序號(hào)：編碼：第十屆“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽作品申報(bào)書作品名稱：H1N1SIVHA蛋白的生物信息學(xué)分析、高效可溶表達(dá)及鑒別診斷SIV的夾心ELISA方法的建立學(xué)校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)申報(bào)者姓名（集體名稱）：謝易恒、李棟、蘇培穗、陳成果、周科、黃慧雄類別：√自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文□哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類報(bào)送方式：√省級(jí)報(bào)送作品□高校直送作品

說(shuō)明1．申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說(shuō)明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2．申報(bào)者在填寫申報(bào)作品情況時(shí)只需根據(jù)個(gè)人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫C表。3．表內(nèi)項(xiàng)目填寫時(shí)一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書可復(fù)制。4．序號(hào)、編碼由第十屆“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽全國(guó)組委會(huì)填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會(huì)調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請(qǐng)附中文本），請(qǐng)以4號(hào)楷體打印在A4紙上，附于申報(bào)書后，字?jǐn)?shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。6．發(fā)起高校的三件直送作品和各?。▍^(qū)、市）通過(guò)初評(píng)的作品（數(shù)量參照“作品數(shù)額分配方案”）各一式四份分別按全國(guó)組委會(huì)規(guī)定的時(shí)間用特快專遞寄至全國(guó)競(jìng)賽組委會(huì)辦公室。7．作品申報(bào)書須按要求由各省或各校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。8．其他參賽事宜請(qǐng)向本校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。9．寄送地址：南開大學(xué)團(tuán)委第十屆“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽組委會(huì)辦公室聯(lián)系人：韓旭聯(lián)系電話：（022）23508540傳真：（022）23508540郵政編碼：300071A2．申報(bào)者情況（集體項(xiàng)目）說(shuō)明：1.必須由申報(bào)者本人按要求填寫；2.申報(bào)者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3.本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者情況的確認(rèn)。申報(bào)者代表情況姓名謝易恒性別男出生年月1985．5學(xué)校華南農(nóng)業(yè)大學(xué)系別、專業(yè)、年級(jí)動(dòng)物科學(xué)（生物工程）學(xué)歷本科學(xué)制四入學(xué)時(shí)間2004．9作品名稱H1N1SIVHA蛋白的生物信息學(xué)分析、高效可溶表達(dá)及鑒別診斷SIV的夾心ELISA方法的建立畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642辦公電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)五山學(xué)生公寓5幢307郵政編碼510642住宅電他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位李棟男21本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院04級(jí)生物工程1班蘇培穗男24本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院04級(jí)生物工程1班陳成果男23本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院04級(jí)生物工程1班周科男22本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院04級(jí)生物工程1班黃慧雄男24本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院03級(jí)生物工程2班資格認(rèn)定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見(jiàn)以上作者是否為2007√是□否（部門簽章）年月日院、系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖?jiàn)本作品是否為課外學(xué)術(shù)科技或社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)成果。√是□否負(fù)責(zé)人簽名：年月日B1．申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說(shuō)明：1．必須由申報(bào)者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類請(qǐng)按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動(dòng)化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路對(duì)H1N1亞型豬流感病毒（SIV）血凝素基因(HA)的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，并且高效可溶表達(dá)SIVH1N1HA抗原蛋白，為開發(fā)新型豬流感基因工程疫苗打下基礎(chǔ)，同時(shí)建立鑒別診斷H1N1豬流感病毒的ELISA方法，為豬流感的防控提供科學(xué)依據(jù)。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利）高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來(lái)，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用生物信息學(xué)的相關(guān)知識(shí)對(duì)SIVH1N1HA基因及其氨基酸序列進(jìn)行一系列的分析，在了解HA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)上，高效可溶表達(dá)HA蛋白；同時(shí)用純化的HA蛋白做包被抗原，在制備豬流感病毒單克隆抗體時(shí)篩選針對(duì)SIVHA蛋白的單克隆抗體；用獲得的豬流感病毒HA抗原特異的單克隆抗體建立了鑒別診斷豬流感的夾心ELISA方法。同時(shí),用純化的HA蛋白做成豬流感基因工程疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)正在進(jìn)行中。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義從HA基因的生物信息學(xué)分析、高效可溶表達(dá)、豬流感病毒單克隆抗體的制備和鑒別診斷豬流感病毒的間接ELISA方法四方面進(jìn)行研究，研究了將重組H1N1亞型SIVHA蛋白作為ELISA診斷抗原的可行性，篩選到2株豬流感病毒單克隆抗體，建立檢測(cè)H1N1亞型SIV的間接ELISA方法，為防治豬流感的打下了基礎(chǔ)，為研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的指導(dǎo)意義。學(xué)術(shù)論文文摘豬是流感病毒傳播的中間宿主，豬感染豬流感病毒（SIV）后會(huì)導(dǎo)致其他疾病如藍(lán)耳病、高熱病、圓環(huán)病毒病、胸膜肺炎等疾病的發(fā)生，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時(shí)監(jiān)測(cè)是控制流感的首要步驟。H1N1亞型豬流感病毒的血凝素（HA)基因在流感病毒傳染的過(guò)程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過(guò)程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。本論文采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒廣東株的血凝素（HA）基因，測(cè)序后對(duì)HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作為診斷試劑。然后將HA基因克隆到高效可溶表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，SDSPAGE可檢測(cè)到分子量約為94.0ku的融合蛋白，通過(guò)薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。純化表達(dá)的HA融合蛋白作包被抗原用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選，成功篩選到2株豬流感病毒針對(duì)HA蛋白抗原表位的單克隆抗體；用制備的SIV單克隆抗體，建立了高特異性的檢測(cè)H1N1亞型SIV的夾心ELISA方法，為豬流感病毒的快速檢測(cè)提供有效的方法。作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會(huì)議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎(jiǎng)勵(lì)作品的論文正在整理中鑒定結(jié)果請(qǐng)?zhí)峁?duì)于理解、審查、評(píng)價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）科研管理部門簽章年月日C.當(dāng)前國(guó)內(nèi)外同類課題研究水平概述說(shuō)明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評(píng)審。豬流感（swineinfluenza，SI）是由豬流感病毒(屬正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，它屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大約為13.6kb，由大小不等的8個(gè)基因片段組成）引起的一種急性、熱性、高度接觸性的呼吸道傳染病，以突發(fā)、高熱、流淚、鼻液增多、咳嗽、呼吸困難、衰竭為主要特征。該病一年四季均可發(fā)生,不同日齡，性別和品種的豬均可感染，此外也能使人發(fā)病。豬是流感病毒傳播的中間宿主，豬感染豬流感病毒（SIV）后會(huì)導(dǎo)致其他疾病如藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、胸膜肺炎等疾病的發(fā)生，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重威脅。早在1918年，豬流感就在美國(guó)大流行，此后每年都有發(fā)生，并很快蔓延到許多國(guó)家。自1930年shop首次從豬體中分離到豬流感病毒后，目前已證實(shí)豬流感已遍布世界各地。根據(jù)有關(guān)研究資料得知在豬體中廣泛流行的豬流感病毒，主要是古典H1N1、類禽H1N1和類人H3N2三種亞型。1998年以前H1N1豬流感在美國(guó)是主要流行。我國(guó)的情況更不容忽視，1979年郭元吉對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的豬血清進(jìn)行豬流感檢測(cè)，H1的平均陽(yáng)性率為3.8%；而1998年倪漢忠的血清學(xué)顯示，廣東省豬群中H1抗體陽(yáng)性率為30.9%。張?zhí)K華等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002對(duì)上海市10區(qū)縣的30個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了針對(duì)性的調(diào)查，結(jié)果表明：1999年抗體陽(yáng)性率為31.6%，而2002年抗體陽(yáng)性率上升為82.9%。由此說(shuō)明H1N1流行有上升的趨勢(shì)。豬流感病毒具有感染人的潛力。作為流感病毒的“混合器”，豬流感病毒在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。另外人類流感和豬流感爆發(fā)的平行性和相關(guān)性,賦予了豬流感非常重要的公共衛(wèi)生意義。目前研究報(bào)道的SIVHA蛋白的原核表達(dá)幾乎是不可溶的微量表達(dá)，很難用于基因工程疫苗制備和建立診斷方法；而本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利）高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來(lái)，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢(shì)。目前尚沒(méi)有建立完善的用針對(duì)HA蛋白抗原表位的豬流感病毒單克隆抗體的建立的鑒別診斷SIV的ELISA方法。用單克隆抗體進(jìn)行豬流感的快速檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)，靈敏性高的特點(diǎn)，是其他血清學(xué)方法所不能及的。H1N1亞型豬流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒傳染的過(guò)程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過(guò)程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。我們采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒廣東株的血凝素HA基因，測(cè)序后對(duì)HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作為診斷試劑。然后將HA基因克隆到高效可溶表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。本研究通過(guò)薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。用純化的HA融合蛋白作包被抗原用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選，成功篩選到2株針對(duì)HA蛋白表位的豬流感病毒單克隆抗體；用制備的SIV單克隆抗體，建立了高特異性的檢測(cè)H1N1亞型SIV的夾心ELISA方法，為豬流感病毒的診斷提供新的方法，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

D.推薦者情況及對(duì)作品的說(shuō)明說(shuō)明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對(duì)推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名畢英佐性別男年齡62職稱教授（博導(dǎo)）工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號(hào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642單位電話02085280283住宅電話推薦者所在單位簽章（簽章）年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是由謝易恒同學(xué)為主的五位同學(xué)共同完成，時(shí)間從2006年5月到2007年6月。作品內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)本作品在了解SIV抗原蛋白（HA）的生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，高效可溶表達(dá)了HA蛋白，同時(shí)用純化的HA蛋白做包被抗原，用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選，篩選到2株豬流感病毒針對(duì)HA蛋白表位的單克隆抗體；用制備的SIV單克隆抗體，建立了檢測(cè)H1N1亞型SIV的ELISA方法，為豬流感病毒的快速診斷提供新的方法，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。當(dāng)前豬流感免疫疫苗主要是滅活疫苗及弱毒疫苗，因此對(duì)亞單位疫苗及基因工程疫苗的研究就顯得有廣闊的前景，用純化的HA蛋白做成基因工程疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫研究，有望成為滅活疫苗的有效補(bǔ)充。本作品技術(shù)水平高，有推廣應(yīng)用前景。其它說(shuō)明推薦者情況姓名曹永長(zhǎng)性別男年齡41職稱教授/博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號(hào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵編510642單位電話02085280283住宅電話37212563推薦者所在單位簽章簽章日期年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課外科技創(chuàng)新論文，在動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室完成，利用了本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和已有研究材料，選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。謝易恒等五位同學(xué)利用課余時(shí)間積極參與本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各項(xiàng)基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)，特別是對(duì)基因的生物信息學(xué)分析，能熟練查找和應(yīng)用分析軟件，分析結(jié)果對(duì)基因表達(dá)和蛋白生物學(xué)活性的預(yù)測(cè)具有很好的參考價(jià)值。內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)本作品選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，特別對(duì)現(xiàn)有豬流感的防治提供了很好的理論指導(dǎo)，為下一步的豬流感基因工程疫苗的制備和豬流感病毒的鑒別診斷打下了很好的基礎(chǔ)。本作品選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利），可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽(yáng)性血清具有很好的免疫反應(yīng)性。體現(xiàn)了五位同學(xué)具有一定的基因工程實(shí)驗(yàn)技能，能熟練應(yīng)用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行基因和蛋白的生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)免疫學(xué)技術(shù)如單抗的制備和篩選、ELISA方法的建立也有一定的掌握。本研究成果對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的理論和實(shí)踐指導(dǎo)作用，有推廣應(yīng)用前景。其它說(shuō)明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章（團(tuán)委代章）年月日校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章年月日各?。▍^(qū)、市）評(píng)審委員會(huì)初評(píng)意見(jiàn)評(píng)委簽名：年月日各省（區(qū)、市）組織協(xié)調(diào)委員會(huì)審定意見(jiàn)團(tuán)委科協(xié)教育廳學(xué)聯(lián)（簽章）（簽章）（簽章）（簽章）年月日

E．大賽組織委員會(huì)秘書處資格和形式審查意見(jiàn)組委會(huì)秘書處資格審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處形式審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處審查結(jié)果□合格□不合格負(fù)責(zé)人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處H1N1SIV（豬流感病毒）HA蛋白的生物信息學(xué)分析、高效可溶表達(dá)及鑒別診斷SIV的夾心ELISA方法的建立謝易恒李棟蘇培穗陳成果周科黃慧雄指導(dǎo)老師：謝青梅副教授作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州，510642摘要：豬是流感病毒傳播的中間宿主，豬感染豬流感病毒（SIV）后會(huì)導(dǎo)致其他疾病如藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、胸膜肺炎等疾病的發(fā)生，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時(shí)監(jiān)測(cè)是控制流感的首要步驟。H1N1亞型豬流感病毒（SIV）的血凝素（HA)基因在流感病毒傳染的過(guò)程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過(guò)程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。本論文采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒（SIV）廣東株的血凝素（HA）基因，測(cè)序后對(duì)HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作為診斷試劑。然后將HA基因克隆到高效可溶表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，SDSPAGE可檢測(cè)到分子量約為94.0ku的融合蛋白，通過(guò)薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。純化表達(dá)的HA融合蛋白作包被抗原用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選，篩選到2株豬流感病毒針對(duì)HA蛋白表位的單克隆抗體；用制備的SIV單克隆抗體，建立了高特異性的檢測(cè)H1N1亞型SIV的間接ELISA方法，為豬流感的防控奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：H1N1亞型豬流感病毒（SIV）血凝素（HA）生物信息學(xué)高效可溶表達(dá)單克隆抗體ELISA方法BiologicalinformationanalysisandhighsolubleexpressionofHAproteinofH1N1subtypeSwineInfluenzaVirusalongwithestablishmentofanELISAassaytodiagnoseSIVAuthor：XieYiheng，LiDong，SuPeisui，ChenChenguo，ZhouKe，HuangHuixiongDirectorteacher:XieQingmeiassociateprofessorCollegeofAnimalScience,SouthChinaAgric.Univ.，Guangzhou510642,ChinaAbstract：Swineisanintermediateofspreadinginfluenzavirus,swinesinfectedinfluenzaviruswillbringonotherdiseasessuchasPRRS,PCV,APP,causingeconomiclosesinthestockbreedingandintimidatingthehealthofhumansothatfastdiagnosisandtimelyanalysisarethefirststeptocontroltheinfluenzavirus.TheHAgeneofH1N1subtypeinfluenzavirusisolatedfromGuangdongProvincewassuccessfullyamplifiedbyRTPCR,thenanalyzedbiologicalinformationaftertranslatingDNAsuquences.AndtheHAfragmentwasinsertedintoplasmidpBCXtoobtainrebinantplasimdinwhichHAgenewasfusedinto.ThepMBXHAwastransformdintoE.coliBL21(DE3)toinduceHAgenefusionexpression.Thefusionproteinbandwithrelativemolecularmassof94000wasdetectedontheSDSPAGEgel,andthesolubleexpressionproductsaccountedfor29.5%ofthetotalE.coliproteins.Thesolubleformoftheexpressionproductswasupto90%thefusionprotein.FromwesternblotanalysisofrebinantproteinHA,theexpressionfusionproteinandpositivebloodserumofH1N1SIVhavefavorableimmunogenicity.ExpressedproteinHAisusedforcoatingantigentosublimatemonoclonalantibodyofswineinfluenzavirus.ThepreparationsofmonoclonalantibodyofswineinfluenzavirusareusedforestablishinganindirectELISAassaytodiagnoseSIVinordertopreventandcontroltheswineinfluenzavirus.Keywords：H1N1subtypeSwineInfluenzaVirushaemagglutininbioinformaticshighsolubleexpressionmonoclonalantibodymethodofELISA豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性的呼吸道傳染病。1975年以前，H1N1豬流感病毒以地方流行性存在于歐美大陸，其他地方少有報(bào)道；70年代末，H1N1豬流感傳入了我國(guó)臺(tái)灣，香港和大陸等地，并在亞洲廣泛盛行。有研究表明我國(guó)H1N1抗體陽(yáng)性率有不斷上升的趨勢(shì)。豬流感病毒具有感染人的潛力。據(jù)報(bào)道1976年，美國(guó)新澤西州的一名新兵感染豬源H1N1而死于肺炎。作為流感病毒的“混合器”，豬流感病毒在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。另外人類流感和豬流感爆發(fā)的平行性和相關(guān)性,賦予了豬流感非常重要的公共衛(wèi)生意義。生物信息學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，是采用計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息論方法究蛋白質(zhì)及核酸序列等各種生物信息的采集、存儲(chǔ)、傳遞、檢索、分析和解讀的科學(xué)。具體的說(shuō)，生物信息學(xué)是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語(yǔ)言，特別是非編碼區(qū)的實(shí)質(zhì)；同時(shí)在發(fā)現(xiàn)了新基因信息之后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測(cè)。應(yīng)用生物信息學(xué)分析H1N1亞型豬流感病毒HA基因及其氨基酸序列，打破傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，開創(chuàng)了“理論－實(shí)驗(yàn)－理論”的新模式。DNA重組技術(shù)又稱基因工程技術(shù)，為大量獲得蛋白質(zhì)/多肽（以下所稱“蛋白質(zhì)”和“多肽”通用）提供了技術(shù)支持。已有不少蛋白質(zhì)類藥物、疫苗、診斷試劑采用基因工程方法生產(chǎn)。本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。msyB基因編碼蛋白是大腸桿菌本身的蛋白，是一種高可溶性多肽，本身在大腸桿菌中表達(dá)量很高，其作為載體蛋白具有穩(wěn)定性、可溶性和表達(dá)水平高的特性。當(dāng)被誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，msyB多肽作為載體可與同外源蛋白一道分泌到大腸桿菌的胞質(zhì)中表達(dá)，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表達(dá)的外源蛋白能夠產(chǎn)生正確折疊。對(duì)那些在胞內(nèi)表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌有毒性的外源基因來(lái)說(shuō)，可以減弱其毒性，提高表達(dá)量，提高融合蛋白的穩(wěn)定性。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來(lái)，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢(shì)。融合蛋白使昂貴的細(xì)胞因子在獸醫(yī)上的應(yīng)用成為可能，由融合蛋白構(gòu)建的“生物導(dǎo)彈”更是提高了藥物的效力，因此融合蛋白表達(dá)技術(shù)是極具發(fā)展前景的一門技術(shù)。本研究對(duì)豬流感病毒HA基因的進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)，純化表達(dá)的HA融合蛋白作包被抗原用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選，篩選到2株豬流感病毒針對(duì)HA蛋白表位的單克隆抗體；用制備的SIV單克隆抗體，建立了檢測(cè)H1N1亞型SIV的夾心ELISA方法，為防治豬流感和研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。1材料1.1病毒豬流感病毒毒株：A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)。1.2菌種基因工程宿主菌E.coliDH5α、表達(dá)菌E.coliBL21（DE3）。pGEMTEasy載體質(zhì)粒（圖1）系統(tǒng)為Promega公司產(chǎn)品;pBCX質(zhì)粒（圖2）本實(shí)驗(yàn)室保存。圖1質(zhì)粒pGEMTEasy的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1SketchmapoftheplasmidpGEMTEasy圖2pBCX載體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2SketchmapoftheplasmidPbxcEasy1.3常用培養(yǎng)基以及試劑LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、LA固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100μg/mL）、氨芐青霉素100mg/mL、無(wú)RNA酶的DEPC水、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）、HRPRNA酶抑制劑（40U/μL）、小牛堿性磷酸酶（CIAP）、T4DNA連接酶及相應(yīng)緩沖液，ExTaqDNA聚合酶（5u/μL）、dNTPs（2.5mMeach）、DL2000DNAMarker、DEPC、IPTG、Amp、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、丙烯酰胺、N，N亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED、6xHisTag融合蛋白親和層析NiNTA凝膠、DNA片段快速純化/回收試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒。1.4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）緩沖液Tris甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）、5×SDSPAGE上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液、分離膠緩沖液（pH8.8）、濃縮膠緩沖液（pH6.8）。1.5Westernblot試劑轉(zhuǎn)移緩沖液：25mMTris，192mmol/L甘氨酸，20%（v/v）甲醇，0.037%（v/v）SDS，用HCl調(diào)pH至8.3。TBS緩沖液：150mmol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH7.5）。封閉液：5%脫脂奶粉，用TBS緩沖液配制，4℃保存。抗體稀釋液：1%脫脂奶粉/TBS，用于稀釋抗體，4℃保存。顯色液：在9mlL0.01mol/LTrisCl（pH7.6）緩沖液中溶解6mg二氨基聯(lián)苯胺，加入1mL0.3%的氯化鈷，最后加入10μL30%的雙氧水，混勻后立即使用。1.6蛋白純化試劑Lysisbuffer(pH8.0)、Washbuffer(pH8.0)、1.7抗體豬禽流感H1N1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清由廣東省獸醫(yī)防疫站惠贈(zèng)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG(二抗)購(gòu)自廣州博理生物技術(shù)公司。1.8主要儀器及設(shè)備PCRExpressGradientPCR儀、BIOID凝膠成像及分析系統(tǒng)、JY9211超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、EC57090蛋白質(zhì)電泳儀、冷凍高速離心機(jī)、超低溫冰箱、空氣搖床、WD9504型生化搖擺平臺(tái)、DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、AIRTECH醫(yī)用超凈工作臺(tái)1.9免疫試劑弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG（WM400）、IgG抗體亞類試劑盒、HRP羊抗鼠、IgG酶標(biāo)二抗、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、100倍HAT儲(chǔ)存液、100倍HT儲(chǔ)存液、75%乙醇溶液；碘酊溶液。1.10細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)液：IMDM培養(yǎng)基，補(bǔ)加0.37￥的NaHCO3、0.25%的葡萄糖，用1mol/LHCL調(diào)節(jié)PH至6.87.0，過(guò)濾除菌。完全培養(yǎng)液：含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，補(bǔ)加青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml及L谷氨酰胺1mmol/ml。HAT選擇培養(yǎng)液：含1%HAT儲(chǔ)存液的完全培養(yǎng)液。HT選擇培養(yǎng)液：含1%HT儲(chǔ)存液的完全培養(yǎng)液。1.11ELISA方法試劑包被液（500ml）：將1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3溶于450ml的高壓過(guò)的蒸餾水中，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)dpHD值到9.6。再補(bǔ)加蒸餾水至500ml，存放在4℃PBS溶液的配制（20倍，500ml）：分別將15.4Na2HPO4·12H2O、2gKH2PO4、80gNaCL、2gHCL融入500ml的蒸餾水中完全溶解后，放入高壓鍋中高壓備用。洗滌緩沖液（500ml）：向1倍的PBS溶液中加入吐溫20，制成含吐溫20為0.05%的1倍的PBS溶液。封閉液的制備：含5%脫脂奶粉的PBS溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。底物顯色液的配制：A液：四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：無(wú)水乙醇=1：100；B液：0.2mol/L的pH為6.0的醋酸鈉溶液，用醋酸調(diào)節(jié)pH值；C液：0.03%H2O2的溶液；按配方A液：B液：C液=1：4：5的比例配制。終止液的配制：1mol/L的H2SO4溶液。1.12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)所使用的九日齡雞胚購(gòu)于廣州農(nóng)科院畜牧研究所；8周齡Balb/c小白鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由本實(shí)驗(yàn)室保存并傳代。2方法2.1引物設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用DNAStar（4.0）軟件，參照GenBank中注冊(cè)的H1N1豬流感病毒血凝素基因（HA）序列，設(shè)計(jì)引物HAup1/HAdn1用于擴(kuò)增H1N1亞型豬流感的HA基因，引物理論跨幅分別為1701bp。引物由上海博亞生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀釋成25mmol/L溶液，-20℃HAup1：5'ttatgaaggcaatactagtgttc3'

HAdn1：5'tttcagatgcatattctgcactg3'2.2病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzolLSReagentRNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行,經(jīng)DEPC處理的無(wú)RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RTPCR或80℃保存。2.3HA2.3.1HA基因cDNA第一鏈的合成在20μL反應(yīng)體系中分別加入規(guī)定組分，混勻后，室溫放置10min，42℃保溫1h，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增，或-20℃保存（RNA3μL、5×buffer4μL、dNTPs4μL、RNA酶抑制劑0.5μL、HAup11μL、HAdn11μL、AMV2μL、DEPC水3.5μL）2.3.2HA基因cDNA的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為：10×buffer10μL、dNTPs4μL、HAup11μL、HAdn11μL、cDNA5μL、ExTaq1μL、ddH2O78μL，將上述反應(yīng)物混勻，在PCRExpressGradientPCR儀上按下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。2.3.3PCR產(chǎn)物的凝膠回收與純化將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外透射儀上，用手術(shù)刀片切下含目的條帶的凝膠，以3倍體積的溶膠緩沖液，65℃水浴使之完全溶化，加入離子交換柱，12,000r/m離心1min，棄去濾液，用含酒精的洗脫液清洗2次，10,000r/m離心1min甩干殘液，將適量雙蒸水加入交換柱，于50-60℃保溫?cái)?shù)分鐘，10,000r/m離心1min，收集濾液，用瓊脂糖電泳檢測(cè)回收效果?；厥盏腜CR產(chǎn)物在ExTaq作用下加尾，可直接用于連接。2.4THA重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.4.1PCR產(chǎn)物與pGEMTEasy載體的連接連接反應(yīng)體系為：2×buffer5μL、加尾的PCR產(chǎn)物3μL、pGEMTEasy1μL、T4DNA連接酶1μL?；靹蚝笊噪x心后，于4℃2.4.2DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備參照金東雁等（1996）的《分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法》，用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。2.4.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取上述制備的感受態(tài)細(xì)胞50μL，加入2.4.1中制備的連接產(chǎn)物5μL，混勻后冰浴30min，42℃熱休克90sec，迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻2min，加入200μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃搖床中以160r/m振搖培養(yǎng)45min；取100μL菌液涂布于含Amp的LB平板中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。2.4.4轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定從上述過(guò)夜培養(yǎng)的平板中挑取單個(gè)菌落，接種于3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，分別用PCR和酶切反應(yīng)進(jìn)行鑒定。2.4.5轉(zhuǎn)化子的PCR篩選直接以菌液作為模板進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)程序同2.3.2。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，命名為THA。2.4.6HA基因的序列測(cè)定將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒的菌液送交上海博亞生物技術(shù)進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。2.5用DNAstar軟件對(duì)HA基因進(jìn)行序列分析，包括同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹等。2.6HA2.6.1采用RACC服務(wù)器/RACC/，將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行稀有密碼子預(yù)測(cè)；2.6.2采用SignalP服務(wù)器http://.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行HA蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)；2.6.3采用TMHMM服務(wù)器http://.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/，將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行HA蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；2.6.4采用Bioedit7.0軟件，將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行HA蛋白的疏水性分析；2.6.5http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html,將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行HA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；2.6.6HA/Tools/antigenic.pl，將HA基因的氨基酸序列輸入工作區(qū)進(jìn)行HA蛋白抗原位點(diǎn)的預(yù)測(cè)；2.6.7將研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心(CBS)網(wǎng)站http://.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/進(jìn)行HA蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；2.6.8將研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心(CBS)網(wǎng)站http://.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/進(jìn)行HA蛋白的N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。2.7pBCX對(duì)H1N1亞型豬流感HA基因在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)2.7.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)測(cè)定的H1N1亞型豬流感HA基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，即HAup/HAdn，該片段理論跨度為1701bp，編碼566個(gè)氨基酸，在HAup5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)（斜體）和保護(hù)堿基，在HAdn加上SalI酶切位點(diǎn)（斜體）和終止密碼。引物由上海博亞生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀釋成25mmol/L溶液，-20HAup：5'ATGGATCCGACACAATATGTATA3'

HAdn：5'ATGTCGACGATGCATATTCTGCACT3'2.7.2用HAup/HAdn引物對(duì)從THA重組質(zhì)粒上擴(kuò)增HA基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL的溴化乙錠）電泳檢測(cè)。2.7.3P按TaKaRa公司凝膠純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，方法同2.3.3。2.7.4PCR產(chǎn)物的酶切將純化的HA基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用適量ddH2O溶解，在100μL反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)物，于37℃消化4h2.7.5酶切產(chǎn)物的凝膠回收方法同2.3.3。2.7.6質(zhì)粒載體pBCX的制備與消化在LA平板上劃線培養(yǎng)含有pBCX質(zhì)粒的E.coliDH5α，37℃溫箱中培養(yǎng)16h。挑取單菌落接種于3mLLA培養(yǎng)基中，37℃、200r/m振搖培養(yǎng)1620h。將3mL菌液分裝2只1.5mL離心管中，按照E.Z.N.A.?PlasmidMiniprepsKit質(zhì)粒DNA抽提試劑盒說(shuō)明書抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA溶解于50μLddH2O中。取2μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)質(zhì)粒的純度，用紫外吸收法測(cè)定質(zhì)粒DNA含量。在100μLpBCX質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系中加入反應(yīng)物(10×buffer10μL、BamHI5μL、SalI5μL、CIAP1μL、pBCX25μL、ddH2O54μL)于37℃酶切消化4h。2.7.7質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的回收方法同2.3.3。2.7.8將經(jīng)酶切消化、凝膠純化后的HA基因片段與質(zhì)粒酶切產(chǎn)物按T4DNA連接酶連接過(guò)夜。在10μL的連接反應(yīng)體系中加入反應(yīng)物（10×連接緩沖液1μL、HA基因片段3.5μL、pBCX1.5μL、T4DNA連接酶1μL、DdH2O3μL），連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化DH5α。2.7.9連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α受體菌取2.7.8中的連接產(chǎn)物5μL加入到50μLE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min；42℃熱休克90sec，而后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴2min；加入200μLLB液體培養(yǎng)基，于37℃以160r/m振搖培養(yǎng)45min。然后取200μL菌液涂布于LA固體瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h。2.7.10轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定以菌液為模板，以特異性的HAup/HAdn引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。2.7.11重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定抽提含有HA基因的重組質(zhì)粒命名為pBCXHA，用BamHI和SalI進(jìn)行酶切鑒定。2.7.12HA將陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌pBCXHABL21劃線培養(yǎng)；挑取單菌落接種于3mLLA液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/m的空氣搖床中培養(yǎng)10h，取出菌液，置4℃冰箱過(guò)夜；按1%比例將上述菌液接種于3mLLA液體培養(yǎng)基，37℃，220r/m振搖培養(yǎng)；當(dāng)OD600為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取0～5h菌液，12000rpm離心2min，去上清，細(xì)菌沉淀中加100μL1×SDS上樣緩沖液，-80℃凍融三次，沸水中煮3～5min，12000r/m離心2min，取上清進(jìn)行SDSPAGE電泳。同時(shí)，設(shè)pBC2.7.13按照《蛋白技術(shù)手冊(cè)》中的方法進(jìn)行（汪家政等，2000）。用的一抗是豬的H1N1亞型SIV陽(yáng)性血清，二抗是HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG。2.8H1N1SIV單克隆抗體的制備2.8.1免疫動(dòng)物選擇8周齡健康BALb/C小鼠，每只小鼠分別肌肉注射以弗氏完全佐劑乳化的疫苗,注射量為100μg（抗原含量）左右；2周后以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化H1N1SIV標(biāo)準(zhǔn)抗原腹腔注射；最后一次加強(qiáng)免疫時(shí)，直接腹腔注射100μg的H1N1SIV標(biāo)準(zhǔn)抗原；融合前3～4d尾靜脈注射50μg純化的病H1N1SIV標(biāo)準(zhǔn)抗原。2.8.2細(xì)胞融合SP2/0細(xì)胞及免疫鼠脾細(xì)胞用洗液作適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù),兩種細(xì)胞按1∶5的比例混合，離心去上清,緩慢加入PEG4000（pH8.0）,再加入洗液20～30mL，離心棄上清，加入HAT營(yíng)養(yǎng)液混勻。在鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上每孔加入100μL融合細(xì)胞懸液，最后將融合細(xì)胞培養(yǎng)板放置37℃2.8.3篩選及克隆用間接ELISA法篩選分泌陽(yáng)性抗體的雜交瘤細(xì)胞，所用的包被抗原是純化的H1N1SIVHA蛋白。將篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，將檢出的陽(yáng)性孔再次克隆和亞克隆，最后選擇OD值高、細(xì)胞活力好、只有一株細(xì)胞的孔擴(kuò)大培養(yǎng)。2.8.4腹水的制備將0.5mL高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，一周后注入適量的雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，待7～10d小鼠腹部極度膨脹時(shí)，抽取腹水，將收集好的腹水離心，上清于56℃2.9ELISA檢測(cè)以H1N1SIVHA蛋白篩選的單克隆抗體倍比稀釋后進(jìn)行方陣滴定，探索最佳的抗原包被濃度和血清的最佳稀釋度，并用最佳的抗原濃度包被酶標(biāo)板，檢測(cè)部分送檢的血清。3結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在約1700bp出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶(圖3)，與預(yù)期的大小相符，初步表明用RTPCR方法成功擴(kuò)增了SIVHA基因。圖3H1N1亞型SIVHA基因的RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、3、4為RTPCR擴(kuò)增出的目的條帶；Fig.3ElectrophoreticanalysisofRTPCRamplificationofH1N1subtypeSIVHAgeneM:DL2000DNAmarker(bp),1、2、3、4:RTPCRproductsHA基因的cDNA的克隆及鑒定SIVHAcDNA的RTPCR產(chǎn)物經(jīng)純化、加尾后，插入到pGEMTEasy載體的外源基因插入位點(diǎn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coilDH5，以培養(yǎng)的菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性菌液經(jīng)上海博亞生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中檢索的SIVHA基因同源性達(dá)95.3%以上，而氨基酸同源性為96.0%以上。圖4HA基因的cDNA的PCR鑒定M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、5、6、7為PCR鑒定陽(yáng)性菌落；3、4、8為陰性菌落Fig.4IndentificationofcDNAfromHAgenebyPCRM：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、5、6、7:prositivevelum,3、4、8:negativevelum3.3重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定PCR鑒定（圖5）得到陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳后（圖6），得到一大一小兩個(gè)片段，其中小片段與目的基因片段大小一致，表明重組質(zhì)粒pMXBHA已構(gòu)建成功。圖5重組質(zhì)粒PCR鑒定M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、3、4為PCR鑒定陽(yáng)性菌落Fig.5IdentificationofrebibantplamisdsbyPCRM：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、3、4:positivevelumbyPCR圖6重組質(zhì)粒的酶切鑒定1DNAmarkerDL15000(bp)；2pMXBHA重組質(zhì)粒EcoRI/XhoI雙酶切鑒定Fig.6Indentificationofrebinantplamidsbydigestionwithrestrictionendonucleases1DNAmarkerDL15000(bp)；2pMXBHAdigestedbyE.coRI/XhoI3.3HA基因的序列測(cè)定序列測(cè)定后推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，見(jiàn)圖7。結(jié)果表明其基因序列全長(zhǎng)為1701bp，共編碼566個(gè)氨基酸。atgaaggcaatactagtgttcttgctatatacatttgcgaccgcaaatgcagacacactaMKAILVFLLYTFATANADTLtgtataggttaccatgcaaataattcaactgacactgttgacacagtattagaaaagaatCIGYHANNSTDTVDTVLEKNgtaacagtaacacactctgttaaccttctagaagacagacataacggaaaactatgtaaaVTVTHSVNLLEDRHNGKLCKctaagaggggtagctccattgcatttgggtaaatgtaacattgctggatggctcctgggaLRGVAPLHLGKCNIAGWLLGaatccagagtgtgaattactattcacagcaagctcatggtcttacattgtggagacatctNPECELLFTASSWSYIVETSaactcagataatgggacatgttacccaggagatttcatcaattatgaagagctaagagagNSDNGTCYPGDFINYEELREcaattgagctcagtgtcatcatttgaaagatttgagatgttccccaagtcaagttcatggQLSSVSSFERFEMFPKSSSWcccaatcatgaaacgaacagaggtgtgacagcagcatgtccttatgctggagcaaacagcPNHETNRGVTAACPYAGANSttctacagaaatttaatatggcttgtaaaaaaagaaaattcatacccaaagctaagcaaaFYRNLIWLVKKENSYPKLSKtcctatattaacaataaggagaaggaggtcctcgtgctatggggaattcaccatccacctSYINNKEKEVLVLWGIHHPPaccagtgctgaccaacaaagtctctaccagaatgcagatgcctatgtttttgtggggtcaTSADQQSLYQNADAYVFVGStcaaaatacaacaagaaattcaggccagaaatagcagcaagacccaaggtgagaggtcaaSKYNKKFRPEIAARPKVRGQacagggagaatgaactactactggacactagtagaacctggagatacaataacattcgaaTGRMNYYWTLVEPGDTITFEgcaactggaaatctagtggtaccaagatatgccttcgcaatgaaaagaggttctggatctATGNLVVPRYAFAMKRGSGSggtattatcatttcagatacaccagtccacgattgcaacacgacttgtcaaacacccaaaGIIISDTPVHDCNTTCQTPKggtgctataaacaccagccttccattccagaatatacatccagttacaattggagaatgtGAINTSLPFQNIHPVTIGECccaaaatatgtcaaaagcacaaatttgagaatggctacaggattaagaaatatcccgtctPKYVKSTNLRMATGLRNIPSattcaatctagaggcctgtttggagctattgctggctttattgaagggggatggacaggaIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGatgatagatggatggtacggttatcaccatcaaaatgagcaaggatcaggatatgcagccMIDGWYGYHHQNEQGSGYAAgaccgaaagagcacacagaatgccattgacgggatcactaacaaagtaaattctgttattDRKSTQNAIDGITNKVNSVIgaaaagatgaacacacaattcacagcagtgggtaaagaattcaaccatctggaaaaaagaEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRatagagaatttaaacaaaaaagttgatgatggtcttctggatgtttggacttataatgccIENLNKKVDDGLLDVWTYNAgaactgttggttctattagaaaatgaaagaactttggattaccatgattcaaatgtgaagELLVLLENERTLDYHDSNVKaacctatatgagaaagtaagaagccagctaaaaaacaatgccaaggaaattggaaatggcNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGtgctttgaattttaccacaaatgtgatgacacgtgtatggagagcgtcagaaatggaactCFEFYHKCDDTCMESVRNGTtatgattatccaaaatactcagaagaagcaaaactaaacagagaggagatagatggggtaYDYPKYSEEAKLNREEIDGVaagctggaatcaacaaggatttaccaaattttggcgatctactcaactgtcgccagttcaKLESTRIYQILAIYSTVASSttggtactgttagtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgctccaatgggtctttaLVLLVSLGAISFWMCSNGSLcagtgcagaatatgcatctgaQCRICI.圖7HA基因的堿基序列和相應(yīng)的氨基酸序列Fig.7DNAsequenceofHAgeneandcorrespondingsequenceofAmidAcids3.4HA基因同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析3.4.1經(jīng)過(guò)測(cè)序可以知道SIVH1N1HA基因長(zhǎng)是1701bp,共編碼566個(gè)氨基酸。用DNAstar軟件對(duì)A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/163/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/166/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/235/97(H1N1)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其同源性高達(dá)95％以上，見(jiàn)圖8圖8四種SIVH1N1HA基因的同源性分析Fig.8congeneticanalysisamongfoursimilarSIVH1N1HA3.4.2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析根據(jù)http://./BLAST/Blast.cgi的分析結(jié)果，\t"trv01164298365"Distancetreeofresults進(jìn)行A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)和其參考毒株的進(jìn)化樹分析，如圖9圖9HA基因的進(jìn)化樹分析Fig.9DistancetreeofanalysisofSIVH1N1HAgene3.5HA基因及其氨基酸的生物信息學(xué)分析3.5.1圖10HA基因的稀有密碼子預(yù)測(cè)Fig.10rarecodeofanalysisofHAgeneH1N1HA有54個(gè)稀有密碼子，約占9.5％；分別有11個(gè)ATA編碼異亮氨酸；20個(gè)AGA、2個(gè)AGG以及1個(gè)CGA編碼精氨酸；4個(gè)CCC編碼亮氨酸；16個(gè)CTA編碼脯氨酸3.5.2（1）SignalPNNresult圖11HA蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)（SignalPNN）Fig.11signalPNNpredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA（2）SignalPHMMresult圖12HA蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)（SignalPHMM）Fig.12signalPHMMpredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于30和31位氨基酸殘基之間3.5.3圖13SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.13TransmembranehelicespredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA3.5.4圖14SIVH1N1HA氨基酸序列的疏水性預(yù)測(cè)Fig.14HydrophobicitypredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA該氨基酸序列主要有12段疏水區(qū)，分別位于420位，6095位，150165位，190198位，210218位，250290位，310320位，340360位，390405位，435450位，525550位。與疏水區(qū)相比，親水區(qū)占據(jù)了該肽鏈大部分區(qū)域。3.5.5圖15SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.15PredictionofsecondarystructureofthededucedproteinsofSIVH1N1HA3.5.6圖16SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的抗原位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.16locationofAntigencitypredictionofthededucedproteinsofSIVH1N1HAnStartPositionSequenceEndPosition14ILVFLLYT11217ADTLCIG23337LEKNVTVTHSVNL49455NGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAG76580GNPECELLFT89691SSWSYIVE987119REQLSSVSS1278149VTAACPYAGA1589162YRNLIWLVKK17110174SYPKLSK18011188KEVLVLWGIHHPPL20012204DQQSLYQNADAYVFVGS22013247YWTLVEP25314262TGNLVVPRYAF27215280SGIIISDTPVHDCNT29416303INTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKS32617336RNIPSIQS34318345GLFGAIAG35219428VDDGLLDVWT43720439NAELLVLL44621459VKNLYEKVRS46822481CFEFYHKCDD49023526RIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGA5493.5.7圖17SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.17PredictionofPhosphorylationsitesofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA當(dāng)取閾值為0.5的時(shí)候，在該序列中共有34個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。3.5.8圖18SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.18PredictionofNGlycosylationpotentialsitesofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA當(dāng)取閾值為0.5的時(shí)候，在該序列中共有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。3.6HA基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)用SDSPAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物（如圖19）,與誘導(dǎo)前相比，在相對(duì)分子質(zhì)量約94.0Ku處出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶，分子量大小與預(yù)期一致。用Ni－TNA樹脂過(guò)柱純化表達(dá)的融合蛋白，可以獲得高純度的目的蛋白（如圖20）。圖19HA融合蛋白的不同小時(shí)誘導(dǎo)SDSPAGE分析M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2為未加IPTG的細(xì)菌裂解產(chǎn)物，37：分別為IPTG誘導(dǎo)0h、1h、3h、4h和5h的細(xì)菌裂解產(chǎn)物Fig.19SDSPAGEanalysisoftheexpressedfusionproteinM：Relativemolecularmassofproteinmarker,1、2:BL21(DE3)celllysiswithoutIPTG;37:BL21(DE3)celllysisafterinductionfor0,1,3,4and5hrespectively圖20HA融合蛋白的純化M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3:elutionbuffer洗脫產(chǎn)物即純化的HA蛋白，2:表達(dá)的msyBHA總蛋白Fig.20purificationoftheexpressedfusionproteinM：Relativemolecularmassofproteinmarker,1、3:HAproteinofpurificationbyelutionbuffer，2:totalproteinoftheexpressionmsyBHA3.7表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及免疫印跡（WesternBlot）檢測(cè)經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的，如圖21。經(jīng)SDSPAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，用特異性的豬流感陽(yáng)性血清對(duì)HA融合蛋白進(jìn)行免疫印跡分析（WesternBlot），如圖22。酸纖維素膜上具有一條活性帶，大小與SDSPAGE表達(dá)的蛋白大小一致。證實(shí)了用載體pMBX表達(dá)的融合蛋白HA具有免疫活性。圖21HA基因表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析M、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(ku)；1、細(xì)菌裂解物上清的SDSPAGE；2、細(xì)菌裂解物沉淀的SDSPAGE；Fig.21SDSPAGEanalysisoftheexpressedProductionofSIVH1N1HAgeneM：Relativemolecularmassofproteinmarker,1:SDSPAGEofsupernatantofHAproteinlysis;2:SDSPAGEofsedimentofHAproteinlysis圖22HA基因表達(dá)產(chǎn)物WestenblotM、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(ku)1、H1N1SIVHA融合蛋白的Westenblot；Fig.22westernblotanalysisofrebinantproteinHA;M：Relativemolecularmassofproteinmarker,1:rebinantproteinHAofH1N1fromSIV3.8.1H1N1SIVHA單克經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合，陽(yáng)性孔上清用ELISA（用純化的HA蛋白作包被抗原）試驗(yàn)篩選，陽(yáng)性細(xì)胞株經(jīng)無(wú)限稀釋法克隆，篩選到IIIF6A4C10、ID4A3F8兩株能高效分泌HA蛋白特異性的單克隆抗體。IIIF6A4C10為IgG13.8.2H1N1SIVHA單克隆抗體特異性試驗(yàn)結(jié)果用ELISA方法檢測(cè)，兩株單抗IIIF6A4C10、ID4A3F8中ID4A3F8與H1、H9、H5亞型SIV有交叉反應(yīng)；僅IIIF6A4C10單抗與H5、H9亞型SIV不反應(yīng)，僅與H1亞型流感病毒反應(yīng)。證明IIIF3.9間接ELISA方法的建立3.9.1抗原抗體最佳稀釋度的確定用點(diǎn)陣滴定法，將H1N1SIV單克隆抗體和標(biāo)準(zhǔn)H1N1SIV抗原做系列稀釋，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)H1N1SIV單克隆抗體分別以10ug/mL包被，標(biāo)準(zhǔn)H1N1SIV抗原分別以11.4ug/mL包被，血清均以240倍稀釋時(shí)P/N值最大，即為抗原抗體最佳稀釋度。具體結(jié)果如圖23所示。注：P/N值為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清OD450/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450。圖23H1N1SIVHA抗原抗體最佳稀釋度確定Fig.23firmabilityofprimedilutedegreeforAgAbofH1N1SIVHA3.9.2封閉液的選擇將抗原以最適濃度包被，各加入1份陽(yáng)性和1份陰性對(duì)照血清反應(yīng)，按ELISA步驟操作，分別用3%BSA和5%脫脂奶粉作為封閉液，以0.5%BSA和1%脫脂奶粉作為樣品稀釋液，對(duì)同一樣品進(jìn)行反復(fù)三次測(cè)定OD450。對(duì)比ELISA試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算P/N值，結(jié)果表明以3%BSA/PBS封閉、0.5%BSA/PBS作為抗體稀釋液時(shí)效果較好。3.9.3待測(cè)樣品的檢測(cè)用純化IIIF6A4C10單克隆抗體包被酶標(biāo)板4、討論研究表明，H1N1亞型SIVHA基因全長(zhǎng)1701bp,共編碼556個(gè)氨基酸，是病毒表面主要糖蛋白之一，在病毒吸附、穿膜以及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用，HA是SIV保護(hù)性免疫的主要抗原，它不僅可以誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)。所以，用重組SIVHA蛋白檢測(cè)到的抗體代表了豬體保護(hù)性抗體水平的高低。國(guó)內(nèi)外已對(duì)檢測(cè)豬流感抗體的ELISA方法進(jìn)行了不少研究，HA蛋白的原核表達(dá)多以包涵體形式存在，不利于蛋白的生物活性檢測(cè)。不少學(xué)者嘗試用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HA蛋白，但蛋白的表達(dá)量不高，且表達(dá)過(guò)程遠(yuǎn)比原核表達(dá)繁瑣。本試驗(yàn)通過(guò)基因工程方法，利用表達(dá)載體pMXB成功地表達(dá)了H1N1亞型SIV的HA基因，表達(dá)產(chǎn)量占菌體蛋白的29.5%，且大部分以可溶的形式表達(dá)，這給目的蛋白純化提供了方便。為進(jìn)一步利用重組蛋白研制檢測(cè)H1N1亞型SIV特異性抗體的血清學(xué)方法，以及研制針對(duì)H1N1亞型SIVHA蛋白的單克隆抗體提供了基礎(chǔ)。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)的HA融合蛋白能夠與H1N1亞型SIV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的反應(yīng)，具有很好的反應(yīng)原性，研究了將重組H1N1亞型SIVHA蛋白作為ELISA診斷抗原的