ICS65.020.30DB22B44吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2591—2016普通級實驗用貓病原微生物監(jiān)測Conventionalexperimentalcat:pathogenicmicrooroganismsurveillance吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2591—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省科學(xué)技術(shù)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：任文陟、袁寶、陳健、張銳、劉殿峰、張嘉保、高巍、胡進(jìn)平、俞先峰、權(quán)福實、丁瑜、張金玉。IDB22/T2591—2016普通級實驗用貓病原微生物監(jiān)測1范圍本標(biāo)準(zhǔn)主要規(guī)定了普通級實驗用貓的病原微生物監(jiān)測的術(shù)語和定義、檢測項目、檢測程序、檢測方法、檢驗規(guī)則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于普通級實驗用貓病原微生物的監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.1實驗動物沙門菌檢測方法GB/T14926.4實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GB/T14926.42實驗動物細(xì)菌學(xué)檢測標(biāo)本采集GB/T14926.46GB/T14926.50實驗動物鉤端螺旋體檢測方法實驗動物酶聯(lián)免疫吸附試驗GB/T14926.56實驗動物狂犬病檢測方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法普通級實驗用貓conventional(CV)cat檢測要求1DB22/T2591—2016表1（續(xù)）動物等級普通級檢測項目檢測要求沙門氏菌●○○皮膚病原真菌鉤端螺旋體不得檢出注：▲指在進(jìn)行實驗用貓質(zhì)量評價時應(yīng)檢測的項目，可以免疫?！裰冈谶M(jìn)行實驗用貓質(zhì)量評價時應(yīng)檢測的項目。○指引進(jìn)實驗用貓時或懷疑本病流行等必要時要求檢測的項目。5檢測程序檢測程序見圖1。編號采樣*耳后、背部毛發(fā)或皮屑真菌檢查鼻拭子、肛拭子（或新鮮糞便）注：*：結(jié)合臨床癥狀和實驗室檢查結(jié)果，需要進(jìn)一步確證時，可取特定樣本進(jìn)行檢測。檢測方法2DB22/T2591—2016表2普通級實驗用貓病原微生物檢測方法微生物方法貓泛白細(xì)胞減少癥病毒貓鼻氣管炎病毒貓杯狀病毒抗體按GB/T14926.50檢測病原采用PCR法檢測，見附錄A抗體按GB/T14926.50檢測病原采用PCR法檢測，見附錄B抗體按GB/T14926.50檢測病原采用RT-PCR法檢測，見附錄C抗體按GB/T14926.56檢測病原采用巢式RT-PCR法，見附錄D按GB/T14926.1檢測貓狂犬病毒沙門氏菌皮膚病原真菌貓鉤端螺旋體按GB/T14926.4檢測按GB/T14926.46檢測7檢驗規(guī)則7.1監(jiān)測頻率每6個月至少檢測一次。7.2抽樣7.2.3試樣采集按GB/T14926.42和NY/T541進(jìn)行。7.3結(jié)果判定3DB22/T2591—2016AA附錄A（規(guī)范性附錄）貓泛白細(xì)胞減少癥病毒PCR檢測方法A.1病毒DNA的提取與保存按照DNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行DNA提取。凍存于-70℃冰箱備用。A.2PCR反應(yīng)引物上游引物序列（5′-3′）:CTGCTACTCAGCCACCAACT。下游引物序列（5′-3′）:TGGTGGTAAGCCCAATGCTC。A.3PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)試劑盒，退火溫度為60℃。A.4PCR產(chǎn)物CTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATATCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTACCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCA。4DB22/T2591—2016BB附錄B（規(guī)范性附錄）貓鼻氣管炎病毒PCR檢測方法B.1病毒DNA的提取與保存按照DNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行DNA提取。凍存于-70℃冰箱備用。B.2PCR反應(yīng)引物上游引物序列（5′-3′）:GCGGATTACACCACCACTCT。下游引物序列（5′-3′）:AAAGGCTAAGGGCGTGTACC。B.3PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)試劑盒，退火溫度為60℃。B.4PCR產(chǎn)物GCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAAACCCTCACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTT。5DB22/T2591—2016CC附錄C（規(guī)范性附錄）貓杯狀病毒RT-PCR檢測方法C.1病毒RNA的提取與保存按照病毒RNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行RNA提取。凍存于-70℃冰箱備用。C.2PCR反應(yīng)引物上游引物序列（5′-3′）:AACCTGCGCTAACGTGCTT。下游引物序列（5′-3′）:CAGTGACAATACACCCAGAA。C.3反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。C.4PCR反應(yīng)條件AACCTGCGCTAACGTGCTTAAATACTATGATTGGGATCCCCACATCAGATTGGTTATCAACCCCAATAAATTTCTTCCTATTGGTTTCTGTGATAATCCTCTAATGTGTTGCTACCCAGAATTGCTCCCAGAATTCGGAACTGTGTGGGATTGTGATCAATCCCCACTGCAAATCTACCTGGAGTCAATCCTTGGTGATGATGAATGGGCTTCAACTTACGATGCCATTGACCCTGTTGTTCCACCAATGCACTGGGACGATGCAGGCAAGATCTTCCAACCTCACCCTGGAGTTCTGATGCATTTTCTAATAAATGAAGTTGCAAAGGGCTGGGATCCAAGTTTGCCATCCTTCCGTTTGGAAGCAGATGACGGATCCATAACCACACCTGAACAGGGTACTGCGGTTGGTGGCGTCATTGCCCAACCCAGCGCTCAAATGTCGGCAGCTGCAGACATGGCATCTGGTAAGAGTGTTGACTCTGAGTGGGAGGAATTCTTTTCCTTCCATACTAGTGTCAACTGGAGCACAACTGAAACACAAGGAAAGATTCTGTTCAAACAGTCACTGGGACCCCTTCTCAACCCTTACCTTGAACACTTATCTAAACTCTATGTTGCTTGGTCAGGCTCTATAGATGTTAGGTTTTCTATCTCTGGTTCTGGTGTCTTTGGGGGAAAACTAGCCGCAATAGTTGTCCCACCTGGTGTCGATCCTGTCCAAAGCACTTCCATGCTACAATACCCTCATGTGTTGTTTGATGCTCGACAGGTTGAACCAGTGATCTTTTCTCTCCCTGATCTGAGGAATTCACTATATCACCTCATATCTGATACTGATACTACATCTCTGGTAATAATGGTTTACAATGATCTTATTAACCCCTATGCAAATGAAGCTAACTCTTCTGGGTGTATTGTCACTG。6DB22/T2591—2016DD附錄D（規(guī)范性附錄）貓狂犬病病毒巢式RT-PCR檢測方法D.1病毒RNA的提取與保存按照病毒RNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行RNA提取。凍存于-70℃冰箱備用。D.2PCR反應(yīng)引物D.2.1第1次PCR反應(yīng)引物上游引物序列（5′-3′）:GTGTAACACCTCTACAATGG。下游引物序列（5′-3′）:ACAGTCTCYTCNGCCATCT。D.2.2第2次PCR反應(yīng)引物上游引物序列（5′-3′）:CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG。下游引物序列（5′-3′）:AGCCCTGGTTCGAACATTCT。（簡并引物，其中Y=C/T，N=A/C/G/T）使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。D.4PCR反應(yīng)條件使用PCR反應(yīng)試劑盒，首先使用第1次PCR反應(yīng)引物，退火溫度為56℃，以第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用第2次PCR反應(yīng)引物，退火溫度為56℃。CAAGATGTGCGCTAACTGGAG