ICS07.100.10DB22C04吉林省地方標準DB22/T3052—2019腦膜炎奈瑟菌檢測實時熒光PCR法DetectionofNeisseria-meningitidisinreal-timefluorescentpolymerasechainreactionmethod吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3052—2019前言本標準按照GGB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標準由吉林省衛(wèi)生健康委員會提出并歸口。本標準起草單位：吉林省疾病預防控制中心。本標準主要起草人：張煒煜、楊修軍、劉桂華、王慧、張立夫、王艷秋。IDB22/T3052—2019腦膜炎奈瑟菌檢測實時熒光PCR法警示——使用本標準的人員應該有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本標準并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標準規(guī)定了腦膜炎奈瑟菌實時熒光PCR法的試劑和材料、儀器設備、試驗步驟和數(shù)據(jù)處理技術要求。本標準適用于在生物安全二級實驗室或以上防護級別的實驗室中進行流行性腦脊髓膜炎疑似病人的腦脊液、血液、咽拭子樣本中腦膜炎奈瑟菌檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682GB19489實驗室生物安全通用要求WS/T230分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法臨床診斷中聚合酶鏈式反應（PCR）技術應用根據(jù)腦膜炎奈瑟菌莢膜轉運基因（CtrA）的保守序列，設計TaqMan熒光探針和引物。PCR擴增時，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。熒光信號累積與PCR產(chǎn)物形成同步，實時在線監(jiān)控反應過程，對擴增產(chǎn)物進行分析。除特別說明以外，所有試劑為分析純或生化試劑。4.1細菌基因組DNA提取試劑盒。0.1%DEPC處理后的去離子水，符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。4.3FastTaqManMixture(LowROX)。1DB22/T3052—2019細菌名稱序列擴增產(chǎn)物長度/bp97腦膜炎奈瑟菌F:5'-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3'5'-GGCGCATTCGACACATACAA-3'Pb:5'-(FAM)CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG(SpC6)-3'R:注：上下游引物和探針工作液濃度均為10μmol/L。5儀器和設備5.1.1Ⅱ級生物安全柜。5.1.2熒光定量PCR儀。5.1.3渦旋振蕩器。5.1.4冰箱（2℃～8℃和-20℃）。5.1.5離心機(13000rpm)。5.1.6微量可調移液器及配套帶濾芯吸頭（10μL，100μL，200μL，1000μL）。5.1.7金屬浴或水浴鍋。5.1.8離心管（1.5mL）。5.1.9熒光PCR反應管和蓋。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上疑似菌落，置于含200μL無菌雙蒸水的離心管（5.5）中，用渦旋振蕩器（5.3）振蕩混勻。6.1.3腦脊液6.1.4咽拭子將咽拭子繞過口腔懸雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3滴～5滴無菌生理鹽水的試管中，待檢。6.2DNA提取對于上述標本，在Ⅱ級生物安全柜（5.1）取0.1mL（5.6）加到一個盛有0.2mL無菌雙蒸水的離心管中（5.8）中，振蕩混勻，用金屬浴或水浴鍋（5.7）100℃煮沸10min，使用離心機（5.5）以13000rpm/min離心5min，可吸取上清液作為DNA模板。也可使用細菌基因組DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。不能及時檢測的DNA模板可置于-20℃冰箱（5.4）保存。2DB22/T3052—20196.3Real-timePCR擴增6.3.1Real-timePCR反應體系Real-timePCR反應體系：20μL。其中，F(xiàn)astTaqManMixture（4.3）10μL，上下游引物各1μL、探針0.2μL，參比熒光Rox0.4μL，DNA模板2μL，DEPC水（4.2）5.4μL。振蕩混勻，短暫離心。同時設陽性對照、陰性對照、空白對照。6.3.2Real-timePCR反應參數(shù)預變性95℃3min；變性95℃5s，退火延伸55℃1min，在此收集熒光，共40個循環(huán)。7結果判定7.1閾值的設定閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調整。7.2質量控制7.2.1陽性對照Ct值應≤35，并出現(xiàn)特定的擴增曲線。7.2.2陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。7.2.3空白對照無Ct值并且無擴增曲線。待測樣本的Ct值小于等于35，擴增曲線呈光滑的S型，判定為腦膜炎奈瑟菌陽性；待測樣本的無Ct值，判定為腦膜炎奈瑟菌陰性；待測樣本的Ct值大于35，