DB13DB13/T1567—2012葡萄品種DNA指紋鑒定方法2012-07-03發(fā)布2012-07-15實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1葡萄全基因組測(cè)序已經(jīng)完成。不同葡萄品種由于遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異，這種差異可經(jīng)過PCR擴(kuò)增、電泳分離、顯色程序繪制的DNA指紋圖譜加以區(qū)分，從而對(duì)不同品種進(jìn)行鑒定。從葡萄幼苗、葉片等組織中提取總DNA，利用SSR引物對(duì)位于不同染色體上的SSR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同堿基長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（或通過DNA分析儀、測(cè)），4溶液配制5.1樣品準(zhǔn)備5.1.1取樣量每份送檢樣品至少檢測(cè)3個(gè)個(gè)體，對(duì)一致性差的樣品應(yīng)增加檢測(cè)個(gè)5.1.2品種比較方式成對(duì)品種的比較:送檢樣品提供兩份，一份為待檢品種，一份為對(duì)照品種。將待檢品種與對(duì)照品種品種與DNA指紋庫入庫品種的比較:送檢樣品可提供一份。將待檢樣品2采用改良的CTAB法。取200mg干凈葉片置入1.5mL離心管中，加入500μLDNA提取液研磨碎，并洗滌液及30μLβ-巰基乙醇，充分搖勻后置冰上5min，于4℃,12000g離心8min后，洗滌一次，棄上清，再加700μL預(yù)熱的CTAB緩沖液,充分混勻后，于65℃水浴60min，其5.3.2反應(yīng)體系反應(yīng)液體積為20μL，組分配制應(yīng)符合表1的規(guī)定或按比例減少至10225mmol/L2.5mmol/L22.5mmol/L0.15mmol/L20μmol/L0.25DNA15.3.3反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保5.4.1清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95%乙醇擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂上0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作5.4.2組裝電泳板5.4.3灌膠35.4.4預(yù)電泳在正極槽中加入1×TBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的I×TBE緩沖液600mL，拔5.4.5變性在20μLPCR樣品中加入4μL6×加樣緩沖液，混勻后，在6結(jié)果及判定譜帶記錄方式:每個(gè)核心引物的所有譜帶按擴(kuò)增片段02………)，并確定代表每條譜帶的一套標(biāo)準(zhǔn)品種。每個(gè)待測(cè)品種在每個(gè)引物位點(diǎn)上的譜帶號(hào)用四位代示例1：在一個(gè)核心引物上僅有一條譜帶02，品示例2：在一個(gè)核心引物上有兩條譜帶02和03，品種在該引物位點(diǎn)的4c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同5儀器設(shè)備試劑A.1儀器設(shè)備A.1.5膠片觀察燈。A.1.7微量加樣器。A.1.8磁力攪拌器。A.1.9高速離心機(jī)。A.1.10微量紫外分光光度計(jì)。A.1.11高壓滅菌鍋。A.2試劑6A.2.10A.2.11A.2.12A.2.13A.2.14A.2.15A.2.16A.2.17A.2.18A.2.19A.2.20A.2.21A.2.22A.2.23A.2.247CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巰基乙醇(注：先將除巰基乙醇之外的藥品配好，高壓蒸汽滅菌之后B.1.5酚/氯仿/異戊醇：25：24：1。B.1.6TE緩沖液1:lmol/LTris-HC15mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCI調(diào)pH至8.0，定容至B.1.7TE緩沖液2:lmol/LTris-HC15rnL，0.5moB.1.85mol/LNaCI溶液:146g固體NaCI溶于水中，加水定容至B.2.1dNTP:用超純水分別配制A、G、C、T終濃度100mmol/L的儲(chǔ)存液。各取20μL720μL定容至終濃度2.5mmol/Leach的工作液。也可直接購(gòu)買濃度2.5mmol/LB.2.2SSR引物：用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均40μmol/L的儲(chǔ)存液，等體B.3.140%PAGE膠:丙烯酞胺190g和甲叉雙丙烯酚胺10g,定容至5B.3.3Bind緩沖液:49.75mL無水8B.3.4親和硅烷工作液:在1mLBind緩沖液中加入5μLBindB.3.625%過硫酸銨溶液:0.25g過硫酸銨溶于1B.3.710×TBE緩沖液:Tris堿108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至10B.4.2染色液：2g硝酸銀，加水定容至1009C.1基本核心引物名單見表C.1。1I2I3I4I5IVChr6a6IVChr7b7IVChr8a8IVChr9a9IVChr10bIIVChr12aIVChr13aIVChr14bIVChr15aIVChr16bIVChr17cIVChr18aIVChr19aIVVIp601VVIb012VVMD283VVMD324VVMD275VVMD216VVMD778VVIq529VVMD25VMC4f3VVIh54VVMD24VVMD5VVIn73VVIn16VVIp3