SZDB/Z深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 2 4 5 5 5 6 8 91基于第二代測(cè)序技術(shù)的HLA高分辨分型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)適用于使用第二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行HLAbp：堿基對(duì)（basepair）RNA：核糖核酸（RibonucleiNGS：第二代基因測(cè)序技術(shù)（NextGenerationSPCR：聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReactiQ-PCR：定量聚合酶鏈反應(yīng)（QuantitativePolymerdNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphaSSP：特異性序列引物（SpecificSquencePrimer）A：腺嘌呤（Adenine）U：尿嘧啶（Uracil）2血和移植急性排斥反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。因此，對(duì)于經(jīng)典的HLA基因進(jìn)行分型在臨型與過(guò)去的低分辨分型相比配型速度更快，配型更精確，使得移植排斥反應(yīng)更小，手術(shù)成功率基于第一代sanger測(cè)序技術(shù)、利用邊合成邊測(cè)DNA序列的一種新的測(cè)序技術(shù)，在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)具有通量高、成本低等特點(diǎn)，能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)4.1檢測(cè)對(duì)象臨床具有造血干細(xì)胞移植、器官移植HLA配型需求HLA配型數(shù)據(jù)入庫(kù)需求的機(jī)構(gòu)的樣本。4.2受檢者資料和樣本的采集、運(yùn)輸與保存檢測(cè)項(xiàng)目：根據(jù)臨床需要選擇需3外周血樣本），.4外周血樣本在常溫下運(yùn)輸保存不超過(guò)7天，2℃~8℃條件下保存不超過(guò)15天，-20℃可.1當(dāng)外周血樣本檢測(cè)出現(xiàn)異?；驘o(wú)法解釋的結(jié)果時(shí)，建議將外周血與口腔拭子一并采樣檢測(cè)。對(duì)骨髓移植受檢者或近期有輸血史的受檢者，因外周血及其提取的DNA樣本均可.2口腔拭子采集前半小時(shí)請(qǐng)勿進(jìn)食.3采集時(shí)一手持采樣拭子/消毒棉簽伸入左上部口腔，在口腔側(cè)壁與牙齦交匯處旋轉(zhuǎn)擦拭約風(fēng)干，每人至少采集4根。采集過(guò)程中避免用手觸及棉簽頭，以免造成樣本污染；勿.4將風(fēng)干后的拭子/棉簽裝進(jìn)一次性清潔密封袋，置于潔凈容器中，添加干燥劑后密封包.6置于2℃~8℃條件下可保存15天，干燥的拭子長(zhǎng)期儲(chǔ)存則需置于-20℃凍存。.1樣本質(zhì)量要求：DNA總量應(yīng)≥10μg，濃.2樣本包裝：保存于1.5mLEP管，用封口膜密封.3樣本運(yùn)輸及保存：采用冰袋或干冰進(jìn)行低溫（低于4℃)運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)間不超過(guò)7天。樣臍帶血樣本.1臍帶血樣本的采集、運(yùn)輸與保存參見(jiàn)外周血樣本的采集、運(yùn)輸和保存。45.1.1接收樣本時(shí)核對(duì)樣本5.1.2檢查待檢樣本狀態(tài)，根據(jù)4.2.2要求，對(duì)符合要求的樣本，接收并登5.2.1使用DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取樣本中游離的人類(lèi)全基因組DNA。5.2.2提取過(guò)程中，設(shè)置陰性對(duì)照和重復(fù)對(duì)照。5.2.3提取后的DNA置于-20℃條件下保存6個(gè)月，或-70℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。5.2.4DNA濃度要求：DNA量≥4μg，濃度≥20ng/5.3.2PCR擴(kuò)增后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。條帶應(yīng)該明亮清晰，片段大小基“A”使得DNA片段與5'端帶有“T”堿基的特殊接5.4.2使用Agilent2100電泳檢測(cè)文庫(kù)的片段大小及產(chǎn)量，使用Q-PCR儀檢測(cè)文庫(kù)產(chǎn)量；根據(jù)5.4.3混合后的文庫(kù)與光學(xué)透明玻璃芯片上的接頭雜交，使用第二代高通量測(cè)序儀進(jìn)行HLA型別數(shù)據(jù)庫(kù)采用國(guó)際IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)55.6.1基于第二代測(cè)序技術(shù)的HLA高分辨分要求，原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格遵循從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣5.6.2數(shù)據(jù)分析對(duì)硬件的要6.1檢測(cè)報(bào)告包含受檢者基本信息和送檢單位信息。6.3檢測(cè)報(bào)告注明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，并告知結(jié)果僅供臨床參考?；诘诙鷾y(cè)序技術(shù)的HLA高分辨7.1受檢者資料包括送檢單、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，均保存5年以上，另有規(guī)定的除7.2受檢者樣本包括外周血、臍帶血和DNA樣本，可按要求保存期限在3年以上。8.1相關(guān)人員應(yīng)接受生物安全、檢測(cè)技術(shù)等專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，持證上崗。8.2配備必要的基礎(chǔ)設(shè)施和適宜的檢測(cè)環(huán)境，對(duì)設(shè)施和環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。8.3設(shè)立陰性和重復(fù)對(duì)照，確保每次檢測(cè)的質(zhì)量。如陰性對(duì)照與預(yù)期結(jié)果不相符時(shí)，進(jìn)行原因分8.4數(shù)據(jù)分析結(jié)果中各位點(diǎn)純合子采用其他方法，如雙脫氧鏈終止測(cè)序法(Sanger法)或特異性序列），6*送檢醫(yī)師系7 樣本接收日期8表B.1基于第二代測(cè)序技術(shù)的HLA高樣本編號(hào)HLA-A*HLA-B*HLA-C*HLA-9next-generationsequencing.TissueAntigens,2009,3-403[3]ChunlinWang.etal.High-throughput,high-?d