《病原體檢測基本技術(shù)》微生物檢測技術(shù)入門病原體鑒定與分析課程概述課程目標(biāo)掌握病原體檢測基本理論與技能學(xué)習(xí)內(nèi)容檢測原理、方法、應(yīng)用重要性病原體概念定義能引起宿主疾病的微生物1分類細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲2特征繁殖能力強、致病性、傳染性病原體檢測的意義疾病診斷確定病因、指導(dǎo)治療方案流行病學(xué)調(diào)查追蹤傳播途徑、控制疫情擴散公共衛(wèi)生防控病原體檢測的基本流程樣本采集選擇合適采樣部位和工具樣本處理保存、運輸、預(yù)處理檢測形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)果分析樣本采集（一）采集時機癥狀早期、用藥前、感染活躍期采集部位感染部位、對應(yīng)分泌物、體液采集工具樣本采集（二）無菌操作技術(shù)避免污染的關(guān)鍵步驟手部消毒無菌器具避免交叉污染個人防護(hù)裝備使用保護(hù)操作者安全防護(hù)服口罩手套樣本運輸與保存運輸條件生物安全容器、三層包裝保存溫度4°C、-20°C、-80°C、液氮保存時間實驗室生物安全生物安全級別BSL-1至BSL-4逐級防護(hù)個人防護(hù)與風(fēng)險等級匹配的防護(hù)措施廢棄物處理顯微鏡技術(shù)（一）1000×最大放大倍數(shù)油鏡下典型細(xì)菌觀察0.2μm分辨率光學(xué)顯微鏡極限3主要部件顯微鏡技術(shù)（二）檢查清潔度鏡頭無污染低倍鏡定位先找到視野高倍鏡觀察細(xì)菌培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基制備配方、溶解、滅菌、分裝質(zhì)量控制細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（一）接種方法：劃線接種、傾注平板、涂布平板、穿刺接種培養(yǎng)條件：溫度、pH值、氧氣需求細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（二）形態(tài)特征大小、形狀、邊緣、質(zhì)地顏色觀察色素產(chǎn)生、色素擴散溶血特性α溶血、β溶血、γ溶血純培養(yǎng)方法挑取單菌落、連續(xù)劃線培養(yǎng)革蘭氏染色結(jié)晶紫染色1分鐘碘液媒染1分鐘酒精脫色10-20秒復(fù)染30秒生化鑒定過氧化氫酶試驗產(chǎn)生氣泡為陽性氧化酶試驗變紫色為陽性吲哚試驗形成紅環(huán)為陽性血清學(xué)檢測（一）抗原抗體反應(yīng)原理特異性結(jié)合抗原決定簇抗體特異性免疫復(fù)合物形成凝集試驗肉眼可見的凝集反應(yīng)直接凝集間接凝集被動凝集凝集抑制血清學(xué)檢測（二）ELISA技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附測定直接免疫熒光標(biāo)記抗體直接檢測間接免疫熒光二抗放大信號分子生物學(xué)檢測概述核酸檢測原理特異性序列識別與擴增常用技術(shù)PCR、RT-PCR、基因測序優(yōu)勢靈敏度高、特異性強、速度快PCR技術(shù)（一）變性94-96°C，DNA雙鏈分離退火50-65°C，引物結(jié)合延伸72°C，DNA聚合酶合成PCR技術(shù)（二）樣本制備核酸提取與純化反應(yīng)體系構(gòu)建模板、引物、酶、緩沖液熱循環(huán)擴增多次循環(huán)，指數(shù)級擴增產(chǎn)物檢測瓊脂糖凝膠電泳分析實時熒光定量PCR原理實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物擴增熒光染料/探針熒光信號積累Ct值判定應(yīng)用優(yōu)勢傳統(tǒng)PCR技術(shù)升級定量分析靈敏度更高無需電泳減少污染風(fēng)險核酸擴增檢測的質(zhì)量控制陽性對照驗證檢測系統(tǒng)有效性弱陽性對照強陽性對照陰性對照監(jiān)測污染情況提取陰性對照擴增陰性對照內(nèi)參基因監(jiān)測抑制物與樣本質(zhì)量內(nèi)源性對照外源性對照病毒培養(yǎng)技術(shù)原代細(xì)胞傳代細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系雜交瘤病毒檢測方法細(xì)胞病變觀察形態(tài)改變、細(xì)胞融合、包涵體血凝試驗紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象電子顯微鏡觀察病毒顆粒直接可視化病毒中和試驗特異性抗體保護(hù)效應(yīng)病毒分離與鑒定樣本處理過濾、添加抗生素細(xì)胞接種選擇敏感細(xì)胞系培養(yǎng)觀察定期檢查CPE病毒收集凍融釋放病毒鑒定分型分子、血清學(xué)方法真菌檢測技術(shù)真菌培養(yǎng)基沙氏培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂玉米瓊脂真菌形態(tài)學(xué)觀察濕片法乳酸酚藍(lán)染色菌絲、孢子結(jié)構(gòu)寄生蟲檢測技術(shù)糞便檢查：直接涂片、濃縮法血液涂片：薄血膜、厚血膜快速診斷技術(shù)免疫層析技術(shù)15-30分鐘獲得結(jié)果快速PCR技術(shù)1-2小時完成檢測LAMP技術(shù)恒溫擴增，無需熱循環(huán)儀自動化檢測系統(tǒng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)生化反應(yīng)自動讀取分析自動化核酸提取儀標(biāo)準(zhǔn)化處理，減少誤差PCR工作站全流程自動化操作質(zhì)量控制（一）質(zhì)量政策實驗室管理承諾質(zhì)量手冊體系文件概述標(biāo)準(zhǔn)操作程序詳細(xì)操作指導(dǎo)記錄表格具體工作記錄質(zhì)量控制（二）內(nèi)部質(zhì)量控制日常操作監(jiān)控質(zhì)控品使用質(zhì)控圖分析平行檢測盲樣測試外部質(zhì)量評價第三方能力評估能力驗證計劃實驗室間比對熟練度測試認(rèn)證與認(rèn)可生物信息學(xué)在病原體檢測中的應(yīng)用序列分析同源性比對、變異點分析數(shù)據(jù)庫檢索GenBank、MLST、病原體專業(yè)庫進(jìn)化分析系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、分子流行病學(xué)功能預(yù)測毒力因子、耐藥基因、抗原表位新型冠狀病毒檢測技術(shù)靈敏度%特異性%呼吸道病原體檢測常見呼吸道病原體流感病毒呼吸道合胞病毒肺炎支原體肺炎鏈球菌多重PCR檢測技術(shù)同時檢測多種病原體快速全面篩查減少漏診誤診采樣方法鼻咽拭子痰液氣管抽吸物腸道病原體檢測細(xì)菌性病原體沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌病毒性病原體輪狀病毒、諾如病毒寄生蟲病原體阿米巴原蟲、賈第鞭毛蟲檢測方法培養(yǎng)、抗原檢測、分子診斷血液病原體檢測2-3血培養(yǎng)瓶數(shù)量有氧、厭氧、真菌5-10采血量(mL)成人推薦采血量5-7培養(yǎng)天數(shù)常規(guī)觀察時間24-72陽性檢出時間(h)典型菌株生長時間泌尿生殖系統(tǒng)病原體檢測尿培養(yǎng)中段尿，定量培養(yǎng)，判斷感染2直接鏡檢分泌物濕片，革蘭染色3分子檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體4抗原檢測快速診斷卡，現(xiàn)場檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢測腦脊液革蘭染色細(xì)菌性腦膜炎快速診斷CSF培養(yǎng)病原菌分離與鑒定分子檢測病毒性腦炎早期診斷皮膚軟組織感染病原體檢測直接鏡檢KOH溶解，觀察菌絲孢子真菌培養(yǎng)沙氏培養(yǎng)基，鑒別診斷細(xì)菌培養(yǎng)傷口拭子，膿液采集分子鑒定難培養(yǎng)病原體檢測醫(yī)院感染病原體檢測篩查選擇性培養(yǎng)基，快速檢測2確認(rèn)生化鑒定，分子診斷耐藥性分析藥敏試驗，耐藥基因檢測分型監(jiān)測PFGE，MLST，全基因組測序食源性病原體檢測人畜共患病病原體檢測布魯氏菌檢測選擇性培養(yǎng)基血清學(xué)試驗PCR檢測狂犬病病毒檢測FAT熒光抗體測試RT-PCR檢測病毒分離炭疽芽胞桿菌檢測革蘭染色鏡檢莢膜染色特異性基因檢測蟲媒傳染病病原體檢測瘧疾檢測寄生蟲血液學(xué)檢查薄血膜鏡檢厚血膜鏡檢快速診斷試劑盒PCR檢測登革熱病毒檢測病毒學(xué)診斷方法病毒分離NS1抗原檢測IgM/IgG血清學(xué)RT-PCR檢測生物武器相關(guān)病原體檢測1炭疽芽胞桿菌莢膜染色、PCR檢測保護(hù)抗原基因2肉毒桿菌毒素小鼠生物測定、ELISA、質(zhì)譜分析3鼠疫桿菌F1抗原檢測、特異性基因PCR擴增4天花病毒電子顯微鏡、實時PCR、抗原檢測新發(fā)再發(fā)傳染病病原體檢測埃博拉病毒：RT-PCR、抗原檢測、IgM抗體寨卡病毒：尿液RT-PCR、血清學(xué)檢測病原體耐藥性檢測K-B紙片擴散法抑菌環(huán)直徑判讀耐藥性MIC微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度確定耐藥基因檢測PCR檢測特異性耐藥基因自動化藥敏系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化操作，快速結(jié)果病原體分型技術(shù)血清型分型基于表面抗原的分類凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)單克隆抗體分子分型基于核酸特征的分類PFGE脈沖場凝膠電泳MLST多位點序列分型MLVA多位點可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析全基因組測序分型病原體全基因組測序核酸提取純化高質(zhì)量DNA/RNA獲取文庫構(gòu)建片段化、接頭連接測序反應(yīng)第二代/第三代測序平臺數(shù)據(jù)分析組裝、注釋、比較基因組學(xué)宏基因組學(xué)在病原體檢測中的應(yīng)用原理與方法不依賴培養(yǎng)的整體檢測無選擇性擴增所有微生物同時檢測高通量測序生物信息學(xué)分析優(yōu)勢與局限性整體微生物譜分析優(yōu)勢：無培養(yǎng)偏倚、發(fā)現(xiàn)新病原體局限：靈敏度低、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜成本高、標(biāo)準(zhǔn)化難病原體檢測結(jié)果解釋定性結(jié)果解釋陽性/陰性判讀，臨床意義分析定量結(jié)果解釋載量分析，參考范圍比較干擾因素分析抗生素使用，標(biāo)本質(zhì)量評價驗證重復(fù)檢測關(guān)鍵結(jié)果確認(rèn)，異常值核查病原體檢測報告書寫報告內(nèi)容詳細(xì)要求基本信息患者資料、檢測項目、采樣時間檢測結(jié)果陽性/陰性判定、定量值、參考范圍結(jié)果解釋臨床意義、注意事項、建議簽名授權(quán)檢驗者、審核者、報告日期臨床溝通技巧了解臨床需求詢問診斷假設(shè)，明確檢測目的提供專業(yè)建議檢測方法選擇，標(biāo)本采集指導(dǎo)結(jié)果解釋臨床相關(guān)性分析，進(jìn)一步檢測建議反饋機制溝通渠道建立，持續(xù)改進(jìn)流程病原體檢測新技術(shù)展望CRISPR診斷技術(shù)特異性核酸識別與切割納米孔測序?qū)崟r長讀長測序數(shù)字PCR單分子絕對定量病原體檢測與精準(zhǔn)醫(yī)療病原體鑒定精確至種、型水平1耐藥特性分析藥物敏感性預(yù)測2個體化治療針對性抗感染方案3療效監(jiān)測定量檢測隨訪4病原體檢測與流行病學(xué)病例發(fā)現(xiàn)快速準(zhǔn)確檢測確認(rèn)2分子分型追蹤傳播鏈3傳播網(wǎng)絡(luò)分析確定傳染源，預(yù)測流行趨勢4干預(yù)措施實施針對性防控策略病原體檢測與疫苗研發(fā)疫苗靶點篩選保守區(qū)域分析抗原表位預(yù)測免疫原性評估疫苗效果評估中和抗體檢測T細(xì)胞免疫監(jiān)測突破性感染分析持續(xù)監(jiān)測病原變異追蹤免疫逃避分析疫苗更新策略病原體檢測倫理問題1患者權(quán)益保障自主決定權(quán)隱私保護(hù)結(jié)果保密與安全