資助類別：面上項目亞類說明：自由申請項目附注說明：項目名稱：抗乙肝一類新藥PNA的代謝物尋找與藥效物質(zhì)基礎研究申請者：張陸勇電話托單位：中國藥科大學通訊地址：南京市中央路童家巷24號郵政編碼：210009單位電話子郵件：lyonzhang@163.com申報日期：2006年3月14日申請者信息張陸勇性別男主要研究領域在研項目批準號中國藥科大學ykdxwj@南京長澳醫(yī)藥科技有限公司項目基本信息抗乙肝一類新藥PNA的代謝物尋找與藥效物質(zhì)基礎研究究上述現(xiàn)象，通過體外消化液和肝腸微粒體試驗，收集大鼠的膽汁、得代謝物進行結(jié)構(gòu)確證后，采用化學合成的方法獲得代謝物。進行體外活性和毒性研究，PNA；乙肝病毒；藥代動力學；代謝物；LC- 1李戰(zhàn)男7zhan.li@62江振洲男助理研究員6jiangzz@83黃鑫女研究實習員6m84嚴明男研究實習員6brookming@163.com55孫麗新女研究實習員656王濤男研究實習員6wangtao1331@57舒斌女668李濤男68922914011報告正文抗乙肝一類新藥PNA的代謝物尋找與藥效物質(zhì)基礎研究乙型病毒性肝炎（簡稱乙型肝炎，下同）是由乙型肝炎病毒（HBV瀉及腹脹，部分病例有發(fā)熱、黃疸，約有半數(shù)患者起病隱匿，在查體中發(fā)現(xiàn)肝功能異常，且血清乙但很多病例病程遷延或轉(zhuǎn)為慢性，其中一部分可發(fā)展為肝炎后肝硬變甚至肝癌，極少數(shù)病例病程發(fā)抗病毒治療是乙型肝炎治療的關鍵，最近幾年，隨著拉米夫定（Lamivudine）、阿德福韋酯類似物（NucleosideAnalog拉米夫定相對于其它西藥來說價格較便宜、副作用較小、口服方便、抑制病毒迅速，從短期的僅為輕微頭痛、一過性嗜睡、惡心、疲乏、肝區(qū)不適等，且發(fā)生率較低，患者可較快適應而耐受，加之現(xiàn)代廣告和媒體的片面宣傳與炒作，其療效被人為夸大，適應癥的掌握也逐漸寬松，一些地方應用的日趨普遍，其不良反應的發(fā)生率和報告頻度亦逐年遞增。近年的用藥經(jīng)驗表明，拉米夫定并非安全無毒，目前已發(fā)現(xiàn)的副作用與不良反應有如下數(shù)種：過敏反應，停藥反跳及肝功能衰竭，甲溝炎，脂肪代謝紊亂，引起血友病出血等。因此，拉米夫定并未完全解決治療乙型肝炎的難題，出阿德福韋酯是腺苷單磷酸的非環(huán)核苷酸類似物，在體外對乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)染的人類肝細胞有抗盡管如此，長期應用核苷類似藥物抗病毒治療仍是目前切實可行的治療方式。因此，對更有特是一種比較安全的藥物。從目前的藥效和毒性研究結(jié)果來看技術進行PNA大鼠藥代動力學研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃給PNA3.483/32817014.917/27568084.03.483/32817014.917/27568084.0荷比，說明這兩個物質(zhì)結(jié)構(gòu)上很相似，可能只是通過體內(nèi)、外代謝研究，結(jié)合藥物化學的研究手段，可以確定藥物在體內(nèi)的主要代謝方式、代謝途徑及主要的代謝產(chǎn)物，在此基礎上對原型藥物及其代謝物的活性和毒性進行進一步的分析和比較，闡明藥效或毒性產(chǎn)生的物質(zhì)基礎，為藥效學和毒理學評價提供重要的線索。本課題正是性更強、作用更持久、毒性更低的治療乙型肝炎的藥物，同時也可為這一藥物的劑型開發(fā)、臨床方物。利用制備液相制備相應代謝物，并進行結(jié)構(gòu)確證。對已確定結(jié)構(gòu)的代謝物采用化學合成的方法獲得。通過HepG2215細胞模型進1.1.NucleobaseTransporter-mediatedPermeatiHumanT-lymphoblastoidCCRF–CEMCells*.J.ofBiol.Chem.1992,2672.PharmacokineticsofLamivudineandBCH-189inPlasmaandCerebrospinalFluidPrimates.AntimicrobialAgents3.Pharmacokinetics,AbsoluteBioavailability,and4.ThePharmacokineticsofLamivudineiDeterminationofLamivudineinplasma,amnioticfluid,andrattissuesbyfChromatogr.B,2004,803:279-284.7.乙型肝炎體外模型的實驗方法學研究。解放軍藥學學報，2005，21，433－436。(1)PNA的大鼠體內(nèi)藥代動力學研究。（(2)大鼠灌胃給PNA后，收集尿液、膽汁及糞便，采集血樣，利用HPLC、LC-MS和PDA等分離分(3)分別利用人工胃液、腸微粒體和肝微粒體模擬體內(nèi)生理環(huán)境研究PNA可能的代謝物和代謝途(1)確定新型抗乙型肝炎病毒核苷類化合物PNA的體內(nèi)過程，獲得藥代動力學參數(shù)以及相關的信(2)探索PNA抗乙型肝炎病毒作用的物質(zhì)基礎，明確是否有活性代謝物參與(4)將原藥與代謝物進行體內(nèi)外活性和毒性(5)該代謝物是否可能開發(fā)成為一個新的抗乙型1）建立大鼠血漿中PNA的LC-MS檢測方法，檢測灌胃給藥后其在血漿中的濃度和主要藥代動力學藥物排泄量，計算累積排泄量和排泄分數(shù)(藥物累積排泄量/給取禁食大鼠，口服給藥后，在代謝籠中單籠飼養(yǎng)，收集一定時間段內(nèi)的尿液和糞便。測定尿藥濃度和糞藥量，并折算成尿/糞總藥量、累積排泄量和累積排泄分數(shù)(藥物累積排泄量/給藥劑量取上述排泄試驗的給藥前、后大鼠尿、糞、膽汁，采用HPLC分離后進行檢測，比較給藥前后a.消化液的作用：取PNA與人工胃液反應體系共同孵育，一定時間后取樣測定PNA的量，判斷在腸和肝微粒體溫孵系統(tǒng)中分別加入一定量PNA共同孵育，反應至一定時間終止反應，測定PNA含量。分別計算PNA在腸和肝中的轉(zhuǎn)化率，通過HPLC、LC-MS和PDA初步判斷是否存尿液樣品經(jīng)有機溶劑多次提取后或經(jīng)制備色譜處理去除原藥后，分別加入葡萄糖醛酸酶、葡萄二酸單內(nèi)酯的原因是硫酸酯酶中含有一定量的葡萄糖醛酸酶，加入過量的抑制劑確保將抑制葡萄糖(1)HepG2215細胞是用2個頭尾相連的HBVDNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細胞HepG2而成，可(2)HepG2215在24孔培養(yǎng)板上生長至單層，加入不同稀釋倍數(shù)的代謝物，同時設細胞對照組和藥(3)結(jié)合上述試驗結(jié)果，對代謝物進一步評價。從細胞培養(yǎng)上清液中提取HBVDNA，用熒光定量PCR，檢測病毒DNA的量。細胞用不同濃度代謝物處理之后，提取總DNA，用SouthernBlot(1)采用熒光定量PCR快速檢測，篩選不攜帶鴨乙型肝炎病毒DNA（DHBV-DNA）的陰性雛鴨供試驗用。試驗雛鴨經(jīng)腿脛靜脈注射DHBV陽性鴨血清，在感染后一定時間取血，分離血清，-70℃保存待檢。檢測結(jié)果陽性者即可進入給藥實驗。同時間及停藥后一定時間，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢，用熒光定量PCR(3)在感染前、給藥前、給藥后不同時間及停藥后一定時間，每組分別處死鴨，取肝臟，提取總本研究所涉及的藥代動力學實驗、分子生物學實驗、動物實驗和活性評價、毒性評價及相關的實驗藥代動力學也已經(jīng)開展工作，并獲得了一定的成果。前期試驗主要進行PNA的藥代動力學研究，結(jié)推測此物質(zhì)為PNA的活性代謝物，而代謝物在PNA消除后繼續(xù)發(fā)揮抗乙肝的作用。在進行PNA活性研究時，體內(nèi)外藥效模型均已建立，技術成熟。與企業(yè)長期合作，可為我們提供樣品來源和合成方面的技術支持；通過制備液相得到代謝物進行結(jié)構(gòu)分析，再利用化學合成獲得代謝物是可行的。目本課題的特色與創(chuàng)新之處在于首次對新型核苷類化學藥物一類新藥PNA的代謝物進行較系統(tǒng)的體內(nèi)試驗確證其活性。在研究PNA抗乙型肝炎的物質(zhì)基礎的同時，探索潛在的具有抗乙型肝炎活性在國際上通過對藥物代謝物的研究而獲得全新的藥物是進行新藥研發(fā)的一種常用并且非常有效的手段，往往可以達到事半功倍的效果，因此歐美等藥物研發(fā)強國都非常重視對代謝物的研究。我們同樣對可能的活性代謝物進行深入的研究，可對現(xiàn)有的藥物進行優(yōu)化，甚至在藥物的代謝物中發(fā)通過本課題在藥代動力學、藥理藥效、藥物化學等各個學科互相協(xié)作以及各種現(xiàn)有技術手段的有機融合，可為在現(xiàn)有條件下，如何發(fā)揮各自學科的優(yōu)勢為新藥的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)提供服務提供一個借2007.1-2007.12：（3）膽汁、尿液樣品經(jīng)濃縮后利用制備HPLC將各可能存在的代謝物分離并收集，通過分析2008.1-2008.12：2009.1-2009.12：（2）建立體內(nèi)PNA和代謝物同時檢測的方法，進行動物試驗，給與PNA后，同時測定PNA和申請者所在的實驗室為科技部國家新藥篩選實驗室、江蘇省新藥篩選中心和江蘇省藥效學研究與評價服務中心。申請者及項目組成員從事藥物代謝、篩選、分子藥理學、安全性評價、研究工作多年，對本研究所涉及的藥代動力學實驗、分子生物學實驗、動物實驗和活性評價、毒性評價及相已經(jīng)先期完成PNA的部分藥效研究結(jié)果（由于涉及保密和新藥研發(fā)的策略問題，相關的研究結(jié)抑制HepG2215細胞分泌HBsA抑制HepG2215細胞分泌HBeAg制效果都很明顯，與報道的一致。以上實驗結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組（20mg/kg拉米夫定加20mg/kg該化合物）用斑點雜交試驗已不能測到病毒，且聯(lián)合用藥驗已不能測到乙肝病毒DNA，但拉米夫定組卻治療2周后才達到同樣的結(jié)果，治療8周后，大多療組的鴨子其乙肝病毒DNA已不能用第一輪PCR測到，但卻仍能在第二輪PCR查到，但只有一只在聯(lián)合用藥組中的北京鴨其乙肝病毒DNA已徹底消失，無論用何種方法檢測均不能查到。與土撥療組不同，所有北京鴨治療組均沒有發(fā)現(xiàn)耐受突變株的產(chǎn)生，這主要和北京鴨本身缺乏免疫反應功們用這種在LMH細胞中產(chǎn)生的M512V突變株成功感染了北京鴨并建立了拉米夫定耐受突變株北京鴨動物模型。此外，我們在此動物模型上試驗了PNA的抗拉米夫定耐藥突變株的能力。我們發(fā)現(xiàn)在測到病毒DNA，這表明PNA對拉米夫定耐突變株仍象對野毒株一樣敏感，但拉米夫定則對拉耐藥突變株耐受。這也向我們提示了如PNA與和拉米夫定抗病毒機理不同的化合物聯(lián)合用藥可能會PNA的TC50在先天感染乙肝病毒的北京鴨肝原代細胞中為500μM，在人體髓樣白血病細胞），我們在藥效研究中可見在PNA快速下降后，仍能看到藥效作用，推測PC(ugC(ug/ml)65425mg/kg50mg/kg100mg/kg1time(min)灌胃給藥三種劑量比較3208625mg/kg50mg/kg100mg/kg8642time(time(min)十二指腸給藥三種劑量比較申請者所在實驗室中國藥科大學新藥篩選中心遵循"創(chuàng)新、跨躍、持續(xù)發(fā)展"的理念，以建立現(xiàn)代化新藥篩選體系，加速我國創(chuàng)新藥物研究和開發(fā)為目標，致力于藥物創(chuàng)新和篩選體系的研究。中項目、《國家基礎研究發(fā)展規(guī)劃》項目、國家“863”科研能力。同時建立了具有特色的藥代動力學毒性篩選體系，根據(jù)化合物藥代動力學信息對其進行篩選；還開展了藥物的毒代動力學研究，用于解釋其毒性機制，對篩選；還開展了藥物的毒代動力學研究，用于解釋其毒性機制，對其臨床前安全性評價進行深入研究，指導臨床合理用藥。這些都為課題的完成創(chuàng)造了良好的條件。實驗室總面積約3100平方米，中作很多年，已建立了一系列細胞培養(yǎng)技術和先進的實驗設備。實驗室具有進行藥代動力學、藥效評價和安全性評價試驗所需的人員、技術、儀器設備和動物實驗室，可以準確評價藥物的活性、藥代實驗室已在分子水平、細胞水平建立了一系列相關的技術規(guī)范與實驗方法。實驗室具有進行體本課題的需要。配置了與本課題相關的各項儀器設備如凝膠成像分析儀，DNA擴增儀、高速冷種儀、蛋白快速純化儀、流式細胞儀，多功能酶標儀等分子藥理學和細胞生物學等相關實驗儀器和合作單位南京長澳醫(yī)藥科技有限公司成立于一九九九年八月，注冊資金200萬元人民幣，下設合成部、制劑部、質(zhì)量部、注冊部及由專家組成的咨詢委員會等數(shù)個部門。企業(yè)登記注冊類型為有并被江蘇省知識產(chǎn)權(quán)局認定為“江蘇省知識產(chǎn)權(quán)試點單位”，2004年被認定為“江蘇省高新技術企長澳科技自成立日起先后投入數(shù)百萬元，籌建了高標準的綜合實驗室，并于2002年正式投入使留樣觀察室、檔案室等。整個實驗室嚴格按GLP要求設計施工，布局合理、功能齊全，可容納50人冷凍干燥機等一批新型儀器設備，使公司的科研條件全面提升?？傊?，本課題組擁有一支跨學科的完備的技術力量，綜合藥理，藥代動力學，藥物化學，分析化學，生物技術，篩選等各科技骨干。課題的設計參閱了大量的國內(nèi)外文獻資料，并進行了前期的習新藥篩選方法和管理經(jīng)驗?；貒笤沃袊幙拼髮W新中新藥研究開發(fā)中心副主任，現(xiàn)任中國藥科大學新藥篩選中心主任，中國藥科大學科技處副處長。中國藥理學會制藥工業(yè)專業(yè)委員會副秘書江蘇省藥物研究與開發(fā)協(xié)會秘書長，江蘇省實驗動物協(xié)會理事，江蘇省實驗動物管理委員會專家組委。主要研究方向：一是針對危害人類健康的重大疾病和多發(fā)病展開藥物作用新靶點、篩選新技術的研究，并在此基礎上開展高通量藥物篩選工作，發(fā)現(xiàn)可用于進一步開發(fā)的先導化合物或藥物候選物，為新藥發(fā)現(xiàn)提供物質(zhì)基礎；二是在藥物毒代動力學和分子毒理學方面開展研究工作，建立針對中藥毒性研究的評價體系，為全面、科學、正確地闡明中藥的毒性產(chǎn)生原理和作用機理探索出一條切實可行的研究途徑。在新藥安全性評價方面有深入的研究和務實的成績，在擔任國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心藥理毒理組組長期間，起草了國家藥品研究的毒理學指導原則，為我國創(chuàng)新藥物的研制做出了應有的貢獻。在中國藥科大學工作期間，負責主持多項國家及省部級重點攻關項目，ZhangLuyong,Jihuifang,WangQiujuan,LiuJinhan.EffectsofGuanfufUse-dependentBlockinMaximumUpstrokeVelocityinIsolatPharmacyandPharmacologyCommunicatio2)張陸勇，季慧芳，張暉。無鉀、低鈉溶液誘發(fā)的豚4)ZhenzhouJiang,MingYHTSofcompoundsforAlzheimer’sdisease,DrugDevelopmentResearch.2002;55(4):2498)ZhangluYong,JiangZhengzhou,CaiZh科大學學報.2003;34(1):41-419)HeLing,ZhangLuyong,LiuGuoqing.Long-termadministrp-glycoprotein-mediatedresistance.,中國天然藥物雜志.2012)何華紅，張陸勇，何玲，劉國卿。化學發(fā)光分析及其在藥理學上的應用13)HeLing,ZhangLuyongNovelestrogenreceptorligandsandtheirstructure-2005,51:1-10.14)WeigangDuan,YunYu,withCorilaginanditsAnalogueassociatedwithcorilaginanditsanalogue.YakugakuZasshi.2005Jul;125(7):587-91.activerecombinantRhokinasefromEscherichiacoli.BiolPharmBull.2006Jan;29(1):38-42.18)EstablishmentandApplicationofaHighThroughputModonFluorescencePolarizationBiolPharmBull.2006;29(6):.Inprtoxicokineticsstudy.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.Inpress.21)ZhenLing,Zhen-zhouJiang,XinHuang,Luspectrometry（LC-MS）methodforth111“333”工程第三層次培養(yǎng)對象11李戰(zhàn)，副研究員。1994年畢業(yè)于中國藥科大學藥理專業(yè)，獲得理學士學位。1994年至1996年任中國藥科大學教師，藥學院團總支書記；1996年至1999年任江蘇長澳醫(yī)藥有限公司技術開發(fā)部經(jīng)理；2000年獲得澳門國際公開大學工商管理碩士學位；2000年任南京長澳醫(yī)藥科技有限公司學術委員會主任、總經(jīng)理；2005年于中國藥科大學業(yè)市場調(diào)研、產(chǎn)品推廣管理，積累了豐富的經(jīng)驗，創(chuàng)造了獨特的產(chǎn)品開發(fā)模式。作為學術帶頭人主持研制和開發(fā)了鹽酸西布曲明膠囊、酒石酸托特羅定、依西美坦、羥苯磺酸鈣、鹽酸洛美利嗪、伊貝沙坦、那格列奈等數(shù)十個新藥項目2001年榮獲南京市科技進步二），），大學藥理專業(yè)，在職碩士生，研究方向：藥代動力學與毒代動力學。負責主持國家中醫(yī)藥管理局基礎研究基金“大黃總蒽醌的毒性機理研究與中藥安全性評價體系的建立”，作為主要成員參與國家drugsforAlzheimer’sdiseaseusingradioimmunoassaymethod.JournalofChinaPharmaUniversity(中國藥科大學學報)2003;34(1):41-44.ofcompoundsforAlzheimer’sdiseas