看島**南限么司文件

文件名稱微生物限度檢驗操作規(guī)程文件編號SOP-ZL65-2

制定人審核人審核人

制定日期審核日期審核日期

批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期生效日期

頒發(fā)部門品管部印數(shù)份

分發(fā)部門品管部

目的建立微生物限度檢查操作規(guī)程，規(guī)范操作，保證結(jié)果的精確性。

范圍成品、輔料、內(nèi)包裝袋及純化水的檢驗。

責(zé)任品管部微生物限度檢驗人員

內(nèi)容

概述：木檢驗操作規(guī)程依據(jù)中國藥典2024年版四部《通則1105非無菌產(chǎn)品微

生物限度檢查：微生物計數(shù)法》和《通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：限制菌檢

查法》進(jìn)行檢查。

微生物計數(shù)法

一、計數(shù)方法

1.微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。

2、計數(shù)方法本法包括平皿法、薄膜過濾法。

3、計數(shù)培育基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性檢查供試品微生物計數(shù)

中所運用的培育基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試

驗，以確定采納的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。

4、菌種及菌液的制備

4.1試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0

袋)，并采納相宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保藏。計數(shù)培育基適用性檢查和計數(shù)方法適用性

試驗見表1。

4.2菌液制備按表1規(guī)定培育各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、

枯草芽泡桿菌、白色念珠菌的簇新培育物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%

無菌氯化鈉溶液制成相宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的簇新培育物加入3-5ml含0.05%

(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將

抱/洗脫。采納相宜的方法吸出抱了懸液至無菌試管中，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯

80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成相宜濃度的黑曲霉抱

子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)運用；若保存在2-8℃,可在24小

時內(nèi)運用。黑曲霉抱子懸液可保存在2-8C,在驗證過的貯存期內(nèi)運用。

表1試驗菌液的制備和運用

計數(shù)培育基適用性檢查計數(shù)方法適用性試驗

試驗菌株試驗蓋液的制備

霉菌和酵母霉菌和酵母

需氧菌總數(shù)需氧菌總數(shù)

菌總數(shù)菌總數(shù)

金黃色葡萄球菌胰酪大豆豚胰酪大豆陳

Staphylococcus瓊脂培育基瓊脂培育基

aureus|CCMCC(B)或胰酪大豆或胰酪大豆

260031

陳液體培育豚液體培育

銅綠假單胞菌胰酪大豆凍瓊脂培育基

基，培育溫基，培育溫

Pseudomonas或胰酪大豆陳液體培育

度30?度30?

aeruginosa基，培方溫度30?35℃,

35C,培育35℃,培育

(CMCC(B)10104]培育時間18?24h

時間不超過時間不超過

枯草芽抱桿菌3天，接種3天,接種

Bacillussubtilis量不大于量不大于

[CMCC(B)6350IJ

lOOcfuolOOcfuo

沙氏葡萄糖瓊脂培育基

白色念珠菌胰酪大豆陳沙氏葡萄糖胰酪大豆陳沙氏葡萄糖

或沙氏葡萄糖液體培育

C.(indi(l(inlhicmvi瓊脂培育瓊脂培育瓊脂培育瓊脂培育

基，培育溫度20?25C,

(CMCC(F)980011基，培育溫基，培育溫基，培育溫基，培育溫

培育時間2?3天

度30?度20?度30?度20?

沙氏葡萄糖瓊脂培育基35℃,培育25P,培育35℃,培育25C,培育

時間不超過時間不超過時間不超過時間不超過

黑曲霉菌或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培

5天，接種5天，接種5天，接種5天，接種

Aspergillusniger育基，培育溫度20-

量不大于量不大于量不大于量不大于

(CMCC(F)98003125℃,培育時間5?7天，

或直到獲得豐富的施子lOOcfunlOOcfu。lOOcfu□lOOcfuo

4.3陰性比照為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行比照試驗，陰性比照試驗應(yīng)

無菌生長。

4.4培育基適用性檢查依據(jù)表1規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆陳液

體培育基或胰酪大豆陳瓊脂培育基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板，置規(guī)定的條件下

培育。每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿。同時用相應(yīng)的比照培育基替代被檢培育

基進(jìn)行上述試驗。被檢固體培育基上的菌落平均數(shù)與比照培育基上的菌落平均數(shù)的比值

應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與比照培育基上的菌落一樣。被檢液體培育基管

與比照培育基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。

5、計數(shù)方法適用性檢查

5.1供試品制備依據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采納相宜的方法制備供試

液。制備時若需加溫應(yīng)加熱勻稱旦溫度不得超過45℃。供試液從制備到加入檢驗用培育

基不得超過1小時。

成品、輔料供試液的制備取供試品，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖溶液或

PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆陳液體培育基或稀釋制成1:1()供試液，若須要，調(diào)

整供試液PH至6-8,必要時用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步1()倍稀釋系列。水溶性液體

制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

內(nèi)包裝膜、袋：取供試品100cm2,剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或PH7.2

磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆豚液體培育基，浸泡，振搖，制成1:10供試液。若須要，

調(diào)整供試液PH至6-8,必要時用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍稀釋系列。

5.2接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供

成液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中微生物能被充分檢

出，應(yīng)首先選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗。

試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液所含菌

量不大于lOOcfuo

供試品比照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

菌液比照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加

入試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗。

5.3供試品中微生物的回收表1所列的計數(shù)方法適用性試驗的各試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)

行微生物回收，微生物回收采納平皿法。

平皿法采納傾注法，表1中每株試驗菌每種培育基至少制備2個平皿。取照上述

“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液1ml,置直徑90mm的無菌平皿中，

注入15-20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培育基，混勻，

凝固，倒置培育、計數(shù)。同法測定供試品比照組及菌液比照組菌液，計算各試驗組的平

均菌落數(shù)“

薄膜過濾法采納的流膜孔徑不大于0.45um,濾膜直徑一般為50mm。濾器及濾膜

運用前應(yīng)采納相宜的方法滅菌.運用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性八水溶性供試

液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)留意保持

供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若須要用沖洗液沖洗濾

膜，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml；以免濾膜上的微生

物受損傷。

取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液適量(一般取相當(dāng)于1g、

Iml、I0cm2的供試品，若供試品中所含菌數(shù)校對，供試液可酌情減量)，加至適量的稀

釋液總，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。

測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培育基平板上；測定霉菌

和酵母菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜法面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板上，按表1規(guī)定條件

培育、技術(shù)。每株試驗菌每種培育基至少制備1張濾膜。同法測定供試品比照組和菌液

比照組菌數(shù)。

6、結(jié)果推斷計數(shù)方法適用性試驗中，采納平皿法或薄膜過濾法，試驗組菌落數(shù)

減去供試品比照組菌落數(shù)的值與菌液比照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)。若各試驗

驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧

菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。若存在一株或多株試驗菌的回收達(dá)不到要求，應(yīng)選擇

回收最接近要求的方法和試驗條件進(jìn)行供試品檢查。

二供試品的檢查

1、檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般隨機(jī)抽取不少于2

個最小包裝的供試品，混合，取10g、10ml或lOOcn?法行檢驗。

2、供試品檢查按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的計數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、

霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。胰酪大豆陳瓊脂培育基或胰酪大豆膿液體培育基用于測定需

氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培育基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.1陰性比照試驗以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性比照試驗，陰性比照試驗應(yīng)無菌

生長。若有菌生長應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

2.2平皿法取規(guī)定量的供試品，按方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和

菌數(shù)測定，每稀釋級每種培育基至少制備2個平板。

2.2.1培育和計數(shù)胰酪大豆陳瓊脂培育基平板倒置于?30?35℃培育箱中培育3?5

天。沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板倒置于20?25c培育箱中培育5?7天，視察菌落生長

狀況，點計平板上生長的全部菌落數(shù)并報告。菌落擴(kuò)散成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落

數(shù)后計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌落數(shù)。若同稀釋級兩個

平板的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。

2.2.2菌數(shù)報告規(guī)則需氧菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和

酵母菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。取最高平均

菌落數(shù)，計算lg、1ml或10cm2供試品中所含微生物，取兩位有效數(shù)字報告。如各稀釋

級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均茵落數(shù)小于1時，

以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)。

2.3薄膜過濾法按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的計數(shù)方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)

于每張濾膜含lg、1ml或lOcn?供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取相

宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，馬上過濾，沖洗,

沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培育基或沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板上

培育。

2.4培育和計數(shù)培育條件和計數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過

100cfile

2.5菌數(shù)報告規(guī)則以相當(dāng)于1g、1ml或10cn?供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜

上無菌落生長，以VI報告菌數(shù)（每張濾膜過濾lg、1ml或10cm2供試品），或VI乘以

最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

3、結(jié)果推斷

3.1需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆陳瓊脂培育基上生長的總菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù))；

霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培育基上生長的總菌落數(shù)(包括細(xì)菌菌落數(shù))。

若因沙氏葡萄糖瓊脂培育基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限

度要求，可運用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂培育基或其他選擇

性培育基(如玫瑰紅鈉培育基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。運用選擇性培育基時應(yīng)進(jìn)

行培育基適用性檢查。

3.2各品種項下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)說明如下：

lO^fu：可接受的最大菌數(shù)為20；

IO2cfu：可接受的最大菌數(shù)為200；

IO3cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000,以此類推。

3.3若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和醉母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)

定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)

定。

限制菌檢查法

1、簡述

限制菌檢查法是用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在某些特定微生

物。本標(biāo)準(zhǔn)的限制菌為大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌|CMCC(B)10104]

和金黃色葡萄球菌|CMCC(8)260031

供試品檢出限制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。

供試液制備及試驗環(huán)境要求同“微生物計數(shù)法”。

2、培育基適用性檢查和限制菌檢查方法適用性試驗

供試品限制菌檢杳中所運用的培育基應(yīng)進(jìn)行適用性檢存。供試品的限制菌檢杳方法

應(yīng)進(jìn)行適用性驗證.

2.1菌種試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種

為第0袋)，并采納相宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保藏。

金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC(B)26()03]

銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10104]

大腸埃希菌EscherichiacoliICMCC(B)44102]

乙型副傷寒沙門菌(ScdmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]

白色念珠菌(Candidaalbicans)|CMCC(F)98001]

生抱梭菌(Closiridiiansporogenes)|CMCC(B)64941]

2.2菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆陳瓊

脂培育基或胰酪大豆腺液體培育基上，30?35℃培育18?24h；

將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培育基或沙氏葡萄糖液體培育基中，20?25c

培育2?3天；

將生抱梭菌接種于梭菌增菌培育基中置厭氧條件下3()?35c培育24?48h,或接種

于硫乙醇酸鹽流體培育基中30?35℃培育18?24h。

上述培育物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成相宜濃

度的菌忌液。

菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)運用；若保存在2-8℃,可在24小時內(nèi)

運用。生胞梭菌胞子懸液可替代簇新的菌懸液，池子懸液保存在2-8℃,在驗證過的貯

存期內(nèi)運用。

2.3陰性比照為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行比照試驗，陰性比照試驗應(yīng)

無菌生長。

2.4培育基適用性檢查限制菌檢查用的培育基應(yīng)進(jìn)行培育基適用性檢查。檢查項

目包括促生長實力、抑制實力及指示特性的檢查。各培育基的檢查項目及所用菌株見下

表2o

表2限制菌檢查用培育基的促生長實力、抑制實力及指示特性

限制菌檢查培育基特性試驗菌株

耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培育基大腸埃希菌、銅綠假單

促生長實力

胞菌

抑制實力金黃色葡萄球菌

大腸埃希菌、銅綠假單

紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培育基促生長實力+指示特性

胞菌

大腸埃希菌促生長實力大腸埃希菌

麥康凱液體培育基

抑制實力金黃色葡萄球菌

麥康凱瓊脂培育基促生長實力+指示特性大腸埃希菌

沙門菌促生長實力乙型副傷寒沙門菌

RV沙門菌增菌液體培育基

抑制實力金黃色葡萄球菌

木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂

促生長實力+指示特性乙型副傷寒沙門前

培育基

三糖鐵瓊脂培育基指示實力乙型副傷寒沙門菌

銅綠假單胞菌浪化十六烷基三甲鉞瓊脂培促生長實力銅綠假單胞菌

育基抑制實力大腸埃希菌

金黃色葡萄球菌促生長實力+指示特性金黃色葡萄球菌

甘露醇氯化鈉瓊脂培育基

抑制實力大腸埃希菌

梭菌梭菌增菌培育基促生長實力生抱梭菌

哥倫比亞瓊指培育基促生長實力生抱梭菌

白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培育基促生長實力白色念珠菌

沙氏葡萄糖瓊脂培育基促生長實力+指示特性白色念珠菌

白色念珠菌

促生長實力+指示實力

念珠菌顯色培育基

抑制實力大腸埃希菌

2.4.1液體培育基促生長實力檢杳分別接種不大于lOOcfu的表2的試驗菌株與被

檢培育基和比照培育基中，在相應(yīng)限制菌檢查規(guī)定的培育溫度及不大于規(guī)定的最短培育

時間下培育，與比照培育基比較，被檢培育基試驗菌應(yīng)生長良好。

2.4.2固體培育基促生長實力檢查用涂布法分別接種不大于lOOcfu的表2的試驗

菌株與被檢培育基和比照培育基平板上，在相應(yīng)限制菌檢查規(guī)定的培育溫度及不大于規(guī)

定的最短培育時間卜.培育，被檢培育基與比照培育基上生長的菌落大小、形態(tài)應(yīng)一樣。

2.4.3培育基抑制實力檢查接種不少于lOOcfu的表2的試驗菌株與被檢培育基

和比照培育基中，在相應(yīng)限制菌檢查規(guī)定的培育溫度及不大于規(guī)定的最短培育時間下培

育，試驗菌應(yīng)不得生長。

2.4.4培育基指示特性的檢查用涂布法分別接種不大于lOOcfu的表2的試驗菌株

與被檢培育基和比照培育基平板上，在相應(yīng)限制菌檢杳規(guī)定的培育溫度及不大于規(guī)定的

最短培育時間下培育，被檢培育基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑實力等

英語比照培育基一樣。

2.5限制菌檢查方法適用性檢查

2.5.1供試液制備：按“供試品檢查”中規(guī)定的方法制備供試液。

2.5.2試驗菌依據(jù)各品種項下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢查限制菌選擇相應(yīng)的試

驗菌株。確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法是，采納大腸埃希菌利銅綠假單胞菌為試驗菌。

253適用性檢查按限制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于lOOcfu的試驗菌接入

規(guī)定的培育基中，采納薄膜過濾法是取規(guī)定量供試液，過濾沖洗，在最終一次沖洗液中

加入試驗菌，過濾后注入規(guī)定的培育基或取出濾膜接入規(guī)定的培育基中。依相應(yīng)限制菌

檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短培育時間下培育，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

2.5.4結(jié)果推斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液之被罰和限制菌檢查方法進(jìn)

行供試品檢杳；若未檢出試驗菌，營銷處供試品中的抑菌活性（中國藥典2024年版四

部通則1105中抗菌活性的去除或滅活），并重新進(jìn)行方法適用性試驗八

若經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消退，可認(rèn)為受抑制的微生物

不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消退相對徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。

3、供試品檢查供求品的限制菌檢查應(yīng)經(jīng)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行。

3.1陽性比照陽性比照試驗方法同供試品的限制菌檢查，比照菌的加入量應(yīng)不大

于lOOcfu,陽性比照應(yīng)檢出相應(yīng)的限制菌。

3.2陰性比照以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)限制菌檢查法檢查，陰性比照應(yīng)無菌

生長。

3.3大腸埃希菌（Escherichiacoli）

供試液制備和增菌培育取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取

相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于相宜體積（經(jīng)方法適用性試臉確定）的咦酪

大豆腺液體培育基中，混勻，30?35℃培育18-24ho

選擇和分別培育取上述培育物1ml接種至100ml麥康凱液體培育基中，42?

44c培育24?48h。取麥康凱液體培育物劃線接種于麥康凱瓊脂培育基平板上,3()?35c

培育18?72h。

結(jié)果推斷若麥康凱瓊脂培育基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分別、純化及相宜的

鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌：若麥康凱瓊脂培育基平板上沒有菌落生長，或雖有

菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。

3.4銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)

供試液制備和增菌培育取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取

相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于相宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定)的胰酪

大豆陳液體培育基中，混勻，30?35℃培育18-24ho

選擇和分別培育取上述培育物1ml接種至澳化十六烷基三甲胺瓊脂培育基平

板上，30?35℃培育18?72h。取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗，或采納其他

相宜方法進(jìn)一步鑒定。

氧化酶試驗將干凈的濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取上述平板上生長的菌

落涂于濾紙片.匕滴加新配制的1%鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)培育物

呈粉紅色并漸漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。

結(jié)果推斷若溟化卜六烷基三甲胺瓊脂培育基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗

陽性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行相宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。若平板上沒有菌落生

長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單

胞菌。

3.5金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

供試液制備和增菌培育取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取

相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于相宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定)的咦酪

大豆陳液體培育基中，混勻，30?35℃培育18?24L

選擇和分別培育取上述培育物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培育基平板上，

30?35c培育18?72h。

結(jié)果推斷若甘露醇氯化鈉瓊脂培育基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色

菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分別、純化及相宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板

上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似菌落生長但鑒定結(jié)果

為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

附件

附件1《微生物限度檢查記錄》(R-SOP-ZL65-2-01)

附件2《計數(shù)培育基適用性檢查記錄》(R-SOP-ZL65-2-02)

附件3《限制菌檢查培育基適用性檢查記錄》(R-SOP-ZL65-2-03)

附件4《陽性菌運用記錄》(R-SOP-ZL65-2-04)

修訂歷史

文件修訂、變更歷史

原文件編號現(xiàn)文件編號生效日期修訂變更緣由

SOP-ZL65-1SOP-ZL65-2執(zhí)行2024年版中國藥典

附件1微生物限度檢查記錄（1/4）

編號：R-SOP-ZL65-1-()1

檢品名稱檢品來源

檢品批號檢驗日期年月日

包裝規(guī)格報告日期年月日

批量kg(件)檢驗依據(jù)中國藥典2024年版二部

供試品制備：常規(guī)法

供試品_____g（ml）加無菌氯化鈉蛋白陳緩沖液（PH7.0）（配制批號_________________）

至________ml

細(xì)菌數(shù)30~35c3天霉菌（酵母菌）總數(shù)23~28℃5天

培育基配制批號：培育基配制批號：

培育時間一月—日—時?一月一日—時培ff時間一月一日—時?一月一日—時

原液1：101：100原液1：101：100

陰性比照羽性比照

121212121212

24h24h

48h48h

72h72h

96h

120h

平均平均

結(jié)果cfu/g、ml結(jié)果cfu/g、ml

大腸埃希菌檢查菌種編號：_______________

培育基培育時間培育溫結(jié)果

試驗方法備注

配制批號h度℃供試品陽性比照陰性比照

BL

MUG

靛基質(zhì)

結(jié)論

微生物限度檢查記錄(2/4)

編號：R-SOP-ZL65-1-01

活蛾檢查

供試品—袋(瓶)干脆檢查法

結(jié)論

金黃色葡萄球菌檢查菌種編號：_______________

培育基培育時間培育溫結(jié)果

試驗方法備注

配制批號h度℃供試品

口亞郁?酸鈉肉湯

口養(yǎng)分肉湯

培育基配制批號

1

視察結(jié)果

24

培育

口卵黃氯化鈉瓊

時間4B

脂平板

(h)

口甘露醇氯化鈉72

瓊脂平板

口平板無菌落生長，結(jié)論：未檢出金黃色葡萄球葡。

u平板右.菌落生長，與金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)特征不符，

結(jié)論：未檢出金黃色葡萄球菌。

口平板有菌落生長，與金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)特征相符(或疑似)，

結(jié)論：需進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及血漿凝固酶試驗。

養(yǎng)分瓊脂培育培育基配制批號：培育時間：h培育溫度：C

1、染色視察：口呈藍(lán)紫色，為革蘭陽性菌；口呈紅色，為革蘭陰性菌

革蘭染色、鏡檢2、鏡檢結(jié)果：口球菌、口芽刑、口莢膜、

口單個排列、口成雙排列、口短鏈狀排列、

口排列不規(guī)則的葡萄狀

養(yǎng)分肉湯培育培育基配制批號：培育時間：h培育溫度：℃

血漿凝固酹試驗

結(jié)論

微生物限度檢查記錄（3/4）

編號：R-SOP-ZL65-1-01

銅綠假單胞菌檢查菌種編號：________________

培育基培育時間培育溫結(jié)果

試驗方法

配制批號h度。C供試品備注

BL增菌培育基

培育基配制批號

視察結(jié)果

24

培育

時間43

澳代十六烷基三甲

按平板（h）

72

口平板無菌落生長，結(jié)論：未檢出銅綠假單胞菌。

口平板有菌落生長，與銅綠假單胞菌典型菌落形態(tài)特征不符，

結(jié)論：未檢出銅綠假單胞菌C

口平板有菌落生長，與銅綠假單胞菌典型菌落形態(tài)特征相符（或疑似），

結(jié)論：需進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。

養(yǎng)分瓊脂培育培育基配制批號：培育時間：h培育溫度：℃

1、染色視察：口呈藍(lán)紫色，為革蘭陽性菌：口呈紅色，為革蘭陰性菌

革蘭染色、鏡檢

2、鏡檢結(jié)果：口芽抱桿菌、口單個排列、口成雙排列、口短鏈排列

視察結(jié)果：加1%的二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30S內(nèi)培育基顯色：

氧化酶口由粉紅色漸漸變?yōu)樽霞t色，為氧化酶試驗陽性，需做綠膿菌素試驗；

□無上述氧化而試驗陽性顯色現(xiàn)象為陰性。

培育基配制批號：培育時間：h

陰性比照：培育溫度：℃

綠膿菌素視察結(jié)果：加三氯甲烷3—5ml,充分振搖攪碎培育基，靜置片刻，將三氯甲烷

移至另?試管中，加入Imol/L鹽酸試液1mL振搖后靜置片刻視察：

口鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素陽性；

□鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素陰性。

結(jié)論

結(jié)論：本品按《中國藥典》2024年版二部微生物限度檢杳法標(biāo)準(zhǔn)檢用結(jié)果

檢驗人:復(fù)核人:

微生物限度檢查記錄(4/4)

編號：R-SOP-ZL65-1-01

檢品名稱檢品來源

檢品批號檢驗日期年月日

包裝規(guī)格報告日期年月日

批量kg（件）檢驗依據(jù)中國藥典2024年版二部

培育基培育時間培育溫

試驗方法結(jié)果視察備注

配制批號h度℃

口EMB

UMacC

純培育

乳糖發(fā)醉

試驗

靛基質(zhì)試

驗(I)

生

化甲基紅試

試驗(M)

腌乙酰甲基

甲醇生成

試驗(V-P)

枸椽酸鹽

利用試驗

(C)

制備過程

革蘭染色鏡檢

視察結(jié)果：口呈藍(lán)紫色，為格蘭陽性菌：口呈紅色，為格蘭陰性菌

結(jié)論

結(jié)論：本品按《中國藥典》2024年版二部微生物限度檢查法檢查，結(jié)果

檢驗人:復(fù)核人:

附件2計數(shù)培育基適用性檢查記錄

培育基名稱:編號：R-SOP-ZL65-1-02

培育基批號培育基生產(chǎn)廠家

比照培育基批號比照培育基生產(chǎn)廠家

配制日期年月日運用日期年月日

一、菌液制備(須要的菌種在□內(nèi)劃"J”)：

口(1)大腸埃希菌簇新肉湯培育物1ml,9ml0.9%無菌\aCl溶液，10倍遞增稀釋；

□(2)金黃色葡萄球菌簇新肉湯培育物1ml,9ml0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋；

□(3)枯草芽抱桿菌簇新肉湯培育物1ml,9ml0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋；

□(4)白色念珠菌簇新改良馬丁培育物1ml,9ml0.9%無菌YaCl溶液10倍遞增稀釋；

□(5)黑曲霉簇新抱子洗脫液bid,9ml0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌NaCl溶液10

倍遞增稀釋。

二.檢查結(jié)果：

培育溫度：℃培育時間：天

被檢培育基比照培育基被檢培育基菌與比

菌種類型A/B(%)照培育基上的菌落

1DL1皿2平均A1DL1皿2均B落形態(tài)

大腸埃希菌

金黃色葡萄球菌

枯草芽抱桿菌

白色念珠菌

黑曲霉

被檢培育基的菌落數(shù)與比照培育基菌落數(shù)相比大于70%,且菌落形態(tài)大不應(yīng)

檢驗標(biāo)準(zhǔn)

與比照培育基上的菌落?樣。判該培育基的適用性檢行符合規(guī)定。

結(jié)論

檢驗人：復(fù)核人：

檢驗日期：年月日復(fù)核日期：年月日

附件3限制菌檢查培育基適用性檢查記錄

培育基名稱：編號：R-SOP-ZL65-1-03

培育基批號培育基生產(chǎn)廠家

比照培育基批號比照培育基生產(chǎn)廠家

配制日期年月口運用日期年月日

一、菌液制備（須要的菌種在□內(nèi)劃"）:

□（1）大腸埃希菌簇新肉湯培育物1ml,9ml0.9%無菌NaCl溶液，10倍遞增稀釋；

□（2）金黃色葡萄球菌簇新肉湯培育物1ml,9ml0.9%無