ICS65.020DB22B01吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3078—2019不同肥力耕地土壤微生物學(xué)指標(biāo)黑土Microbiologicalindexofcultivatedsoilindifferentfertilitydregree-Blacksoil吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3078—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳海燕、范作偉、陳帥民、李陽陽、沙洪林、遲暢、彭暢。IDB22/T3078—2019不同肥力耕地土壤微生物學(xué)指標(biāo)黑土1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黑土旱田不同肥力耕地土壤樣品采集制備、化學(xué)肥力指標(biāo)測定和微生物學(xué)肥力指標(biāo)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于黑土旱田耕地土壤微生物學(xué)指標(biāo)評價。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T32737土壤硝態(tài)氮的測定紫外分光光度LY/T1228森林土壤氮的測定NY/T52土壤水分測定法NY/T87土壤全鉀測定法NY/T889土壤速效鉀和緩效鉀含量的測定NY/T1121.1土壤檢測第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存NY/T1121.2土壤檢測第2部分：土壤pH的測定NY/T1121.6土壤檢測第6部分：土壤有機(jī)質(zhì)的測定NY/T1121.7土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定酸性土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀的測定聯(lián)合浸提-比色法土壤為植物正常生長提供并協(xié)調(diào)營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件的能力，是土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的綜土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀等土壤肥力指1DB22/T3078—20193.4微生物學(xué)肥力指標(biāo)soilfertilitymicrobialindex土壤微生物數(shù)量、土壤微生物量碳、土壤微生物量氮、土壤酶活性等土壤微生物學(xué)指標(biāo)。3.5土壤肥力評價soilfertilityevaluation根據(jù)土壤肥力的物理、化學(xué)和生物學(xué)各指標(biāo)、特性的數(shù)量和質(zhì)量，對土壤肥力綜合水平的評定。本標(biāo)準(zhǔn)是基于土壤化學(xué)肥力指標(biāo)的評價。4樣品采集制備4.1采集7月中旬至8月中旬，采集0cm～20cm土壤樣品。采樣應(yīng)符合NY/T1121.1的規(guī)定。4.2制備樣品采集后，去除石礫和植物殘根等雜物，分裝2份，1份置于4℃冰箱保存，用于測定土壤含水量、微生物數(shù)量、土壤酶活性和微生物量碳、微生物量氮；另1份風(fēng)干后用于測定土壤化學(xué)肥力指標(biāo)。5土壤肥力評價2DB22/T3078—2019表2土壤化學(xué)肥力參考值有機(jī)質(zhì)g/kg有效磷（P）mg/kg速效鉀（K）mg/kg堿解氮（N）mg/kg產(chǎn)量肥力水平kg/hm2高肥力中肥力低肥力≥3020～30≤20≥3525～35≤25≥180110～180≤110≥180120～180≤120≥1200010000～12000≤100006土壤微生物學(xué)肥力指標(biāo)6.1微生物學(xué)肥力指標(biāo)測定6.1.1微生物數(shù)量測定細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量，方法見附錄A。6.1.2微生物量碳測定方法見附錄B。6.1.3微生物量氮測定脲酶、過氧化氫酶、磷酸酶、蔗糖酶活性，方法見附錄D。6.2土壤微生物學(xué)肥力評價6.2.1微生物數(shù)量參考值微生物數(shù)量3DB22/T3078—2019表4不同肥力土壤微生物量碳、氮參考值肥力水平微生物量低肥力中肥力高肥力微生物量碳/（mg/kg）微生物量氮/（mg/kg）≤205.58204.3～308.93≥278.86≤61.5556.8～95.87≥87.116.2.3土壤酶活性參考值土壤酶活性參考值見表5。表5不同肥力土壤酶活性參考值肥力水平酶活性低肥力中肥力高肥力脲酶/（NH-Nmg/g/24h）≤12.1011.45～27.11≥22.743過氧化氫酶/（mLKMnO/g干土）≤1.83≤1.30≤6.861.48～2.401.30～1.746.70～9.00≥2.07≥1.60≥8.534磷酸酶/[mg酚/(g干土·24h)]蔗糖酶/（mLNa2S2O3/g干土）4DB22/T3078—2019AA附錄A（資料性附錄）土壤微生物數(shù)量的測定A.1原理稀釋平板法是測定土壤微生物數(shù)量最常用的一種方法。土壤微生物在高度稀釋條件下可以在固體平板上生長形成分散的菌落，即一個菌落代表一個單細(xì)胞。根據(jù)平板上的菌落數(shù)換算得到單位重量的土壤微生物數(shù)量。A.2設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：A.2.1天平：感量為0.01g。A.2.2恒溫培養(yǎng)箱：30℃±1℃。A.2.3無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）；也可是微量移液器及吸頭。A.2.4無菌錐形瓶：容量500mL。A.2.5無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。A.3試劑LB培養(yǎng)基（測量細(xì)菌數(shù)量）成分5DB22/T3078—2019將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至5.6±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min。A.3.3高氏一號培養(yǎng)基（測量放線菌數(shù)量）A.3.3.1成分A.3.3.1.1可溶性淀粉20gA.3.3.1.2硝酸鉀1gA.3.3.1.3磷酸氫二鉀0.5gA.3.3.1.4硫酸鎂0.5gA.3.3.1.5氯化鈉0.5gA.3.3.1.6硫酸亞鐵0.01gA.3.3.1.7瓊脂20gA.3.3.1.8蒸餾水1000mLA.3.3.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.1，分裝，121℃高壓滅菌15min。A.4操作步驟A.4.1用天平稱取10.00g土樣加入盛有100mL無菌水的500mL三角瓶中，在振蕩機(jī)上振蕩10min，形成土壤懸液。A.4.2吸取1mL土壤懸液到9mL滅菌水中，并在滅菌水中反復(fù)吸入吹出3次～5次，記為10，-1按10倍法稀釋，通常稀釋到10A.4.3根據(jù)各類微生物在土壤中數(shù)量的多少選擇適當(dāng)稀釋的土壤懸液接種。稀釋度真菌一般為10，放線菌為10～10，細(xì)菌為10～10，每一稀釋度重復(fù)3次～5次。-3-6A.4.4先于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中傾注18mL左右的培養(yǎng)基，凝固后，吸取0.1mL某一稀釋度土壤懸液于固體平板中，然后立即用涂布棒將懸液均勻涂抹于固體平板表面。A.4.5將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃～30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后（細(xì)菌2天～3天，真菌3天～5天，放線菌5天～7天），細(xì)菌和放線菌選取出現(xiàn)菌落數(shù)在20～200的培養(yǎng)皿，真菌選擇菌落數(shù)在10～100的培養(yǎng)皿記錄菌數(shù)。N=·X×n×10……………….(A.1)WN——每克干土中的菌落數(shù)，單位為cfu/g干土；X——菌落平均數(shù)，單位為個；n——稀釋倍數(shù)；W——土壤質(zhì)量，單位為克（g）。6DB22/T3078—2019BB附錄B（資料性附錄）土壤微生物量碳的測定B.1原理新鮮土壤經(jīng)氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡細(xì)胞發(fā)生裂解，釋放出的微生物量碳通過0.5mol/LK2SO4溶液提取后，用重鉻酸鉀-硫酸溶液進(jìn)行氧化。反應(yīng)結(jié)束后，用硫酸亞鐵來滴定剩余的重鉻酸鉀，根據(jù)所消耗的重鉻酸鉀量，計算得到有機(jī)碳量。根據(jù)熏蒸土壤和未熏蒸土壤測定有機(jī)碳量的差值及轉(zhuǎn)換系數(shù)（kEC），從而計算土壤微生物量碳含量。B.2設(shè)備和材料B.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。B.2.2真空干燥器：直徑22cm。B.2.3聚乙烯離心管：200mL。B.2.4消化管：150mL，24mm×295mm。B.2.5冰箱：-20℃和4℃。B.2.6水泵抽真空裝置。B.2.7油浴消化裝置：包括油浴鍋和鐵絲網(wǎng)。B.2.8可調(diào)溫電爐：2000℃±1℃。B.2.9燒杯：15mL、25mLB.3試劑普通氯仿試劑一般含有少量乙醇作為穩(wěn)定劑，使用前需除去。將氯仿試劑與蒸餾水按1:2（體積比）一起放入分液漏斗中，充分搖動1min，慢慢放出底層氯仿于燒杯中，重復(fù)洗滌3次。得到的無乙醇氯仿加入無水氯化鈣，以除去氯仿中的水分。純化后的氯仿置于暗色試劑瓶中，避光保存于4℃冰箱中。注意氯仿具有致癌作用，必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作。稱取經(jīng)130℃烘干的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）9.8110g溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。B.3.4重鉻酸鉀（0.1000mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取經(jīng)130℃烘干的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）4.9055g溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。7DB22/T3078—2019B.3.5硫酸亞鐵（0.05mol/L）溶液稱取13.9005g硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O，化學(xué)純）溶于800mL蒸餾水中，慢慢加入濃硫酸5mL，在用蒸餾水稀釋至1000mL，保存于棕色試劑瓶中。此溶液易被空氣氧化，需在每次使用前進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定方法：吸取0.1000mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0mL于150mL三角瓶中，加5mL濃硫酸和2滴鄰啡啰啉指示劑，用硫酸亞鐵溶液滴定至終點，根據(jù)所消耗的硫酸亞鐵溶液量計算其準(zhǔn)確濃度,按式（B.1）計算：C×V1V2M=....................................(B.1)式中：M——硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；C——重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；V1——吸取的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mL）；V2——滴到終點時消耗硫酸亞鐵溶液體積，單位為毫升（mL）。B.3.6鄰啡啰啉指示劑稱取1.49g鄰啡啰啉溶于100mL0.7%分析純硫酸亞鐵溶液。密封保存于棕色試劑瓶中。B.4.1.1稱取過2mm篩的新鮮土壤20.0g于25mL燒杯中，置于真空干燥器中，同時一并放置盛有50mL無乙醇氯仿的燒杯（燒杯內(nèi)放入少量防爆沸玻璃珠）和盛有50mLNaOH溶液的燒杯（NaOH用以吸收熏蒸過程中釋放出來的CO2），干燥器底部加入少量水以保持容器濕度。蓋上真空干燥器蓋子，用真空泵抽真空，使氯仿沸騰5min。關(guān)閉真空干燥器的閥門，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)24h。B.4.1.2熏蒸結(jié)束后，打開真空干燥器閥門（應(yīng)聽到空氣進(jìn)入的聲音，否則熏蒸不完全），取出盛有氯仿（可重復(fù)利用）和NaOH溶液的小燒杯，清潔干燥器，反復(fù)抽真空（5次或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打開干燥器蓋子），直至土壤無氯仿氣味為止。同時，另稱等量的3份土壤置于另一個干燥器中，作為不熏蒸對照處理。B.4.1.3從干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土壤，將土壤完全轉(zhuǎn)移到200mL聚乙烯離心管中，加入80mL0.5mol/L硫酸鉀溶液，300r/min振蕩30min，用中速定量濾紙過濾。同時做3個無土壤基質(zhì)空白。土壤提取液最好立即分析，或-20℃冷凍保存。吸取上述10mL土壤提取液于150mL消化管中，加入5mL重鉻酸鉀溶液（0.2000mol/L）、濃硫酸5mL，再加入3片或4片經(jīng)濃鹽酸浸泡過夜后洗滌烘干的瓷片（以防瀑），混勻后置于油浴消化裝置中煮沸10min。冷卻后轉(zhuǎn)移到150mL三角瓶中，用去離子水洗滌消化管3次～5次使溶液體積約為70mL，加入2滴鄰啡啰啉指示劑，用0.05mol/L硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由橙黃色變化為藍(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色即滴定終點。8DB22/T3078—2019B.5結(jié)果計算B.5.1有機(jī)碳量有機(jī)碳量按式（B.2）計算：×(V0?V)×M×fWA=12×103............................(B.2)式中：A——有機(jī)碳量，單位為毫克每千克（mg/kg）；V0——空白消耗的FeSO4溶液體積，單位為毫升（mL）；V——樣品消耗的FeSO4溶液體積，單位為毫升（mL）；M——FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；f——稀釋倍數(shù)；W——烘干土壤質(zhì)量，單位為克（g）；12——碳原子的毫摩爾質(zhì)量；10——為換算系數(shù)。3B.5.2土壤微生物量碳EC…………………..........(B.3)9DB22/T3078—2019CC附錄C（資料性附錄）土壤微生物量氮的測定C.1原理新鮮土壤經(jīng)氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡細(xì)胞發(fā)生裂解，釋放出的α-氨基酸態(tài)氮和銨態(tài)氮通過0.5mol/LK2SO4溶液提取，提取液中α-氨基酸態(tài)氮和銨態(tài)氮與茚三酮發(fā)生反應(yīng)，形成紫藍(lán)色化合物，其形成量與NH3濃度成正相關(guān)，故用茚三酮比色法測定提取液中NH3的含量。根據(jù)熏蒸土壤和未熏蒸土壤測定有機(jī)氮量（NH4-N）的差值及轉(zhuǎn)換系數(shù)（m），計算土壤微生物生物量氮。+C.2設(shè)備和材料C.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。C.2.2聚乙烯離心管：10mL。C.2.3真空干燥器：直徑22cm。C.2.4紫外分光光度計：200nm～1000nm。C.2.5水浴鍋：20℃～100℃。C.3.1無乙醇氯仿（CHCl3）同B.3.1。C.3.20.05mol/L硫酸鉀（K2SO4）溶液同B.3.2。稱取氫氧化鋰（LiOH·H2O）168g，加入冰乙酸279mL，加蒸餾水稀釋至1000mL，用濃鹽酸或50%取150mL二甲基亞砜（C2H6OS）和乙酸鋰溶液50mL，加入4g水合茚三酮（C9H4O3·H2O）和0.12g還原茚三酮（C18H10O6·2H2O）攪拌至完全溶解。10DB22/T3078—2019稱取4.7167g分析純硫酸銨（稱前105℃烘2h）溶于0.5mol/L硫酸鉀溶液中，并用硫酸鉀溶液稀釋至1000mL，搖勻，于4℃冰箱中保存。C.3.70.1mol/L的硫酸銨［(NH4)2SO4］標(biāo)準(zhǔn)液吸取10mL1mol/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)儲存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸鉀溶液稀釋至100mL，搖勻。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。C.3.8工作曲線的制備分別吸取0.1mol/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸鉀溶液稀釋至100mL，搖勻，其濃度分別為0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)氮的系列溶液。C.4分析步驟C.4.1熏蒸同B.4.1。C.4.2測定吸取0.5mL樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別置于10mL的塑料離心管中，加入2mL茚三酮顯色劑，渦旋攪拌充分混勻，置于試管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷卻，加入5mL稀釋液（50%乙醇水溶液），搖勻于570nm下比色。土壤微生物生物量氮按式（C.1）計算：BN=m×EN.....................................................................(C.1)式中：11DB22/T3078—2019DD附錄D（資料性附錄）土壤酶活性測定D.1土壤過氧化氫酶D.1.1原理過氧化氫酶能酶促過氧化氫分解生成分子氧和水，從而降低過土壤中氧化氫的毒害作用。土壤中過氧化氫酶的測定是根據(jù)單位時間析出的氧量或剩余的過氧化氫量來表示過氧化氫酶的活性。D.1.2設(shè)備和材料D.1.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。D.1.2.2往復(fù)式振蕩機(jī)：30r/min～300r/min。D.1.2.3滴定管：10mL。D.1.2.4三角瓶：150mL。D.1.3試劑D.1.3.1高錳酸鉀溶液[c(KMnO4)＝0.002mol/L]稱取化學(xué)純高錳酸鉀0.3161g，溶于1000mL無CO2蒸餾水中，儲于棕色瓶中，備用。D.1.3.20.3%H2O2按1:100將30%H2O2用水稀釋。稱取5g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于150mL三角瓶中。注入40mL蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫。同時設(shè)置對照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫，而不加土樣。塞緊瓶塞，置于120r/min往返式搖床上，振蕩30min。隨即注入5mL1.5mol/L硫酸以終止反應(yīng)，用致密濾紙過濾。取濾液25mL，用0.002mol/L高錳酸鉀溶液滴定至微紅色。以單位土重消耗的0.002mol/L高錳酸鉀毫升數(shù)（對照與試驗測定的差）表示土壤過氧化氫酶活VA1——土壤過氧化氫酶活性，單位為毫升高錳酸鉀每克干土（mLKMnO4/g干土）；12DB22/T3078—2019D.2土壤脲酶D.2.1原理土壤中脲酶能促尿素生成氨、二氧化碳和水。其中氨能與酚類化合物起反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，顏色深度與氨含量相關(guān)，因而用于脲酶活性的測定。D.2.2設(shè)備和材料D.2.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。D.2.2.2恒溫培養(yǎng)箱：20℃～70℃。D.2.2.3往復(fù)式振蕩機(jī)：30r/min～300r/min。D.2.2.4冰箱：4℃。D.2.2.5pH計。D.2.2.6紫外分光光度計：200nm～1000nm。D.2.2.7水浴鍋：20℃～100℃。D.2.2.8容量瓶：50mL。D.2.3試劑D.2.4甲苯10%尿素稱取10g尿素，用蒸餾水溶至100mL。D.2.4.1分別稱取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水；295g氫氧化鉀溶于1000mL蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將pH調(diào)至6.7，用蒸餾水稀釋至2000mL。D.2.4.3.1溶液1：將62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇稀釋至100mL。D.2.4.5.1稱取0.4717g硫酸銨溶于蒸餾水中并稀釋至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；D.2.4.5.2往50mL容量瓶中分別注入1mL、2.5mL、4mL、6mL、7.5mL及9mL的氮標(biāo)準(zhǔn)液，并用蒸餾水稀釋至刻度。得到分別含有0.1mg、0.25mg、0.4mg、0.6mg、0.75mg及0.9mg的13DB22/T3078—2019稱取10g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于100mL容量瓶中，加2mL甲苯。甲苯處理15min后，往瓶中注入10mL10%尿素溶液和20mL檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7），仔細(xì)混合。將瓶在38℃恒溫箱中放置24h后，用加熱至38℃的蒸餾水稀釋至刻度，搖蕩，將懸液過濾。濾液備用。與此同時，對每一土樣設(shè)置用水代替基質(zhì)的對照；對整個試驗，設(shè)置無土壤的對照，以檢驗試劑的純度。取濾液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至10mL，然后加入4mL苯酚鈉溶液，并立即加入3mL次氯酸鈉溶液。加入每一試劑后，立即將混合物仔細(xì)混合。混合后20min，將混合物體積稀釋至刻度。用1cm的比色槽，在分光光度計上于波長578nm處，測定顏色的深度。用供試樣品所得的消光值減去對照樣品消光值的差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮量。D.2.6結(jié)果計算土壤的脲酶活性，以每百克土的NH4-N的毫克數(shù)表示，按式（D.2）計算：+A=(C×V×10)×10..............................(D.2)2dwt式中：A2——土壤脲酶活性，單位為毫克NH4+-N每克土［mgNH4-N/（100g干土·24h）］；+-N每毫升（mgNH4C——土壤濾液中酶活性值，單位為毫克NH4V——土壤溶液體積，單位為毫升（mL）；10——分取倍數(shù)；++-N/mL）；dwt——烘干土壤重量，單位為克（g）。土壤磷酸酶活能酶解磷酸苯二鈉釋放出的酚，使其與氯代二溴對苯醌亞胺試劑反應(yīng)生色。用比色法測定出游離的酚量，用以表示磷酸酶活性。稱取300g檸檬酸鉀溶于700mL蒸餾水，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.0，用蒸餾水稀釋至1000mL。D.3.3.3硼酸鹽緩沖液（pH9.6與pH10.0）14DB22/T3078—2019稱取12.404g硼酸溶于700mL蒸餾水，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)至pH10.0，用蒸餾水稀釋至1000mL。D.3.3.4磷酸二鈉溶液將6.75g苯磷酸二鈉溶液溶于蒸餾水，并稀釋至1000mL。D.3.3.5甲苯D.3.3.6Gibbs試劑將200mg2,6-雙溴苯醌氯酰亞胺溶于乙醇，并稀釋至100mL。D.3.3.7標(biāo)準(zhǔn)溶液D.3.3.7.1母液：1g酚溶于蒸餾水中，并稀釋至1000mL，溶液保存在暗色瓶中。D.3.3.7.2測量前吸取5mL母液稀釋至100mL制成工作液。分別向100mL容量瓶中注入1mL、3mL、5mL、7mL、9mL、11mL工作液，分別得到0.05、0.15、0.25、0.35、0.45及0.55mg酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。D.3.4測定步驟取10g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于100mL容量瓶中，用1.5mL甲苯處理。甲苯處理15min后，注入10mL苯磷酸二鈉溶液和10mL相應(yīng)的緩沖液。將反應(yīng)混合物置于38℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h后，用38℃的熱水將瓶中內(nèi)容物稀釋至刻度，再用致密濾紙過濾。對每一土樣設(shè)置用10mL水代替基質(zhì)的對照。比色程序如下：a)取濾液1mL置于100mL容量瓶中，加入5mL相應(yīng)的緩沖液，用水稀釋至25mL，加1mLGibbs試劑。c)用水將瓶中混合物稀釋至刻度，并在24h內(nèi)，用1cm液槽，在分光光度計上于波長578nm處測得顏色的深度，讀取消光值。以供試樣品所得消光值減去對照樣品消光值的差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出酚量。.................................(D.3)A3——土壤磷酸酶活性，單位為毫克酚每克干土［mg酚/（g干土·24h）］；15DB22/T3078—2019D.4.1原理蔗糖酶能水解蔗糖酶生成的葡萄糖和果糖。水解的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。D.4.2設(shè)備和材料D.