項(xiàng)目類別項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)附件3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目結(jié)題書項(xiàng)目名稱：H7亞型禽流感特異性RT－PCR檢測(cè)方法的建立、條件優(yōu)化及應(yīng)用申請(qǐng)人：徐珊、張停婷、陳梓棟所在院部：獸醫(yī)學(xué)院專業(yè)年級(jí)：動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)聯(lián)系電話：3152627513824497804指導(dǎo)教師:辛朝安、任濤職稱教授、副教授立項(xiàng)日期：二○○五年四月五日結(jié)題日期：二○○六年四月五日華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心填表說明一、填寫結(jié)題報(bào)告書前，請(qǐng)先咨詢指導(dǎo)教師或有關(guān)專業(yè)教師。申請(qǐng)書的各項(xiàng)內(nèi)容要求實(shí)事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)明確、嚴(yán)謹(jǐn)，一律要求用打印稿件。二、申請(qǐng)書為A4復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。一式三份（至少一份原件），由指導(dǎo)教師和所在院（部）審查并簽署意見后報(bào)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心。三、一級(jí)標(biāo)題三號(hào)宋體加粗，用“一、二、三”標(biāo)示；二級(jí)標(biāo)題四號(hào)楷體加粗，用“（一）（二）（三）”標(biāo)示；三級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋加粗，用“1、2、3”標(biāo)示；四級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋，用“①②③”標(biāo)示。示例：一、《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義（一）《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的的意義1、《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義①《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義四、如表格不夠，可以加附頁。簡表項(xiàng)目簡況項(xiàng)目名稱H7亞型禽流感特異性RTPCR檢測(cè)方法的建立、條件優(yōu)化及應(yīng)用項(xiàng)目類別A、文科類；B、理科類；申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)1500元起止年月2005年4月－2006年4月項(xiàng)目組成員姓名性別出生年月年級(jí)專業(yè)班級(jí)所在學(xué)院上學(xué)年綜合測(cè)評(píng)分項(xiàng)目中的分工本人簽字徐珊女1983年4月動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)1班獸醫(yī)學(xué)院78.47引物設(shè)計(jì)和條件優(yōu)化徐珊張停婷女1982年2月動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)1班獸醫(yī)學(xué)院76.66特異性試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)張停婷陳梓棟男1983年9月動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)1班獸醫(yī)學(xué)院83.07敏感性試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)陳梓棟指導(dǎo)教師情況姓名辛朝安性別男學(xué)位碩士職稱教授研究方向預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，病毒學(xué)授課名稱禽病學(xué)姓名任濤性別男學(xué)位博士職稱副教授研究方向預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，病毒學(xué)授課名稱動(dòng)物病毒分子生物學(xué)項(xiàng)目簡介本研究建立了禽流感病毒（AIV）A型H7亞型特異性RTPCR的檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)H7亞型AIV。所建立的RTPCR方法從核酸提取、基因擴(kuò)增到產(chǎn)物分析在34h內(nèi)即可完成。通過對(duì)AIV的HA基因其他亞型如H1、H3、H5、H9及常見RNA病毒IBV、NDV等的檢測(cè)表明無交叉反應(yīng)；對(duì)AIVH7亞型尿囊液能檢出的最低稀釋度達(dá)104，相當(dāng)于0.8×102.76EID50。用該方法分別檢測(cè)通過人工發(fā)病采集的78份棉拭子樣品和100份組織病料樣品，并與雞胚病毒分離結(jié)果做比較，二者H7亞型的鑒定結(jié)果陽性符合率高達(dá)90.5％。結(jié)果表明，該方法具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，為臨診樣品中AIVH7亞型鑒定和快速診斷的有效方法，同時(shí)還具有較好的生物安全性。二、項(xiàng)目研究的內(nèi)容與方法1、引物設(shè)計(jì)參照禽流感病毒H7亞型血凝素（HA）設(shè)計(jì)合成了一對(duì)的特異性、敏感性好的引物SN1和SN2。上游引物SN1：5’>TCTTCD(T)TTCTATGCR(G)GAGATGAA<3’下游引物SN2：5’>TR(G)AAR(G)GTV(C)ACY(T)GTGTCATTR(G)G<3’（D=A/G/T,R=A/G,V=A/G/C,Y=C/T）2、條件優(yōu)化對(duì)退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度、PCR的引物濃度、擴(kuò)增溫度、酶的用量、引物用量及循環(huán)參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，提高PCR反應(yīng)的產(chǎn)量和特異性。反應(yīng)條件確定如下：25uL反應(yīng)體系：ddH2O16.7ul；10×Buffer2.5ul；dNTPs2.5ul；上、下游引物各0.5ul(20pmol/ml)；EXTaq(Taq)0.5ul(2.5U)；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2uL。反應(yīng)程序：95°C3min；95°C45sec；52.2°C45sec；72°C45sec30個(gè)循環(huán)；72°C8min。3、特異性試驗(yàn)用所建立的RTPCR方法對(duì)家禽其他常見病毒IBV、ILTV、NDV、AIV（H1、H3、H5、H9亞型）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明無交叉反應(yīng)。4、敏感性試驗(yàn)利用所設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)感染性尿囊液的檢測(cè)低限為1045、臨床樣品檢測(cè)①非免疫雞組織臟器、咽和肛拭子的RTPCR與雞胚病毒分離檢測(cè)方法的比較用實(shí)驗(yàn)室保存的AIVH7進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，采集人工感染的雞進(jìn)行臟器組織病料、咽和肛拭子進(jìn)行RTPCR檢測(cè)和雞胚病毒分離檢測(cè)，比較兩者的陽性符合率。②大量樣品的檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的NDV、IBV、ILTV、IBDV、MDV等，以及多個(gè)亞型禽流感病毒生物學(xué)特性研究、疫苗研究等采集的樣品，進(jìn)行AIVH7亞型RTPCR模擬臨床檢驗(yàn)，分析結(jié)果并比較與雞胚病毒分離法的符合率。三、項(xiàng)目研究過程與資料查閱情況（一）研究過程1、2005.082005.09：設(shè)計(jì)合成引物。2、2005.092005.12：對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。3、2005.122005.01：特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)。4、2005.012006.03：臨床樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。（二）資料查閱1、辛朝安，2003，禽病學(xué)（第三版）.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社。2、[美]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社。3、殷震，劉景華，1985，動(dòng)物病毒學(xué)，科學(xué)出版社。4、[美]F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾，1998，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社。5、盧圣棟，1993，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高等教育出版社。6、RichardA.Collins,LungSangKo,KingYipFung,etal.RapidandsensitivedetectionofavaininfluenzavirussubtypeH7usingNASBA.BiochemicalandBiophysicalResearchmunications300.2003,5075157、龐耀珊，謝芝勛，鄧顯文等，多重RTPCR診斷方法的建立，2005，21（7）：593597，中國人畜共患病雜志。8、劉燕，錢愛東，禽流感病毒H5和H9亞型RTPCR檢測(cè)方法的建立，2004,26(1):9396，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)。9、朱文斯，賴平安，黃茵華等，熒光RTPCR快速檢測(cè)禽流感病毒H5亞型的研究，中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2003，1（5）：2810、陳化蘭，于康震，禽流感病毒A/Afri.Star/EngQ/983/79/(H7N1)血凝素基因的全序列分析,1998，20（5）：258，中國畜禽傳染病，11、鄭曉飛，RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，2004四、項(xiàng)目成果完成形式和價(jià)值設(shè)計(jì)合成多對(duì)針對(duì)高致病性禽流感病毒H7亞型的引物，篩選一對(duì)特異性、敏感性好的引物。利用這對(duì)引物，通過對(duì)RTPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了高致病性禽流感病毒H7亞型特異性RTPCR檢測(cè)方法。該方法敏感性可達(dá)104稀釋度，相當(dāng)于0.8×102.76EID50，特異性好，與NDV、IBV、ILTV以及AIV的其它亞型間無交叉反應(yīng)。利用所建立的RTPCR方法檢測(cè)雞組織病料及咽、肛拭子，檢測(cè)結(jié)果與雞胚病毒分離培養(yǎng)陽性符合率高達(dá)90.5％，該RTPCR檢測(cè)所需時(shí)間短，將傳統(tǒng)雞胚分離病毒診斷方法一周左右的時(shí)間縮短為34h小時(shí)，為AIVH7亞型鑒定和快速診斷提供了有效的方法。1、通過該項(xiàng)研究建立了高致病性禽流感病毒H7亞型特異性RTPCR檢測(cè)方法，為我國對(duì)H7亞型HPAIV的預(yù)防與控制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2、本研究的課題為任濤副教授擔(dān)任主要研究人員的“十五”國家重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目，該項(xiàng)目培養(yǎng)了2名碩士研究生，1名博士生，2人晉升副高職稱。制定了H7亞型HPAIV的RTPCR診斷規(guī)程，正擬申報(bào)國家規(guī)程。3、本研究培養(yǎng)了2名本科生完成兩篇本科畢業(yè)論文。五、經(jīng)費(fèi)使用情況（一）實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)：6000元包括反轉(zhuǎn)錄酶及RTPCR試劑和其它分子生物學(xué)試劑，試驗(yàn)動(dòng)物，SPF雞胚，試驗(yàn)消耗性器材等（二）科研業(yè)業(yè)務(wù)費(fèi)：1000元包括有關(guān)資料的收集和復(fù)印，以及論文的印制等（三）合計(jì)：7000元注：本課題向?qū)W校申請(qǐng)創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)1500元，其余均由獸醫(yī)學(xué)院禽病學(xué)教研室資助。六、申請(qǐng)人對(duì)該項(xiàng)目研究工作完成后的認(rèn)識(shí)總結(jié)通過本研究我們對(duì)于如何進(jìn)行科研選題、課題的設(shè)計(jì)以及基本科學(xué)素質(zhì)和態(tài)度都有了很深刻的認(rèn)識(shí)。進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)以及解決問題時(shí)，在尊重客觀事實(shí)的基礎(chǔ)上，應(yīng)該力求創(chuàng)新，尤其是技術(shù)創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)科學(xué)價(jià)值。本課題研究工作歷時(shí)一年，課題成員3人對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一無所知到有了較深的認(rèn)識(shí)，并且能夠較熟練地運(yùn)用。利用PCR高度敏感性、高度特異性、操作簡便、快速、使用樣品廣泛以及還可以同時(shí)進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)的特點(diǎn)建立各種病原的RTPCR檢測(cè)方法，可以廣泛地用于生產(chǎn)。七、指導(dǎo)教師對(duì)項(xiàng)目完成情況的意見該項(xiàng)目針對(duì)我國高致病性禽流感的巨大危害與潛在威脅，研發(fā)針對(duì)H7亞型HPAI的快速RTPCR診斷方法，具有重大的戰(zhàn)略儲(chǔ)備意義。幾位研究成員刻苦鉆研，已較好地建立了H7亞型HPAI的RTPCR診斷方法，并完成了條件優(yōu)化，初步應(yīng)用表明該方法具有特異、敏感、快速等的優(yōu)點(diǎn)。簽字：年月日八、項(xiàng)目所在單位專家評(píng)審意見簽字：