分子生物學(xué)

——生命科學(xué)領(lǐng)域的革命DNA的結(jié)構(gòu)與功能RNA在蛋白質(zhì)合成中的功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、遺傳密碼的破譯基因表達(dá)調(diào)控的本質(zhì)被闡明人類開始了從生物學(xué)的必然王國向自由王國的大進(jìn)軍。分子水平的生物學(xué)研究，正越來越多地影響傳統(tǒng)生物科學(xué)的各個領(lǐng)域分子生物學(xué)的3條基本原理構(gòu)成生物體各類有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是相同的生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循共同的規(guī)則某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性分子生物學(xué)簡史理論上的三大發(fā)現(xiàn)

生物的遺傳物質(zhì)是DNADNA雙螺旋模型遺傳信息的傳遞方式技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)

基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn)載體的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1.理論上的三大發(fā)現(xiàn)

1.1生物的遺傳物質(zhì)是DNA

Griffith，1928：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗Avery，1943：體外轉(zhuǎn)化實驗Hershey，1952：噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗英國科學(xué)家格里菲思1879—19411928年，細(xì)菌學(xué)家Griffith肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗無毒的R型菌與被殺死的有毒的S型菌混合后轉(zhuǎn)化為有毒的S型活菌.

說明S菌體內(nèi)有一種"轉(zhuǎn)化因子"OswaldTheodoreAvery（1877～1955）加拿大生物化學(xué)家艾弗里細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗1944年，Avery死去的S型菌并未復(fù)活，而是S型菌的DNA進(jìn)入了R型菌，使其轉(zhuǎn)化為新的S型致病肺炎雙球菌。肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗

注射R型活菌小鼠不發(fā)病（存活）

注射S型滅活菌小鼠不發(fā)?。ù婊睿┳⑸銼型活菌小鼠發(fā)病死亡注射R型活菌+S型死菌

小鼠發(fā)病死亡心血分離到S型活菌

⑴

動物試驗熱致死S型菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)

無菌落生長

R型活菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出R型菌落

熱致死S型菌+R型活菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出大量R型和S型菌落R型活菌+S菌抽取提物

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出大量R型和S型菌落⑵

細(xì)菌培養(yǎng)試驗

AlfredDayHershey（1908～1997）美國微生物學(xué)家赫爾希噬菌體轉(zhuǎn)染實驗

第一步：把宿主細(xì)菌培養(yǎng)在含有35S（或32P）培養(yǎng)基中，然后用T2噬菌體去感染，結(jié)果獲得的子代噬菌體被標(biāo)上35S或32P。第二步：標(biāo)記了的噬菌體去感染未標(biāo)記的細(xì)菌。1952年，美國Hershey噬菌體轉(zhuǎn)染實驗

第三步：強(qiáng)烈攪拌洗滌，以便使吸附在菌體外表的T2噬菌體蛋白質(zhì)外殼脫離細(xì)胞并均勻分布，再進(jìn)行離心沉淀，分別測定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。結(jié)果：幾乎全部35S都在上清液中，而幾乎全部32P和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中1952年，美國Hershey

1.2DNA雙螺旋模型

1953Watson/Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型；

意義：對生命科學(xué)的發(fā)展作用可與達(dá)爾文學(xué)說媲美，與孟德爾定律齊名。從而使遺傳學(xué)的研究全面進(jìn)入分子遺傳學(xué)階段．DNA的模型的研究鮑林研究小組威爾金斯、富蘭克林研究小組沃生、克里克研究小組鮑林(Pauling)研究小組主要工作：鮑林等1951年(提出蛋白質(zhì)α-螺旋模型后)開始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。提出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。評價：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。注：1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎。威爾金斯、富蘭克林研究小組主要工作成就：Wilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術(shù)；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)在外側(cè)，同時測得了DNA螺旋的直徑和螺距。富蘭克林拍攝的DNA晶體的X射線衍射照片，這張照片正是發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵沃生、克里克研究小組Waston、Crick(1951-1953)：研究手段非常簡單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。理論知識深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用?；谝延械难芯砍晒琖aston和Crick于1953年提出了他們的第三個DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。（被公認(rèn)為分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志）隨后證明了DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題Waston，Crick和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義DNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)同時表明了DNA復(fù)制的明顯方式——堿基互補配對原則上的半保留復(fù)制。提示了基因和多肽成線性對應(yīng)的一個可能理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基序列；并存在某種遺傳密碼，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。在其后的幾十年中，科學(xué)家們沿著這兩條途徑前進(jìn)，探明了DNA復(fù)制、遺傳信息表達(dá)與中心法則等內(nèi)容。1.3確定了遺傳信息的傳遞方式1961年Monod和Jacob提出了操縱子學(xué)說；1964年Nirenberg等提出了“三聯(lián)體密碼說”；Crick提出了遺傳信息流向和表達(dá)的中心法則這三大發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了生命科學(xué)的迅速發(fā)展，為基因工程的誕生奠定了重要的理論基礎(chǔ)．

GeneExpression中心法則(centraldogma)闡述了生物世代、個體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過程中的信息流向最初由Crick提出，并經(jīng)過了多次修正2.技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)

2.1基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接

GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。限制酶命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口

粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口當(dāng)一個DNA分子含有6個拷貝的GAATTC:它將被酶切成7個片段，可用凝膠電泳方法將其分離。(Thelargestfragment)(Thesmallestfragment)采用幾種限制性內(nèi)切酶組合可以使DNA分子產(chǎn)生特定的片段.e.g.EcoRI+HindIIIDNA連接酶(DNAligase)1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。活性：封閉DNA鏈上缺口，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。要求：這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。DNA連接酶的作用機(jī)制細(xì)菌的DNA連接酶以NAD為能源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶以ATP為能源。T4的DNA連接酶可以連接平末端。重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基2.2基因運載工具—DNA載體的使用染色體外的遺傳因子細(xì)菌的性因子—F因子Lederberg1946抗藥性因子（R）大腸桿菌素因子（COE）質(zhì)粒Cohen1973基因載體為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。6×Hisλ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列粘性質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他載體2.3逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

逆轉(zhuǎn)錄病毒最早于1911年由Rous從雞肉瘤組織中分離。

1970年Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制是通過DNA中間階段，病毒DNA可整合于宿主細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)關(guān)于DNA

RNA

蛋白質(zhì)的概念,因而獲得NobelPrize。分子生物學(xué)的研究內(nèi)容

DNA重組技術(shù)基因表達(dá)調(diào)控研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究——結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究DNA重組技術(shù)（又稱基因工程）將不同的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀DNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、酶工程及微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)長期深入研究的結(jié)晶，限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶及其它工具酶發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。Cohen等首次進(jìn)行的DNA體外重組PSC101R6-3：質(zhì)粒Ner：抗新霉素基因Sr：抗黃胺基因Tcr：抗四環(huán)素基因SrSr

NerTcrPsc101R6-3ECORIECORI轉(zhuǎn)化E.coli連接酶細(xì)菌基因工程重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體基因工程是創(chuàng)造奇跡的科學(xué)，有著驚人的發(fā)展?jié)摿蜆O其廣闊的應(yīng)用前景“我們建議像縫紉一樣，把基因連接到工業(yè)微生物中，促使它們生產(chǎn)大量的生命所需的蛋白質(zhì)……這是生物和醫(yī)學(xué)的真正大革命。我們Cetus人員預(yù)言，到2000年，事實上，所有人類主要疾病都將由雜種微生物生產(chǎn)的對疾病特異的人工蛋白質(zhì)處理而得到治療?！敝亟MDNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂DNA重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等，提高產(chǎn)量、降低成本，使許多有價值的多肽類物質(zhì)得到廣泛應(yīng)用。可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，使它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價值或功能得以成百上千地提高。如分解石油的工程菌，產(chǎn)生蜘蛛絲的細(xì)菌等。還可用于基礎(chǔ)研究。無論是對啟動子的研究，還是對轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析，都離不開重組DNA技術(shù)。基因表達(dá)調(diào)控研究基因表達(dá)實質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個體生長發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時序發(fā)生變化，并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正。基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上。主要研究方向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究轉(zhuǎn)錄因子研究RNA剪接研究等。生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究