微生物檢驗技術(shù)分析目錄TOC\o"1-3"\h\u21212微生物檢驗技術(shù)分析 -1-314921.1細(xì)菌涂片檢查 -1-183821.2細(xì)菌的培養(yǎng) -1-105871.3細(xì)菌生化反應(yīng) -2-97041.4細(xì)菌檢驗的全自動化技術(shù) -3-86621.5藥敏鑒定技術(shù) -3-65891.6微生物檢驗發(fā)展趨勢 -4-1.1細(xì)菌涂片檢查細(xì)菌涂片檢查是微生物檢驗技術(shù)中最常用的檢測方法之一，其原理主要是利用顯微鏡對涂片中細(xì)菌的形態(tài)，大小，結(jié)構(gòu)，染色特性等進行觀察，分析。主要細(xì)菌涂片的染色法有革蘭染色法、抗酸染色法。革蘭染色法：包括初染、媒染、褪色、復(fù)染四個步驟。具體操作方法是：（1）涂片固定。先把涂片放在酒精燈上火烤固定（2）龍膽紫染10秒。（3）流動自來水沖洗，甩凈水滴。（4）加碘液覆蓋涂面染約10秒（5）水洗，甩掉水滴（6）滴加脫色液，靜置10秒后，沖洗，甩掉水滴。（7）沙黃染色液(稀)染10秒鐘后，流動水清洗。（8）放在安全柜出風(fēng)口干燥，鏡檢。清洗時要注意水流不可以對準(zhǔn)標(biāo)本沖洗，要對著標(biāo)本上方?jīng)_洗，防止沖掉標(biāo)本的涂片?？顾崛旧ǎ阂话惆ǔ跞?、脫色、復(fù)染。（1）初染：用鑷子涂片標(biāo)本，放在酒精燈火焰上加熱，固定涂片，然后滴加石碳酸復(fù)紅，等待10分鐘，用流動自來水沖洗涂片，沖洗后，甩干水滴。（2）脫色：抗酸乙醇脫色液進行脫色2到3分鐘；用水沖洗，甩干水滴。（3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染4分鐘，流動水沖洗，甩干后，放在通風(fēng)口出吹干，然后進行鏡下觀察。清洗時也要注意，應(yīng)和革蘭染色沖洗方式一致。1.2細(xì)菌的培養(yǎng)通過對細(xì)菌在血平板上的生長狀況判斷：菌落表面光滑、濕潤、黏稠、像水珠似的是黏液型菌落例如肺炎克雷伯；菌落在生長繁殖后會散發(fā)特殊的味道例如銅綠假單胞菌會發(fā)出生姜味，白假絲酵母菌發(fā)出酵母味[3]。不同的標(biāo)本類型選用的培養(yǎng)基不同。（1）白帶培養(yǎng)（5項)：CT（衣原體）,UU（解脲支原體）、MH（人型支原體）、淋病板、沙保弱平板，CT陰陽性的結(jié)果寫在單子上。（2）白帶B群鏈球菌：血平板。淋球菌培養(yǎng)：淋病板。（3）中段尿系列培養(yǎng)：CT、UU、血平板（10ul)。中段尿培養(yǎng):血平板（10ul）。（4）大便致病菌培養(yǎng)：SS瓊脂培養(yǎng)基、XLD（木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽）培養(yǎng)基、血平板。（5）霍亂弧菌/副溶血弧菌：TCBS（硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖）平板。（6）痰培養(yǎng)咽拭子：血平板、巧克力平板，必要時加MAC平板。先接種平板后涂片：抗酸染色涂兩張片子。（7）腦脊液：3000rpm，10min，離心去上清，血平板+巧克力平板。細(xì)菌涂片：沉渣革蘭染色或墨汁負(fù)染。分泌物/穿刺液：血平板。（8）胸腹水培養(yǎng)：3000rpm，10min。離心去上清，血平板；若血性，可直接劃板。（9）靜脈置管：半定量培養(yǎng)，5cm長的靜脈置管在血平板上滾動4次。（10）真菌培養(yǎng)：沙保弱平板、念珠菌顯色培養(yǎng)基。（11）血培養(yǎng)報陽：找出原始單，注明陽性報警。若僅需氧瓶報警，接種血平板、巧克力平板,然后涂片革蘭染色法染色；厭氧瓶報警：接種2塊血平板和2塊巧克力平板，其中1塊血平板和1塊巧克力平板在1區(qū)與2區(qū)交界處無菌貼甲硝唑藥敏紙片,然后放入?yún)捬醮蛘邊捬豕拗衃4]。（12）肺泡灌洗液：定量培養(yǎng)，吸10ul接種血平板。（13）胸腹水/尿抗酸染色：3000rpm,10min,離心去上清,涂2張片子。1.3細(xì)菌生化反應(yīng)根據(jù)細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物具有多種不同的生化反應(yīng)來確定細(xì)菌。這種方法稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)[5]。（1）糖類代謝實驗：葡萄糖發(fā)酵實驗、葡萄糖氧化實驗、七葉苷水解實驗、甲基紅實驗、V-P實驗（2）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實驗：靛基質(zhì)實驗、尿素酶實驗、硫化氫實驗（3）復(fù)合生化實驗：動力靛基質(zhì)尿素酶實驗（MIU）、克氏雙糖鐵實驗（KIA）（4）酶類實驗：過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、氧化酶實驗1.4細(xì)菌檢驗的全自動化技術(shù)全自動化技術(shù)有全自動血液培養(yǎng)檢測系統(tǒng)、全自動質(zhì)譜分析儀、全自動藥敏分析系統(tǒng)。全自動質(zhì)譜分析儀工作原理：全自動質(zhì)譜儀分為MALDI和TOF兩部分。MALDI的原理是制造由樣品和激光基底形成的共晶膜?；|(zhì)從激光吸收能量并將其傳遞給生物分子。在產(chǎn)生離子的過程中，質(zhì)子移動到生物分子上或通過生物分子獲得，然后使生物分子溶解電離。TOF的原理是粒子在電場的作用下通過飛行管加速，而m/z值和接收到的信號是到達(dá)檢測器的時間和離子數(shù)的目標(biāo)。相應(yīng)的質(zhì)量分析。通過將計算機獲得的水平與數(shù)據(jù)庫中的參考光譜進行比較，可以獲得最接近的應(yīng)變，最終確定的結(jié)果是根據(jù)同源距離給出相應(yīng)的鑒定分?jǐn)?shù)[6]。1.5藥敏鑒定技術(shù)抗菌藥敏試驗是指測量藥物在體外抑制或殺死細(xì)菌的能力的試驗。常用的方法有紙片擴散法、稀釋法、E-test法[7]。（1）稀釋法：是定量的抗菌藥敏試驗的方法，肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。基本原理是觀察不同濃度藥物對不同細(xì)菌的抑菌情況，可定量測定抗菌藥物對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。此方法的不足是所含的抗菌藥物不一定滿足實驗室的具體要求。（2）E-test法：是一種抗菌藥物濃度梯度稀釋法直接測量MIC的藥敏試驗。見圖1.1試驗方法：將藥敏試紙條放在已經(jīng)涂好菌液的M-H瓊脂平板上，有試紙刻度的一面朝上，藥物最高濃度的一端靠著平板邊緣，放在35℃的培養(yǎng)箱中，等待第二天的測量。在培養(yǎng)的測試條周圍形成一個橢圓形的抑制區(qū)。讀取試紙與抑制區(qū)相交的標(biāo)度。此時的標(biāo)度是測試結(jié)果和抗菌藥物對細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）。（3）紙片擴散法（K-B法）：是藥敏試驗的最基本方法，目前廣泛應(yīng)用。見圖1.2測試方法：eq\o\ac(○,1)、用無菌棉簽將準(zhǔn)備好的細(xì)菌溶液浸濕，將多余的細(xì)菌菌液在管壁上擠出，并用棉簽涂勻M-H瓊脂平板，每個平板涂3次，每次60度旋轉(zhuǎn)，最后沿平板外圍涂抹一圈。最后合上蓋子。eq\o\ac(○,2)、使用無菌鑷子將藥片劑緊貼在培養(yǎng)基里面。每張紙片之間的距離應(yīng)大于24mm，并且與培養(yǎng)基的內(nèi)邊緣的距離應(yīng)大于15mm。放在35℃的培養(yǎng)箱中，等待第二天的測量。eq\o\ac(○,3)、用游標(biāo)卡尺測量抑菌區(qū)的直徑。抑菌區(qū)的邊界由看不見細(xì)菌的生長所決定的，其結(jié)果可以分為敏感、中介、耐藥。圖1.1為E-test法的藥敏試驗圖1.2為紙片擴散法的藥敏試驗1.6微生物檢驗發(fā)展趨勢隨著時代的快速發(fā)展，微生物學(xué)檢驗技術(shù)也向著快速化、自動化、信息化及微量化的發(fā)展趨勢邁進。熒光免疫技術(shù)、酶免疫分析技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用發(fā)展，使的微生物檢驗技術(shù)具