任務一組織培養(yǎng)認知任務二實驗設備和培養(yǎng)條件模塊一組配實驗室設計與管理項目一組培實驗室與管理任務一組織培養(yǎng)認知知識目標掌握組織培養(yǎng)的概念和類型；掌握組織培養(yǎng)的特點；一般掌握組織培養(yǎng)發(fā)展史；初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實踐上的應用。1234技能目標掌握組培實驗室的構(gòu)成。能夠合理設計組培實驗室。12任務講解緒

論第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢緒

論圖1-1植物的組織培養(yǎng)緒

論分株繁殖壓條繁殖播種繁殖嫁接繁殖緒

論扦插繁殖組織培養(yǎng)繁殖第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念

是指在無菌條件下，將離體的植物器官（根、莖、葉、花、果實等）、組織（形成層、花藥組織、皮層、胚乳等）、細胞（體細胞和生殖細胞）以及原生質(zhì)體（即外植體explant），培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進行培養(yǎng)，使其長成完整的植株。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念

1.狹義概念指對植物體組織或由植物器官培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)直至生成完整植株。

2.廣義概念無菌操作分離植物體一部分（即外植體）接種到培養(yǎng)基，在人工條件下培養(yǎng)直至生成完整植株。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念

外植體由活體植物上切取下來用以進行培養(yǎng)的那部分器官、組織、細胞等。細胞全能性——（理論基礎）一個完整的植物細胞擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息。即：細胞具有形成完整植株的潛在能力，給其適宜的條件就能形成一個完整的植株。

1902年Haberlandt就預言：細胞具有全能性（1958年得到證實——胡蘿卜根的韌皮部細胞懸浮培養(yǎng)，誘導形成胚，發(fā)育成完整植株）第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念胚軸花粉胚乳胚種子果實花器葉芽莖根組織原生質(zhì)體子葉子房苞片胚珠花藥花梗分生組織成熟組織花托葉柄幼苗外植體第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念組織分裂分化細胞分裂脫分化分裂再分化器官植株已分化組織細胞第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)的類型1.根據(jù)培養(yǎng)基分類圖1-2組織培養(yǎng)的類型（a）第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)的類型2.根據(jù)培養(yǎng)材料不同分類圖1-3組織培養(yǎng)的類型（b）第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念（1）植株培養(yǎng)（plantculture）是對完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念（2）器官培養(yǎng)（organculture）即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養(yǎng)。莖段培養(yǎng)成苗示意圖第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念圖1-4莖段培養(yǎng)成苗示意圖第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念（3）組織或愈傷組織培養(yǎng)（tissueorcallusculture）為狹義的組織培養(yǎng)。是對植物體的各部分組織進行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導形成植株。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念

愈傷組織：在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在植物體切面上產(chǎn)生。圖1-5愈傷組織第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念圖1-6胡蘿卜形成層（分生組織）培養(yǎng)示意圖第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念（4）細胞培養(yǎng)（cellculture）是對由愈傷組織等進行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養(yǎng)。

第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念圖1-7細胞培養(yǎng)的分類第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念（5）原生質(zhì)體培養(yǎng)（proplastculture）是用酶及物理方法除去細胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念非融合培養(yǎng)融合培養(yǎng)原生質(zhì)培養(yǎng)圖1-8原生質(zhì)培養(yǎng)的分類第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念植物體脫分化不定器官或體細胞胚

再分化

完整植株

圖1-9植物組織培養(yǎng)全過程愈傷組織第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念初代培養(yǎng)

芽、莖段、葉片、花器等外植體在離體培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織、側(cè)芽或不定芽、胚狀體過程。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念視頻1-1初代培養(yǎng)第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念對應于種子胚而言，在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。胚狀體圖1-10

石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念繼代培養(yǎng)更換新鮮培養(yǎng)基來繁殖同種類型的材料（愈傷組織、芽）。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念生根培養(yǎng)將芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)成為完整植株的過程。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念愈傷組織培養(yǎng)是最常見的形式。愈傷組織：植物受傷后在表面形成的一團薄壁細胞。組織培養(yǎng)上指外植體形成的薄壁細胞。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念脫分化

即成熟細胞或分化細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程。再分化

由形成的愈傷組織再形成完整植株的過程叫再分化（再生、分化）。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念馴化移栽組培苗經(jīng)人工煉苗后移栽到馴化苗床上使之適應露地或保護地條件的過程。視頻1-2生根培養(yǎng)第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念圖1-11植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)條件：

含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時光照等。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)是本世紀發(fā)展起來的一門新技術(shù)，由于科學技術(shù)的進步，尤其是外源激素的應用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學科提出了可靠的實驗證據(jù)，而且一躍成為一種大規(guī)模、批量工廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在生產(chǎn)上越來越得到廣泛的應用。第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念培養(yǎng)條件可以人為加以控制第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念繁殖系數(shù)大，培養(yǎng)周期短第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念管理方便，有利于實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)和自動化控制第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史探索中——20世紀初—20世紀30年代中奠基末——20世紀30年代中—50年代末迅速發(fā)展——20世紀60年代至現(xiàn)在第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

20世紀初，在Schleiden和Schwann所發(fā)展起來的細胞學說的推動下，1902年德國植物學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織為許多細胞組成的觀點，以及植物細胞全能性的理論。即植物的體細胞，在適當?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛在能力。他首次發(fā)表了植物離體細胞培養(yǎng)實驗的報告。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史我愿意指出：在我的培養(yǎng)實驗中，雖然經(jīng)常觀察到細胞的明顯生長，但從未觀察到細胞分裂。發(fā)現(xiàn)單細胞培養(yǎng)的條件，將是未來培養(yǎng)試驗的難題。在未來，人們可以成功地從營養(yǎng)細胞培養(yǎng)出人工胚?！蛾P(guān)于單離植物細胞培養(yǎng)實驗》Haberlandt第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史直到1934年美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系，并反復轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實驗獲得了真正的成功，并在以后28年間培養(yǎng)了1600代。這之后，White以小麥根尖為材料，研究了光、溫度、通氣、pH值、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對生長的影響，并于1937年建立了第一個組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成分均為已知化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來被定名為White培養(yǎng)基。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

Gautherer（1934）在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實驗中，提出了B族維生素和生長素對組織培養(yǎng)的重要意義，并于1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被譽為組織培養(yǎng)學科的奠基人。我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本上都是由這三位科學家建立的。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史組織培養(yǎng)的奠基人第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

40年代Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長素（1AA）對芽形成的抑制作用，而能誘導形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時，產(chǎn)生芽；這一比例低時，則形成根；相等則不分化。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

Miller等人于1956年發(fā)現(xiàn)了激動素。不久即知道激動素可以代替腺嘌呤促進發(fā)芽，并且效果可增加3萬倍。結(jié)果上述控制器官分化的激素模式變?yōu)榧铀嘏c生長素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)，有力地推動了植物組織培養(yǎng)的發(fā)展。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有很大的應用價值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。在整個植物組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中，我國學者做出多方面的貢獻，除了前述的崔徵的研究成效以外，還有1993年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的研究工作，以及羅士韋關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚的研究培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚的研究培養(yǎng)工作。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

1952年，Morel和Martin通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無病毒植株。

1935-1945年Muir把單細胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細胞發(fā)生了分裂，即實施了看護培養(yǎng)，使單細胞培養(yǎng)獲得初步成功。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實踐上為外源基因的導入提供了理想的受體材料。

1962年印度Guha等人成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導得到單倍體植株，從而促進了花藥和花粉培養(yǎng)的研究。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系

（1）快速繁殖種苗用組織培養(yǎng)的方法進行快速繁殖是生產(chǎn)上最有潛力的應用，包括花卉觀賞植物、蔬菜、果樹、大田作物及其他經(jīng)濟作物。快繁技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制，生長周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進行增殖。通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產(chǎn)生大量腋芽；通過根、葉等器官直接誘導產(chǎn)生不定芽；通過愈傷組織培養(yǎng)誘導產(chǎn)生不定芽。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系試管快速繁殖的應用：繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無病毒苗。繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。

1個莖尖一年可繁殖10000—1000000個。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系

（2）無病毒苗的培養(yǎng)自從Morell952年發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結(jié)合，則可提高脫毒培養(yǎng)的效果。已應用于馬鈴薯，甘薯，草莓，蘋果，香石竹，菊花等。已有不少地區(qū)建立了無病毒苗的生產(chǎn)中心，這對于無病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個規(guī)范的系統(tǒng)程序。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系

（3）在育種上的應用花藥培養(yǎng)單倍體植株：在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)過多代自交，而單倍體育種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限?；ㄋ?、花粉的培養(yǎng)在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系用原生質(zhì)體進行個體細胞雜交和基因轉(zhuǎn)移：原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交技術(shù)的開發(fā)，在育種上展現(xiàn)了一幅嶄新的前景。已有多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植物，有些植物得到體細胞雜種，無論在理論和實踐上都有重要價值。隨著這方面工作的深入和水平的提高，原生質(zhì)體培養(yǎng)一定會在育種上產(chǎn)生深遠的影響。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系用子房、胚和胚珠完成胚的試管發(fā)育和試管受精，以及種質(zhì)資源的保存等等：大白菜X甘藍的遠緣雜交種“白蘭”（甘藍型油菜），就是通過雜種胚的培養(yǎng)而得到的。利用胚珠和子房培養(yǎng)也可進行試管受精，以克服柱頭或花柱對受精的障礙，使花粉管直接進入胚珠而受精。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系利用組織培養(yǎng)可以進行突變體的篩選。突變的產(chǎn)生因部位而異，莖尖遺傳性比較穩(wěn)定，根、莖、葉乃至愈傷組織和細胞的培養(yǎng)則變異率就較大。培養(yǎng)基的激素也會誘導變異，因濃度而不同。此外還可采用紫外線、x射線、Y射線對材料進行照射，來誘發(fā)突變的產(chǎn)生。在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生多倍體、混倍體現(xiàn)象的比較多，產(chǎn)生的變異為育種提供的材料，可以根據(jù)需要進行篩選。利用組織培養(yǎng)，在細胞水平上進行突變體的篩選更加富有成效。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系

（4）工廠化育苗組織培養(yǎng)育苗工廠化生產(chǎn)，是以植物組織培養(yǎng)為基礎，在含有植物生長發(fā)育必需物質(zhì)的人工合成培養(yǎng)基上，并附加一定量的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，把脫離于完整植株的本來已經(jīng)分化的植物器官或細胞，接種在不同的培養(yǎng)基上。在一定的溫度、光照、濕度及pH值條件下，利用細胞的全能性以及原有的遺傳基礎，促使細胞重新分裂、分化長成新的組織、器官或不定芽，最后長成和母株同樣的小植物體。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)育苗的工廠化生產(chǎn)，就是取樣品株一定部位的葉片為材料，消毒后切成一定大小的塊，接種在適宜的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，兩個月左右在切口處產(chǎn)生不定芽，這些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此繼續(xù)，即可獲得批量的幼小植株，按需要量生產(chǎn)與樣品株完全相同的苗子。組織培養(yǎng)育苗的無毒化生產(chǎn)，還可減少病害傳播，更符合國際植物檢疫標準的要求，增加產(chǎn)品市場的銷售能力，同時可以減少氣候條件對幼苗繁殖的影響，緩和供需矛盾。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系世界上一些先進國家園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展從60年代就已經(jīng)開始，并隨著生長、分化規(guī)律性探索的逐步深化，到了70年代僅花卉業(yè)就已在蘭花、百合、非洲菊、大巖桐、菊花、香石竹、矮牽牛等二十幾種花卉幼苗生產(chǎn)上建立起大規(guī)模試管苗商品化生產(chǎn)，到1984年世界花卉幼苗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)總值已達20億美元，其中美國花卉幼苗市場總值為6億多美元，日本三友種苗公司有60％的幼苗靠組織培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系繁殖。1985年僅蘭花一項，在美國注冊的公司就有100余家，年銷售額在1億美元以上。由于組織培養(yǎng)技術(shù)的應用，加快了花卉新品種的推廣。以前靠常規(guī)方法推廣一個新品種要幾年甚至十多年，而現(xiàn)在快的只要1-2年就可在世界范圍內(nèi)達到普及和應用。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系我國采用快速繁殖技術(shù)，也使優(yōu)良品種達到迅速的推廣和應用。如廣東切花菊“黃秀風”的應用，使菊花變大，長勢加強，花色鮮艷，抗病力增強，打開了進入香港市場的渠道，使30多種觀葉植物的推廣很快遍及全國，豐富了人們的生活，并將自然界的幾百個野生金錢蓮品種繁種馴化，培養(yǎng)了一批園林垂直綠化的材料，促進了園林業(yè)的發(fā)展。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系視頻1-3組織培養(yǎng)用途簡介第三節(jié)植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系植物組織培養(yǎng)也存在一定的困難，首先是繁殖效率與商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解決，因而無法滿足生產(chǎn)的需要，其次是在培養(yǎng)過程中如何減少變異株的發(fā)生。更重要的是應降低組培苗工廠化生產(chǎn)的成本，只有降低成本，才能更好的投產(chǎn)應用。第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢植物組織培養(yǎng)的商業(yè)化應用始于70年代，1985年全球年產(chǎn)組培苗量約1.3億株，到1991年已達5.13億株。在1996年，僅印度全國年產(chǎn)組培苗已超過1.9億株。組培苗的世界年生產(chǎn)量每年以10—15％的速率遞增。即便組培產(chǎn)業(yè)發(fā)展如此迅速，需求仍超過生產(chǎn)，這為該產(chǎn)業(yè)留下了足夠的發(fā)展空間。2000年預計全球年產(chǎn)組培苗已達15億株。第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢早期，組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)主要集中在發(fā)達國家，象美國、荷蘭等，但高昂的勞動力成本已成為組培產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大制約因素。相反在發(fā)展中國家，低廉的工資能生產(chǎn)出低成本的試管植物。如印度的微繁工業(yè)，起步雖比西方晚了近10年，而產(chǎn)量卻從1988年的500萬株躍升到1996年1.9億株，企業(yè)數(shù)量相應地從4家發(fā)展到75家。因此業(yè)內(nèi)人士認為，組培產(chǎn)業(yè)今后發(fā)展的趨勢是東移和南移，由發(fā)達國家向勞動力低廉的發(fā)展中國家轉(zhuǎn)移。第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢我國目前從事組織培養(yǎng)人員和實驗室面積居世界第一，估計約有3000個以上的單位和個人從事這一工作，人數(shù)2萬人以上。我國擁有大量的優(yōu)秀科技人才，植物種質(zhì)資源豐富，勞動力價格相對比較低廉，操作工人一般是年輕的女工，在發(fā)達國家勞動力價格高昂，而在不發(fā)達國家，年輕的婦女大都沒有文化，很難適應這一技術(shù)比較高的工作，因此我國在這方面具有很大的優(yōu)勢。另外我國在技術(shù)上也有一定的積累，例如北方的脫毒馬鈴薯，中原地區(qū)的第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢脫毒大蒜，華南的脫毒香蕉組培苗以及一些花卉組培苗已進入規(guī)模化生產(chǎn)，因此完全有可能成為今后世界上組培苗的主要生產(chǎn)國和外資在這方面投入的一個主要國家；與此同時不少具有實力的企業(yè)也投資效益農(nóng)業(yè)，故近一、二年組培企業(yè)如雨后春筍，估計我國的組培苗生產(chǎn)企業(yè)負荷運轉(zhuǎn)的話，生產(chǎn)量可超過3億株。目前，觀賞植物、園藝作物、經(jīng)濟林木、無性繁殖作物等部分或大部分都用離體快繁提供苗木，試管苗已出現(xiàn)在國內(nèi)外市場上并形成產(chǎn)業(yè)化。第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢由于沒有詳盡的調(diào)查，根據(jù)報道廣東200個，廣西和四川150，江蘇和湖南120，山東、河北、遼寧各100，甘肅70。（96年報道的組織培養(yǎng)單位）培養(yǎng)的植物種類約445種，木本150，花卉139，藥用植物53，園藝植物29，草本小果9，谷物和豆類44，其他16。具有一定規(guī)模的50—60種，年生產(chǎn)種薯8000萬株。第四節(jié)國內(nèi)外組織培養(yǎng)概況及發(fā)展趨勢我國的組培技術(shù)雖有一定成效，但發(fā)展不大，效益不高，原因：市場問題；成本問題；技術(shù)問題；管理問題；人員問題等。任務小結(jié)植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官（根、莖、葉、花、果實等）、組織（形成層、花藥組織、皮層、胚乳等）、細胞（體細胞和生殖細胞）以及原生質(zhì)體（即外植體explant），培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進行培養(yǎng)，使其長成完整的植株按照外植體的不同，組織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)5種類型。12任務小結(jié)組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于工廠化生產(chǎn)的突出特點，因而發(fā)展迅速。組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用主要體現(xiàn)于以下幾個方面：快速繁殖優(yōu)良苗木；獲得脫毒苗；育種上應用；工廠化育苗。34思考練習什么是廣義的植物組織培養(yǎng)？什么是狹義的植物組織培養(yǎng)？什么是“外植體”？按照外植體的不同，植物組織培養(yǎng)可以分成幾類？比較常用的是哪些？植物組織培養(yǎng)有哪些特點？你認為植物組織培養(yǎng)技術(shù)在當前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有什么價值？為什么？12345單元二實驗設備和培養(yǎng)條件技能目標掌握組織培養(yǎng)實技能目標驗室的設計；掌握組織培養(yǎng)常用的實驗儀器設備及其使用方法；掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。123任務導入在進行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應對工作中需要哪些最基本的設備條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實驗室。實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實驗室規(guī)模太小，會限制生產(chǎn)，影響效率。在設計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。任務導入AGlimpseofPlantTissueCulture任務導入實驗室設置及儀器

植物組織培養(yǎng)技術(shù)性很強，無菌條件很高，要求有最基本的實驗設備條件及熟悉一般操作技術(shù)才可以進行。去分化再分化整個操作核心是無菌操作。

要點：設備設施、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件。

植物組織培養(yǎng)通常是外植體愈傷組織植株任務導入實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。實驗室組成：化學實驗室[準備室]、洗滌室、無菌室（接種室）、培養(yǎng)室、觀察室。任務導入圖1-12實驗室布局示意圖任務講解第一節(jié)實驗室第二節(jié)設備和器材第三節(jié)培養(yǎng)條件第一節(jié)實驗室實驗室要求

環(huán)境要求：理想的植物組織培養(yǎng)實驗室應該建立在安靜、清潔、遠離污染源的地方，最好在常年主風向的上風方向，盡量減少污染。規(guī)?；a(chǎn)的實驗室最好建在交通方便的地方，便于產(chǎn)品的運送。實驗室的建設均需考慮兩個方面的問題：一是所從事的實驗的性質(zhì)，即是生產(chǎn)性的還是研究性的，是基本層次的還是較高層次的；二是實驗室的規(guī)模，規(guī)模主要取決于經(jīng)費和實驗性質(zhì)。第一節(jié)實驗室

實驗室設置的基本原則是：科學、高效、經(jīng)濟和實用。一個植物組織培養(yǎng)實驗室必須滿足3個基本的需要：實驗準備（培養(yǎng)基制備、器皿洗滌、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿滅菌）、無菌操作和控制培養(yǎng)。此外，還可根據(jù)所從事的實驗要求來考慮輔助實驗室及其各種附加設施，使實驗室更加完善。第一節(jié)實驗室一、洗滌室洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應配備大型水槽，最好是不銹鋼水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運輸培養(yǎng)器皿。備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。視頻1-4洗滌第一節(jié)實驗室二、準備室準備室要求明亮、通風。在準備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備。負責母液、培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。第一節(jié)實驗室（1）大型中央工作臺（2）藥品柜（3）普通冰箱（4）電子分析天平和托盤天平（5）電蒸餾水器（6）磁力攪拌器（7）電爐或電飯鍋、鋁鍋。（8）酸度計（pH計）（9）高壓滅菌鍋（10）光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱（11）烘箱干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌。用于干燥需保持80-100℃；進行干熱滅菌需保持150℃，達1-3h。第一節(jié)實驗室圖1-13準備室設備（a）第一節(jié)實驗室電子分析天平電子精密天平圖1-14準備室設備（b）第一節(jié)實驗室圖1-15準備室設備（c）第一節(jié)實驗室三、無菌室（接種室）主要用于植物材料的消毒、接種、試管苗的轉(zhuǎn)接以及一切需要進行無菌操作的技術(shù)程序。主要設備：紫外燈、超凈工作臺、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。接種室要求1～2盞紫外燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應設有緩沖間，進入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外燈。第一節(jié)實驗室圖1-16無菌室設備（a）第一節(jié)實驗室圖1-17無菌室設備（b）第一節(jié)實驗室圖1-18無菌室設備（c）第一節(jié)實驗室圖1-19無菌室設備（d）第一節(jié)實驗室圖1-20無菌室設備（e）第一節(jié)實驗室超靜工作臺圖1-21無菌室設備（f）第一節(jié)實驗室電子滅菌器電子火焰滅菌器圖1-22無菌室設備（g）第一節(jié)實驗室工作臺面圖1-23無菌室設備（h）第一節(jié)實驗室視頻1-5接種室操作第一節(jié)實驗室四、培養(yǎng)室培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要而定。其設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設5層，最低一層離地高約10cm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1.7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設計，如采用40W日光燈，則長1.3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。第一節(jié)實驗室培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20-27℃左右，安裝空調(diào)機。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70％-80％為好（視情況），可安裝加濕器（除濕機）?？刂迫展庹諘r間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h?，F(xiàn)代組培實驗室大多設計為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。圖1-24培養(yǎng)室設備（a）第一節(jié)實驗室第一節(jié)實驗室圖1-25培養(yǎng)室設備（b）第一節(jié)實驗室圖1-26培養(yǎng)室設備（c）第一節(jié)實驗室圖1-27培養(yǎng)室設備（d）第一節(jié)實驗室圖1-28培養(yǎng)室設備（e）第二節(jié)設備和器材一、玻璃器皿二、器械用具視頻1-6玻璃器皿圖1-29玻璃器皿圖1-30器械用具第二節(jié)設備和器材視頻1-7組織培養(yǎng)設施設備第三節(jié)培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件：光照、溫度、濕度、氣體成分一、溫度1.一般控制在25±2oC。

2.植株種類及外植體的不同，其最適溫度也是不同的。如百合20℃；月季24℃；番茄28℃。第三節(jié)培養(yǎng)條件二、光照

★影響細胞的增殖、組織和器官的分化。

★愈傷組織的誘導有的在光照下有促進作用；光照強，幼苗生長健壯；光照弱，幼苗生長弱小，容易徒長。第三節(jié)培養(yǎng)條件三、濕度

主要受到培養(yǎng)基含水量和封口膜透性的影響。如培養(yǎng)基過硬，則不利于外植體接觸和插入培養(yǎng)基，導致生長遲緩；封口膜過于透氣，也會使瓶內(nèi)濕度下降。第三節(jié)培養(yǎng)條件四、pH值1.培養(yǎng)基適宜PH值5-6.5，一般為5.8，調(diào)

整用0.1M的NaOH和HCl溶液。2.pH影響培養(yǎng)基的硬度。

pH

＞6.5培養(yǎng)基會變硬；

pH

＜5.0培養(yǎng)基不易凝固。3.滅菌之前，培養(yǎng)基的pH要比標準提高

0.2－0.3個單位。第三節(jié)培養(yǎng)條件表1-1不同植物的最適PH值杜鵑月季越桔胡蘿、石刁柏蠶豆桃番茄、葡萄4.05.84.56.05.57.05.7第三節(jié)培養(yǎng)條件五、氣體（必要條件）

1.培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣的充足與否與封口材料有關(guān)?？捎妹奕蛱刂频姆饪谒芰?。通氣最好的是棉塞，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。常用封口膜：聚丙烯耐高溫薄膜第三節(jié)培養(yǎng)條件五、氣體（必要條件）

2.培養(yǎng)基內(nèi)氧氣充足與否與培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)方式有關(guān)?！艄腆w培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根?！粢后w培養(yǎng)時，可考慮采取振蕩培養(yǎng)的方式，以增加通氣性。任務小結(jié)

組培實驗室包括洗滌室、準備室、無菌室（接種室）、培養(yǎng)室四部分；組培器材有玻璃器皿（培養(yǎng)皿、錐形瓶、培養(yǎng)瓶、量筒等）和器械用具（鑷子、解剖刀、解剖剪等）；組培培養(yǎng)條件需考慮光照、溫度、濕度、氣體成分幾部分。123思考練習因地制宜建一個組織培養(yǎng)實驗室，需要哪些分實驗室？各分室的作用是什么？常規(guī)組織培養(yǎng)時，需要什么設備和器械？怎樣使用？組織培養(yǎng)中，pH值起什么作用？如果pH值過高或過低會有什么后果？123任務一母液的配制任務二培養(yǎng)基的制備模塊二培養(yǎng)基的配制項目二

培養(yǎng)基的配制任務一母液的配制知識目標一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點。掌握基本培養(yǎng)基的配方。一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量。123技能目標掌握基本培養(yǎng)基的配制的配方。掌握培養(yǎng)基母液的配制方法和步驟。12任務講解第一節(jié)培養(yǎng)基的種類第二節(jié)培養(yǎng)基的和成分第三節(jié)培養(yǎng)基的配制流程第一節(jié)培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。

因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基有幾十種，根據(jù)不同植物和部位選用不同的培養(yǎng)基。歷史沿革：

（1）培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Knop(1681)，以后根據(jù)不同目的進行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基。（2）White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。（3）而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。一、培養(yǎng)基的種類第一節(jié)培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基的名稱，多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)。目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點如下：

(1)MS培養(yǎng)基它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(2)B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。

(3)White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類

（4）N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。第二節(jié)培養(yǎng)基的成分

水

無機鹽：大量元素

微量元素

有機化合物：碳源

維生素

氨基酸

植物激素

天然提取物

瓊脂

其它：PH值、活性炭、抗生素、抗酚類物質(zhì)污染的添加劑、生長抑制劑、染色劑……視頻2-1培養(yǎng)基成分1.水

1.水水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。2.無機元素

元素名稱添加形式

NKNO3,NH4NO3

大量PKH2PO4NaH2PO4

元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA

微量BH3BO3

元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O2.無機元素2.無機元素

總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學方面起著重要作用。當某些營養(yǎng)元素供應不足時，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。2.無機元素3.有機化合物有機物維生素肌醇氨基酸天然復合物椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物馬鈴薯其它3.有機化合物a.碳水化合物

選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等。蔗糖濃度：2－3%，胚培養(yǎng)為4－15%

高壓滅菌部分糖會分解。大生產(chǎn)時可用白砂糖。a.碳水化合物b.維生素種類：

VB1、VB6、VB3、Vc濃度：0.1－1.0mg/L

作用：

VB1[鹽酸硫胺素]促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力。

VB6[鹽酸吡哆醇]促根生長。

VB3[煙酸]與代謝和胚發(fā)育有關(guān)。

Vc[抗壞血酸]防組織褐變。b.維生素c.肌醇

促進愈傷組織生長、胚狀體和芽的形成。對組織細胞繁殖、分化的促進作用。濃度100mg/L。促進糖類的相互轉(zhuǎn)化，提高活性物質(zhì)的活性。c.肌醇d.氨基酸

常用：甘氨酸水解酪蛋白[CH]

水解乳蛋白[LH]等。

作用：是蛋白質(zhì)的組分；

促進器官增殖；

可作有機氮源。d.氨基酸e.天然復合物椰乳：促愈傷組織和細胞培養(yǎng)，用量10－20%;香蕉泥：對PH值緩沖大，用量150－200ml/L;馬鈴薯：對PH值緩沖大，用量150－200g/L;水解酪蛋白：濃度100－200mg/L.其他：酵母提取液[YE]、蘋果汁、番茄汁等。e.天然復合物4.植物激素（1）生長素類

A.種類

IAA

NAA

IBA

2,4－DB.作用誘導愈傷組織和根分化，促進細胞分裂和伸長。

C.濃度

0.05～5mg/mL（2）赤霉素（GA）

注：不耐熱

A.種類：GA3B.作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。4.植物激素4.植物激素（3）細胞分裂素（CTK）

A.種類：6－BA

KT

ZTB.作用：誘導不定芽分化和莖、苗增殖。

C.濃度：0.05－10mg/mL4.植物激素5.培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂

A.用量6－10g/LB.新買應試凝固力

C.使用優(yōu)缺點2.其它玻璃纖維濾紙橋海綿蛭石等5.培養(yǎng)體支持材料6.輔助性物質(zhì)A.常用種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等B.用量：5～20%C.注意：抗生素對組織生長有抑制作用，使用要慎重（1）抗生素6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)常用抗氧化劑及使用：半胱氨酸VC（50～200mg/L液洗滌外植體傷口表面）。（2）抗氧化物6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)（3）活性炭A.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進新梢增殖（濃度0.1～0.2%）；促進生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。B.常用濃度：0.5～10g/L

C.注意：活性炭具副作用。第三節(jié)母液的配制(一)母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基溶解

定容

貼標簽保存于冰箱MS培養(yǎng)基母液的配制1MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類成分標準量（mg）擴大倍數(shù)稱取量（mg）母液體積（ML）用量/L大量元素NH4NO316505082.5100020KNO3190090MgSO4·7H2O37018.5KH2PO41708.5鈣鹽CaCI2·2H2O4405022100020鐵鹽FeSO4?7H2O27.81002.78100010MS培養(yǎng)基母液的配制2MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類成分標準量（mg）擴大倍數(shù)稱取量（mg）母液體積（ML）用量/L微量元素MnSO4·4H2O22.31002.23100010ZnSO4·7H2O8.60.86CoCl2·6H2O0.0250.0025CuSO45H2O0.0250.0025Na2MOO4·2H2O0.250.025H3BO36.20.62KI0.830.083MS培養(yǎng)基母液的配制3MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類成分標準量（mg）擴大倍數(shù)稱取量（mg）母液體積（mL）用量/L有機物煙酸（VB3）0.52000.110005鹽酸吡哆醇（VB6）0.50.1鹽酸硫胺素（vB1）0.10.02甘氨酸2.00.4肌醇100藥品稱量視頻天平預置全顯示清零稱藥視頻2-2藥品稱量Fe鹽母液的配制

Fe鹽母液的配制硫酸亞鐵和EDTA-Na分別溶解后，冷卻后將Fe鹽倒入EDTA-Na中[反之易沉淀]，然后定容。激素母液的配制激素母液濃度：

0.5-1mg/ml，1次配成100ml激素溶解：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；

2,4-D先溶于1mol/LNaOH或酒精再加水；

KT、BA先溶于1mol/LHCl再加水。任務小結(jié)

目前國際上流行的培養(yǎng)基有：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的成分：水、無機鹽、有機化合物、天然提取物、瓊脂、活性炭、抗生素等。

母液配制流程圖為：確定培養(yǎng)基稱量溶解定容母液分裝貼標簽保存于冰箱123思考練習培養(yǎng)基的種類、特點有哪些？簡述培養(yǎng)基的組成成分、作用和適宜的劑量。簡述培養(yǎng)基母液的配制方法和步驟。123任務一母液的配制任務二培養(yǎng)基的制備模塊二培養(yǎng)基的配制項目二

培養(yǎng)基的配制任務二培養(yǎng)基的配制知識目標培養(yǎng)基配制方法和步驟；一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。12技能目標熟練掌握培養(yǎng)基配制方法和步驟；熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法12任務講解第一節(jié)培養(yǎng)基配制流程第二節(jié)培養(yǎng)基的選擇第一節(jié)培養(yǎng)基配制流程分裝調(diào)PH值接種確定配方移母液定容培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口水培養(yǎng)基配制流程圖1.培養(yǎng)基熬制1.將2/3水倒入鋁鍋中，近開鍋時加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。3.將量好的培養(yǎng)基母液倒入鋁鍋中，攪拌均勻。1.培養(yǎng)基熬制培養(yǎng)基熬制視頻視頻2-3培養(yǎng)基熬制母液的量取視頻視頻2-4母液的量取母液的定容

2.定容培養(yǎng)基做好后在調(diào)整pH值之前，應對培養(yǎng)基進行定容，考慮培養(yǎng)基本身處于熱態(tài)并還需要滅菌等要損失部分，因此定容時需要多出近1/10。視頻2-5定容母液調(diào)pH3.調(diào)pH值用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為5.8。在培養(yǎng)基配方不大變動的情況下可用經(jīng)驗法?？梢詫⑦B續(xù)三次測定所加入的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。調(diào)后注意一定要搖動均勻。視頻2-6調(diào)整PH值4.激素的添加在激素的水平變化較小時，尤其在配制多種培養(yǎng)基時，激素可以在pH值調(diào)整后添加。要求嚴格時應添加激素后再調(diào)整pH值（因激素母液可能影響培養(yǎng)基的pH值）。激素的添加培養(yǎng)基分裝5.培養(yǎng)基分裝趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30～40ml,30瓶/L。視頻2-7培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基的扎口與滅菌

6.扎口與滅菌要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應及時滅菌，防止變質(zhì)。視頻2-8培養(yǎng)基滅菌任務小結(jié)

培養(yǎng)基配制的順序為：倒水加熱稱取瓊脂入鍋加熱熔解加入蔗糖待瓊脂溶化后加母液攪拌均勻然后加激素。培養(yǎng)基制作視頻視頻2-9培養(yǎng)基母液配制

0.5mg/ml的NAA配制方法，要求配100ml。某培養(yǎng)基為MS+BA2mg/l+NAA0.2mg/l.

問：如果做2升，應加激素各為多少毫升？（BA母液為0.5mg/ml，NAA為0.5mg/ml）。思考練習12第二節(jié)培養(yǎng)基的選擇

在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如MS培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當通過一系列的實驗，對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗方法主要有單因子試驗、多因子試驗及廣譜實驗等。單因子試驗

在單因子試驗中，由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。例如MS基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。單因子試驗

試驗中要求對照組與試驗組中的試驗個體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗結(jié)果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料的不一致導致的。試驗中各處理一般都要設有一定的重復，以取得可靠的試驗結(jié)果。隨試驗規(guī)模和要求不同，大多每個項目要有4～10瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。多因子試驗

對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6－BA的最佳濃度組合，每個因子各設5個濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個具有25項處理的試驗見下表。多因子試驗2種激素5種濃度的實驗組合6-BA(mg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425廣譜實驗法

在廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類：無機鹽、有機營養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長素、細胞分裂素。對每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項包括81個處理的實驗。在這81個處理中最好的一個可用4個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高等濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMH。最佳組培方案篩選技巧

一、技術(shù)資料的收集

查：學名、品種及商品名，文獻資料（近3-5年）。查不到時，查相近的、同屬內(nèi)其他文獻。

信息：外植體取材時間、類型；初始培養(yǎng)基、繼代、生根培養(yǎng)基；培養(yǎng)基類型，附加成分，尤其激素及特殊成分，pH；培養(yǎng)條件，尤其溫度；馴化營養(yǎng)土配方及馴化條件。最佳組培方案篩選技巧

二、預備試驗分析上述信息，結(jié)合自身工作經(jīng)驗，針對關(guān)鍵因素，擬定方案。一般接種到現(xiàn)有培養(yǎng)基上，觀察和判斷，找出突破口。

三、正交試驗例：蘋果生根：在1/4MS，取IBAVB1間苯三酚炭暗培養(yǎng)5個因子，每因子4水平，選用L16(45)正交表。最佳組培方案篩選技巧Ln(tk)列號數(shù)（安排的因子數(shù)）水平數(shù)處理數(shù)最佳組培方案篩選技巧最佳組培方案的篩選找出主導因子：IBA、暗培養(yǎng)天數(shù)經(jīng)組合試驗：IBA:1.5，2.0，2.5，3.0，5.0暗培養(yǎng)天數(shù)：1[2]3[4]5選出：IBA3mg/L暗培養(yǎng)3天

只研究一個因素的試驗就是單因子試驗；對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設計方案；組培方案篩選的流程為：技術(shù)資料的收集

預備試驗正交試驗找出主導因子。12思考練習

培養(yǎng)基的種類及特點有哪些？培養(yǎng)基的成分、作用及常用的劑量。試比較選擇培養(yǎng)基時幾種方法的優(yōu)劣？簡要說明MS培養(yǎng)基的基本組成？1234項目三

無菌操作技術(shù)任務三外植體的選擇與處理任務二無菌操作技術(shù)任務一虛擬無菌操作任務二無菌操作技術(shù)知識目標理解有菌和無菌的范疇；掌握常用的滅菌方法；掌握無菌操作過程。

123掌握組織培養(yǎng)相關(guān)的滅菌方法；熟練掌握無菌操作技術(shù)；12

滅菌和接種

任務講解滅菌和接種一、滅菌二、無菌操作三、接種第一節(jié)滅菌和接種

滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學的滅菌方法處理后的物體(當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。滅菌：用物理或化學方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體，即所有生命的物質(zhì)全部殺死。滅菌和消毒的區(qū)別是什么？一、滅菌滅菌和接種滅菌概念1.培養(yǎng)基滅菌◆高壓濕熱滅菌◆某些激素、維生素采用過濾滅菌視頻3-1培養(yǎng)基滅菌自動高壓濕熱滅菌鍋1電源水位指示燈溫度、壓力顯示窗溫度壓力設置鈕壓力表放汽閥滅菌鍋1臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋結(jié)構(gòu)

過濾滅菌濾膜?0.45um以下1.過濾器先滅菌，滅菌溫度不超過121℃。2.溶液先進行初濾(濾膜?0.65um)過濾滅菌

培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時間(min)20-501575-15020250-50025100030高壓蒸汽滅菌2.玻璃器皿滅菌◆干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h◆濕熱滅菌：121℃,20-40min◆接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。3.接種工具滅菌◆用前干熱滅菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前濕熱滅菌：121℃,20～30min◆接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌?！魸駸釡缇?21℃，20～30min◆實驗服滅菌后置于緩沖間或密封好。4.實驗服、口罩、濾紙滅菌4.實驗服、口罩、濾紙滅菌5.接種室滅菌紫外燈照射(接種室、超凈臺、接種箱)：波長260nm，距離小于1.2m，15～20min。臭氧滅菌機：1～2h熏蒸滅菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀；冰醋酸；1～3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。

接種臺噴霧消毒：75%酒精。

◆用化學滅菌劑消毒◆常用化學滅菌劑6.接種材料滅菌視頻3-2

接種材料滅菌水洗莖尖選取酒精滅菌氯化汞滅菌無菌水沖洗接種滅菌圖示常用滅菌劑的使用濃度與效果比較滅菌劑使用濃度持續(xù)時間去除難易效果次氯酸鈣9-10%5-30min易很好次氯酸鈉2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min較難最好抗菌素4-50mg/L30-60min中較好滅菌劑的使用濃度與效果8.培養(yǎng)室滅菌新建培養(yǎng)室用前一定要徹底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

熏蒸滅菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀二、無菌操作

接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%～3%的高錳酸鉀溶液對設備、墻壁、地板等進行擦洗。視頻3-3無菌操作

除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌；(2)在接種前20min，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。注：若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、接種三、接種三、接種滅菌和無菌操作是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，在各環(huán)節(jié)中都要保持無菌的環(huán)境；滅菌的方法很多，要根據(jù)材料和目的來選擇；接種是整個組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，要嚴格按照操作流程完成。123滅菌和消毒有何差別?為什么?常用的滅菌方法各有哪些優(yōu)缺點?采用高壓蒸汽鍋高壓滅菌時，應注意哪些事項?實驗人員進入接種室接種之前，應做哪些準備工作?1234項目三

無菌操作技術(shù)任務三外植體的選擇與處理任務二無菌操作技術(shù)任務一虛擬無菌操作無菌操作任務三外植體的選擇與處理知識目標學會處理各種外植體的方法和操作流程；學會外植體的培養(yǎng)方法；掌握外植體的培養(yǎng)過程。123掌握外植體的選擇方法；熟練掌握外植體的滅菌方法和無菌操作技術(shù)；學會外植體的培養(yǎng)過程

123技能目標第一節(jié)外植體的選擇和處理第二節(jié)培養(yǎng)和馴化任務講解第一節(jié)外植體的選擇和處理一、外植體選擇時應注意：（1）選擇優(yōu)良的種質(zhì)及母株（2）選擇適當?shù)臅r期（3）選取適宜的大?。?）外植體來源要豐富（5）外植體要易于消毒二、外植體取材的部位：（1）莖尖莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，而且莖尖培養(yǎng)是獲得脫毒苗木的有效途徑。因此莖尖是植物組織培養(yǎng)中最常用的外植體。（2）節(jié)間部大部分果樹和花卉等植物，新梢的節(jié)間部是組織培養(yǎng)的較好材料。新梢節(jié)間部位不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，因此是常用組織培養(yǎng)材料。（3）葉和葉柄葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養(yǎng)中常用的材料。尤其是近年在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，以葉片為試驗材料的報道很多。（4）鱗片水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。（5）其他種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養(yǎng)的材料。三、外植體處理：首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾础０巡牧锨懈畛蛇m當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、70％酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1-2種使用。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次1-3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-10次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。第五步接種。接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放人培養(yǎng)基的過程。第二節(jié)培養(yǎng)和馴化

指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。

1．培養(yǎng)方法(1)固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。1培養(yǎng)方法(2)液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。1.初代培養(yǎng)◆2.繼代培養(yǎng)◆3.生根培養(yǎng)◆培養(yǎng)步驟2．培養(yǎng)步驟2．培養(yǎng)步驟叢生芽的發(fā)育Ⅰ頂芽腋芽微型扦插叢生芽的發(fā)育Ⅱ頂芽CTK刺激帶芽的莖切段側(cè)芽接種培養(yǎng)形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀獲得較多嫩莖梢莖段培養(yǎng)繼代擴繁試管苗生根培養(yǎng)無愈傷組織產(chǎn)生初代繼代叢生芽的發(fā)育2不定芽的發(fā)育脫分化分化愈傷組織芽、芽叢切割芽叢繼代培養(yǎng)大量芽叢試管苗生根培養(yǎng)外植體初代繼代不定芽的發(fā)育石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程體細胞胚狀體的發(fā)育Ⅰ體細胞胚狀體的發(fā)育1體細胞胚狀體的發(fā)育Ⅱ

外植體特點：數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整，成苗率高愈傷組織小孢子游離單細胞器官

胚狀體

試管苗體細胞胚狀體的發(fā)育2原球莖的發(fā)育

縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。原球莖的發(fā)育視頻視頻3-5初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)擴繁方法：以幾何級數(shù)增加，可切割莖段、分離芽叢、胚狀體、原球莖。培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基實質(zhì)：增殖培養(yǎng)物，為生產(chǎn)成品試管苗做準備。繼代培養(yǎng)目的：擴繁無根苗，最后達到邊繁殖邊生根視頻3-6繼代培養(yǎng)生根培養(yǎng)培養(yǎng)材料生根繼代培養(yǎng)初代培養(yǎng)生根培養(yǎng)基：1／2或1／4MS培養(yǎng)基生根方法與途徑新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h在含IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6d移入含IAA的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)其它方法(濾紙橋等）生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)視頻視頻3-7生根培養(yǎng)任務小結(jié)外植體的取材部位較多，應合理選擇；應選擇合適的消毒劑對外植體進行處理；外植體的培養(yǎng)步驟包括初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。123怎樣選擇外植體？接種的植物材料如何進行預處理?如何接種?外植體的培養(yǎng)步驟包括那幾步？根據(jù)發(fā)育方向，初代培養(yǎng)可分為幾種類型?1234思考練習5任務一器官培養(yǎng)（一）莖段培養(yǎng)

任務二器官培養(yǎng)（二）植物的再生培養(yǎng)

任務三培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進措施任務四花卉的組織培養(yǎng)任務五水果作物的組織培養(yǎng)任務六植物液體培養(yǎng)常見植物組配方法與易發(fā)問題處理項目四常見植物組培方法與易發(fā)問題的處理任務一器官培養(yǎng)（一）

一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇；掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟；掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào)整；知識目標123能夠根據(jù)不同植物及種類選擇合適的外植體進行啟動培養(yǎng)；能夠根據(jù)不同的植物器官及器官狀態(tài)，選擇合適的滅菌劑和適宜的滅菌時間，對外植體進行表面處理與滅菌；會通過觀察試管苗的長勢，大體判斷采取何種措施改善培養(yǎng)條件；熟練外植體滅菌的工藝操作流程；熟練各種試管苗繼代培養(yǎng)過程中的切割方式與技術(shù)；熟練無菌操作技術(shù)。技能目標123456學習提示多動手，勤實踐；多比較，多聯(lián)想，勤歸納；手、口、腦并用，學做合一。理論閱讀

植物器官培養(yǎng)主要是指離體的根、莖、葉、花器和果實、種子的無菌培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)中最主要的一個方面。植物器官培養(yǎng)不僅是研究器官生長、營養(yǎng)代謝、生理生化、組織分化和形態(tài)建成的最好材料和方法，而且具有重要的應用價值。理論閱讀實際應用

植物器官培養(yǎng)可利用莖、葉和花器培養(yǎng)建立的試管培養(yǎng)物，進行名優(yōu)特新品種的快速繁殖；利用莖尖培養(yǎng)可以得到脫毒試管苗，解決品種的退化問題，提高產(chǎn)量和品