《病原體檢測基本技術》微生物檢測技術入門病原體鑒定與分析課程概述課程目標掌握病原體檢測基本理論與技能學習內容檢測原理、方法、應用重要性病原體概念定義能引起宿主疾病的微生物1分類細菌、病毒、真菌、寄生蟲2特征繁殖能力強、致病性、傳染性病原體檢測的意義疾病診斷確定病因、指導治療方案流行病學調查追蹤傳播途徑、控制疫情擴散公共衛(wèi)生防控病原體檢測的基本流程樣本采集選擇合適采樣部位和工具樣本處理保存、運輸、預處理檢測形態(tài)學、培養(yǎng)、免疫學、分子生物學結果分析樣本采集（一）采集時機癥狀早期、用藥前、感染活躍期采集部位感染部位、對應分泌物、體液采集工具樣本采集（二）無菌操作技術避免污染的關鍵步驟手部消毒無菌器具避免交叉污染個人防護裝備使用保護操作者安全防護服口罩手套樣本運輸與保存運輸條件生物安全容器、三層包裝保存溫度4°C、-20°C、-80°C、液氮保存時間實驗室生物安全生物安全級別BSL-1至BSL-4逐級防護個人防護與風險等級匹配的防護措施廢棄物處理顯微鏡技術（一）1000×最大放大倍數(shù)油鏡下典型細菌觀察0.2μm分辨率光學顯微鏡極限3主要部件顯微鏡技術（二）檢查清潔度鏡頭無污染低倍鏡定位先找到視野高倍鏡觀察細菌培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基類型基礎培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基制備配方、溶解、滅菌、分裝質量控制細菌培養(yǎng)技術（一）接種方法：劃線接種、傾注平板、涂布平板、穿刺接種培養(yǎng)條件：溫度、pH值、氧氣需求細菌培養(yǎng)技術（二）形態(tài)特征大小、形狀、邊緣、質地顏色觀察色素產生、色素擴散溶血特性α溶血、β溶血、γ溶血純培養(yǎng)方法挑取單菌落、連續(xù)劃線培養(yǎng)革蘭氏染色結晶紫染色1分鐘碘液媒染1分鐘酒精脫色10-20秒復染30秒生化鑒定過氧化氫酶試驗產生氣泡為陽性氧化酶試驗變紫色為陽性吲哚試驗形成紅環(huán)為陽性血清學檢測（一）抗原抗體反應原理特異性結合抗原決定簇抗體特異性免疫復合物形成凝集試驗肉眼可見的凝集反應直接凝集間接凝集被動凝集凝集抑制血清學檢測（二）ELISA技術酶聯(lián)免疫吸附測定直接免疫熒光標記抗體直接檢測間接免疫熒光二抗放大信號分子生物學檢測概述核酸檢測原理特異性序列識別與擴增常用技術PCR、RT-PCR、基因測序優(yōu)勢靈敏度高、特異性強、速度快PCR技術（一）變性94-96°C，DNA雙鏈分離退火50-65°C，引物結合延伸72°C，DNA聚合酶合成PCR技術（二）樣本制備核酸提取與純化反應體系構建模板、引物、酶、緩沖液熱循環(huán)擴增多次循環(huán)，指數(shù)級擴增產物檢測瓊脂糖凝膠電泳分析實時熒光定量PCR原理實時監(jiān)測PCR產物擴增熒光染料/探針熒光信號積累Ct值判定應用優(yōu)勢傳統(tǒng)PCR技術升級定量分析靈敏度更高無需電泳減少污染風險核酸擴增檢測的質量控制陽性對照驗證檢測系統(tǒng)有效性弱陽性對照強陽性對照陰性對照監(jiān)測污染情況提取陰性對照擴增陰性對照內參基因監(jiān)測抑制物與樣本質量內源性對照外源性對照病毒培養(yǎng)技術原代細胞傳代細胞系連續(xù)細胞系雜交瘤病毒檢測方法細胞病變觀察形態(tài)改變、細胞融合、包涵體血凝試驗紅細胞凝集現(xiàn)象電子顯微鏡觀察病毒顆粒直接可視化病毒中和試驗特異性抗體保護效應病毒分離與鑒定樣本處理過濾、添加抗生素細胞接種選擇敏感細胞系培養(yǎng)觀察定期檢查CPE病毒收集凍融釋放病毒鑒定分型分子、血清學方法真菌檢測技術真菌培養(yǎng)基沙氏培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂玉米瓊脂真菌形態(tài)學觀察濕片法乳酸酚藍染色菌絲、孢子結構寄生蟲檢測技術糞便檢查：直接涂片、濃縮法血液涂片：薄血膜、厚血膜快速診斷技術免疫層析技術15-30分鐘獲得結果快速PCR技術1-2小時完成檢測LAMP技術恒溫擴增，無需熱循環(huán)儀自動化檢測系統(tǒng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)生化反應自動讀取分析自動化核酸提取儀標準化處理，減少誤差PCR工作站全流程自動化操作質量控制（一）質量政策實驗室管理承諾質量手冊體系文件概述標準操作程序詳細操作指導記錄表格具體工作記錄質量控制（二）內部質量控制日常操作監(jiān)控質控品使用質控圖分析平行檢測盲樣測試外部質量評價第三方能力評估能力驗證計劃實驗室間比對熟練度測試認證與認可生物信息學在病原體檢測中的應用序列分析同源性比對、變異點分析數(shù)據(jù)庫檢索GenBank、MLST、病原體專業(yè)庫進化分析系統(tǒng)發(fā)育樹構建、分子流行病學功能預測毒力因子、耐藥基因、抗原表位新型冠狀病毒檢測技術靈敏度%特異性%呼吸道病原體檢測常見呼吸道病原體流感病毒呼吸道合胞病毒肺炎支原體肺炎鏈球菌多重PCR檢測技術同時檢測多種病原體快速全面篩查減少漏診誤診采樣方法鼻咽拭子痰液氣管抽吸物腸道病原體檢測細菌性病原體沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌病毒性病原體輪狀病毒、諾如病毒寄生蟲病原體阿米巴原蟲、賈第鞭毛蟲檢測方法培養(yǎng)、抗原檢測、分子診斷血液病原體檢測2-3血培養(yǎng)瓶數(shù)量有氧、厭氧、真菌5-10采血量(mL)成人推薦采血量5-7培養(yǎng)天數(shù)常規(guī)觀察時間24-72陽性檢出時間(h)典型菌株生長時間泌尿生殖系統(tǒng)病原體檢測尿培養(yǎng)中段尿，定量培養(yǎng)，判斷感染2直接鏡檢分泌物濕片，革蘭染色3分子檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體4抗原檢測快速診斷卡，現(xiàn)場檢測中樞神經系統(tǒng)感染病原體檢測腦脊液革蘭染色細菌性腦膜炎快速診斷CSF培養(yǎng)病原菌分離與鑒定分子檢測病毒性腦炎早期診斷皮膚軟組織感染病原體檢測直接鏡檢KOH溶解，觀察菌絲孢子真菌培養(yǎng)沙氏培養(yǎng)基，鑒別診斷細菌培養(yǎng)傷口拭子，膿液采集分子鑒定難培養(yǎng)病原體檢測醫(yī)院感染病原體檢測篩查選擇性培養(yǎng)基，快速檢測2確認生化鑒定，分子診斷耐藥性分析藥敏試驗，耐藥基因檢測分型監(jiān)測PFGE，MLST，全基因組測序食源性病原體檢測人畜共患病病原體檢測布魯氏菌檢測選擇性培養(yǎng)基血清學試驗PCR檢測狂犬病病毒檢測FAT熒光抗體測試RT-PCR檢測病毒分離炭疽芽胞桿菌檢測革蘭染色鏡檢莢膜染色特異性基因檢測蟲媒傳染病病原體檢測瘧疾檢測寄生蟲血液學檢查薄血膜鏡檢厚血膜鏡檢快速診斷試劑盒PCR檢測登革熱病毒檢測病毒學診斷方法病毒分離NS1抗原檢測IgM/IgG血清學RT-PCR檢測生物武器相關病原體檢測1炭疽芽胞桿菌莢膜染色、PCR檢測保護抗原基因2肉毒桿菌毒素小鼠生物測定、ELISA、質譜分析3鼠疫桿菌F1抗原檢測、特異性基因PCR擴增4天花病毒電子顯微鏡、實時PCR、抗原檢測新發(fā)再發(fā)傳染病病原體檢測埃博拉病毒：RT-PCR、抗原檢測、IgM抗體寨卡病毒：尿液RT-PCR、血清學檢測病原體耐藥性檢測K-B紙片擴散法抑菌環(huán)直徑判讀耐藥性MIC微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度確定耐藥基因檢測PCR檢測特異性耐藥基因自動化藥敏系統(tǒng)標準化操作，快速結果病原體分型技術血清型分型基于表面抗原的分類凝集反應沉淀反應單克隆抗體分子分型基于核酸特征的分類PFGE脈沖場凝膠電泳MLST多位點序列分型MLVA多位點可變數(shù)串聯(lián)重復分析全基因組測序分型病原體全基因組測序核酸提取純化高質量DNA/RNA獲取文庫構建片段化、接頭連接測序反應第二代/第三代測序平臺數(shù)據(jù)分析組裝、注釋、比較基因組學宏基因組學在病原體檢測中的應用原理與方法不依賴培養(yǎng)的整體檢測無選擇性擴增所有微生物同時檢測高通量測序生物信息學分析優(yōu)勢與局限性整體微生物譜分析優(yōu)勢：無培養(yǎng)偏倚、發(fā)現(xiàn)新病原體局限：靈敏度低、數(shù)據(jù)分析復雜成本高、標準化難病原體檢測結果解釋定性結果解釋陽性/陰性判讀，臨床意義分析定量結果解釋載量分析，參考范圍比較干擾因素分析抗生素使用，標本質量評價驗證重復檢測關鍵結果確認，異常值核查病原體檢測報告書寫報告內容詳細要求基本信息患者資料、檢測項目、采樣時間檢測結果陽性/陰性判定、定量值、參考范圍結果解釋臨床意義、注意事項、建議簽名授權檢驗者、審核者、報告日期臨床溝通技巧了解臨床需求詢問診斷假設，明確檢測目的提供專業(yè)建議檢測方法選擇，標本采集指導結果解釋臨床相關性分析，進一步檢測建議反饋機制溝通渠道建立，持續(xù)改進流程病原體檢測新技術展望CRISPR診斷技術特異性核酸識別與切割納米孔測序實時長讀長測序數(shù)字PCR單分子絕對定量病原體檢測與精準醫(yī)療病原體鑒定精確至種、型水平1耐藥特性分析藥物敏感性預測2個體化治療針對性抗感染方案3療效監(jiān)測定量檢測隨訪4病原體檢測與流行病學病例發(fā)現(xiàn)快速準確檢測確認2分子分型追蹤傳播鏈3傳播網絡分析確定傳染源，預測流行趨勢4干預措施實施針對性防控策略病原體檢測與疫苗研發(fā)疫苗靶點篩選保守區(qū)域分析抗原表位預測免疫原性評估疫苗效果評估中和抗體檢測T細胞免疫監(jiān)測突破性感染分析持續(xù)監(jiān)測病原變異追蹤免疫逃避分析疫苗更新策略病原體檢測倫理問題1患者權益保障自主決定權隱私保護結果保密與安全