溶法2011-10-30278第八章基因工程下游技術(shù)蛋白質(zhì)的鑒定（1）濃度鑒定

紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在280nm有吸收。

Lowry法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。

Bradford法：依據(jù)蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料的結(jié)合量測(cè)定。

凱氏定氮法

雙縮脲法（2）純度鑒定

電泳法：SDS－PAGE、IEF

化學(xué)法：N端測(cè)定、C端測(cè)定

儀器法：HPLC、質(zhì)譜、氨基酸組成分析2011-10-30288第八章基因工程下游技術(shù)（3）分子量測(cè)定

SDS－PAGE

凝膠過(guò)濾氨基酸組成分析毛細(xì)管電泳（4）等電點(diǎn)測(cè)定

等電聚焦電泳（5）活性測(cè)定

激酶：標(biāo)記ATP

磷酸化酶：定磷

ELISA2011-10-30298第八章基因工程下游技術(shù)固液分離：離心沉降——利用固體和液體之間的密度差膜分離技術(shù)：微孔膜過(guò)濾、超濾、反滲透、透析、電滲透凍干其他技術(shù)2011-10-30308第八章基因工程下游技術(shù)重組蛋白可在E.coli、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等體系中得到高效表達(dá),其表達(dá)形式一般可分為:(1)細(xì)胞外的分泌表達(dá);(2)細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá);(3)細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),即產(chǎn)物以包涵體的形式存在。因此對(duì)于重組蛋白的純化要依據(jù)其表達(dá)形式的不同,采取不同的純化工藝。例如,當(dāng)重組蛋白以包涵體形式存在時(shí),就需要對(duì)包涵體進(jìn)行變性-復(fù)性處理。四、基因工程產(chǎn)品的表達(dá)形式2011-10-30318第八章基因工程下游技術(shù)1.細(xì)胞質(zhì)表達(dá)很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白介素-6、人γ-干擾素等，不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒(méi)有生物活性的直徑約0.1～3.0μm的固體顆粒——包涵體。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，而其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。因此，為獲得天然狀態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必須在分離回收包涵體后，溶解包涵體并設(shè)法使其中的目標(biāo)蛋白質(zhì)恢復(fù)應(yīng)有的天然構(gòu)象和活性。2011-10-30328第八章基因工程下游技術(shù)包涵體的形成：原核、酵母和真核生物由于異源和同源蛋白過(guò)表達(dá)所形成的致密的不溶性顆粒。包涵體的形成與過(guò)表達(dá)蛋白的內(nèi)在性質(zhì)（如分子量、折疊途徑等）無(wú)直接關(guān)系。因?yàn)榇竽c桿菌胞質(zhì)環(huán)境是一個(gè)還原性環(huán)境，所以含有較多二硫鍵的蛋白較容易錯(cuò)誤折疊形成包涵體。相比之下，周質(zhì)空間有利于二硫鍵的形成，但是包涵體的形成也會(huì)發(fā)生。包含體的產(chǎn)生有利有弊。包涵體的性質(zhì)：致密（幾乎全部是過(guò)表達(dá)蛋白，雜質(zhì)主要是細(xì)菌外膜蛋白，離心時(shí)一起沉降）；通常對(duì)蛋白酶降解不敏感（發(fā)酵升溫至42℃可促進(jìn)包涵體形成并進(jìn)一步抑制蛋白酶）。分離包涵體并復(fù)性蛋白質(zhì)的操作步驟并不復(fù)雜，從破碎細(xì)胞開(kāi)始，然后將細(xì)胞勻漿離心，回收包涵體后，加入變性劑溶解包涵體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。2011-10-30338第八章基因工程下游技術(shù)包涵體的分離、溶解和復(fù)性溶菌酶處理—高壓勻漿（細(xì)胞破碎效率較重要）

離心（固-液相分離）

去污劑或/和低濃度尿素或鹽酸胍洗滌，去可溶性蛋白和膜蛋白

高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，可添加DTT打開(kāi)二硫鍵

逐步透析或稀釋去除變性劑2011-10-30348第八章基因工程下游技術(shù)2．細(xì)胞外周質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞外周質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)有許多優(yōu)越之處。（1）在外周質(zhì)只有4%的總細(xì)胞蛋白，這顯然有利于目的蛋白的純化（2）外周質(zhì)的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，在轉(zhuǎn)移到外周質(zhì)的過(guò)程中，信號(hào)肽在細(xì)胞內(nèi)剪切更有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然N-末端。（3）此外，外周質(zhì)中的蛋白質(zhì)降解也少得多。但是，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌外周質(zhì)是一個(gè)特別復(fù)雜和尚未完全明了的過(guò)程，信號(hào)肽的存在并不總能保證蛋白質(zhì)有效地通過(guò)內(nèi)膜。2011-10-30358第八章基因工程下游技術(shù)3.細(xì)胞外分泌表達(dá)

將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外是人們最期望的一種策略。因?yàn)檫@樣容易純化目的蛋白質(zhì)，減少細(xì)菌的蛋白酶對(duì)目的蛋白質(zhì)的降解。2011-10-30368第八章基因工程下游技術(shù)4.融合蛋白表達(dá)在E.coli中表達(dá)外源蛋白，尤其是真核蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是經(jīng)常遇到的問(wèn)題。最近幾年，眾多巧妙的蛋白質(zhì)——融合系統(tǒng)的發(fā)展，為E.coli中高效表達(dá)和純化重組蛋白提供了極