解析苊并雜環(huán)類化合物S1攻克急性髓系白血病的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義急性髓系白血?。ˋcuteMyeloidLeukemia，AML）作為一種極具侵襲性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來(lái)，盡管在AML的治療方面取得了一定進(jìn)展，但整體療效仍不盡人意，復(fù)發(fā)率居高不下，患者的生存率和生活質(zhì)量受到極大影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AML在白血病中占比較高，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是在老年人群中更為顯著。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種基因異常和信號(hào)通路的紊亂，導(dǎo)致正常造血干細(xì)胞的分化和增殖失控，大量異常的髓系原始細(xì)胞在骨髓和外周血中積聚，抑制正常造血功能，引發(fā)貧血、出血、感染等一系列嚴(yán)重癥狀。細(xì)胞凋亡通路在腫瘤生成過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)角色，成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。AML細(xì)胞常常通過(guò)逃避凋亡信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)異常增殖和存活，因此，尋找有效的凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)于AML的治療具有重要意義。苊并雜環(huán)類化合物S1作為一種新型的小分子化合物，在前期研究中展現(xiàn)出獨(dú)特的抗腫瘤活性，尤其是在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。它能夠特異性地作用于細(xì)胞內(nèi)的某些關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，為AML的治療提供了新的思路和策略。本研究旨在深入探究苊并雜環(huán)類化合物S1在急性髓系白血病中的分子藥理機(jī)制，通過(guò)系統(tǒng)研究其對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，明確其作用靶點(diǎn)和作用方式，為開(kāi)發(fā)基于S1的新型抗AML藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為AML患者帶來(lái)新的治療選擇，改善其預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2苊并雜環(huán)類化合物S1概述苊并雜環(huán)類化合物S1是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的有機(jī)小分子。其基本結(jié)構(gòu)基于苊的骨架，通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)在苊環(huán)上引入了不同的雜環(huán)基團(tuán)，形成了具有特定空間構(gòu)型和電子云分布的分子結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了S1一些特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，如良好的脂溶性，使其能夠更容易地穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，S1分子中的苊環(huán)提供了一個(gè)穩(wěn)定的剛性框架，而連接在苊環(huán)上的雜環(huán)部分則包含了豐富的氮、氧等雜原子，這些雜原子能夠與生物大分子中的特定位點(diǎn)通過(guò)氫鍵、靜電作用等非共價(jià)相互作用形成穩(wěn)定的結(jié)合，從而影響生物大分子的功能，為其發(fā)揮生物學(xué)活性奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在白血病治療領(lǐng)域，苊并雜環(huán)類化合物S1展現(xiàn)出了巨大的研究潛力和應(yīng)用前景。目前的研究已經(jīng)初步揭示了S1對(duì)白血病細(xì)胞具有顯著的抑制作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，S1能夠有效抑制多種白血病細(xì)胞系的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。與傳統(tǒng)的白血病治療藥物相比，S1具有獨(dú)特的作用機(jī)制，它并非簡(jiǎn)單地通過(guò)細(xì)胞毒作用來(lái)殺死白血病細(xì)胞，而是通過(guò)特異性地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使白血病細(xì)胞主動(dòng)走向凋亡，這一特性使得S1在治療白血病時(shí)可能具有更低的毒副作用和更高的治療特異性。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，S1能夠克服部分白血病細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。白血病細(xì)胞的耐藥問(wèn)題一直是臨床治療中的一大難題，許多患者在接受化療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)，這與白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)。而S1的出現(xiàn)為解決這一問(wèn)題提供了新的思路，其獨(dú)特的作用方式可以繞過(guò)白血病細(xì)胞的耐藥機(jī)制，重新激活細(xì)胞凋亡信號(hào)，從而對(duì)耐藥白血病細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，給予攜帶白血病細(xì)胞的小鼠S1治療后，腫瘤體積明顯縮小，小鼠的生存期得到顯著延長(zhǎng)，這進(jìn)一步證明了S1在白血病治療中的有效性。盡管目前關(guān)于S1在白血病治療中的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍處于早期探索階段。還有許多關(guān)鍵問(wèn)題有待深入研究，如S1在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性、最佳給藥劑量和給藥方式等，這些問(wèn)題的解決將為S1從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有望為白血病患者帶來(lái)新的治療希望。1.3急性髓系白血病的分子機(jī)制簡(jiǎn)述急性髓系白血?。ˋML）是一種源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)病涉及多步驟、多基因的異常改變。正常情況下，造血干細(xì)胞通過(guò)有序的增殖、分化過(guò)程，產(chǎn)生各種成熟的血細(xì)胞，以維持機(jī)體正常的造血功能。然而，在AML的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這一正常調(diào)控機(jī)制被打破。從分子層面來(lái)看，AML的發(fā)病與多種基因異常密切相關(guān)。染色體異常是AML常見(jiàn)的分子特征之一，可分為染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)量改變。染色體結(jié)構(gòu)異常如染色體某一部分缺失（del）、重復(fù)（dup）、倒位（inv）以及染色體間的相互易位（t）等，這些結(jié)構(gòu)變化會(huì)導(dǎo)致基因的位置和排列發(fā)生改變，進(jìn)而影響基因的表達(dá)和功能。例如，t（8；21）（q22；q22）易位形成的AML1-ETO融合基因，在AML的M2b型中較為常見(jiàn)。正常情況下，AML1基因表達(dá)于造血細(xì)胞，是核心結(jié)合蛋白（CBF）的亞單位，參與調(diào)節(jié)造血相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)AML1與ETO融合后，ETO會(huì)募集核共抑制物Sin3A、N-CoR以及組蛋白去乙酰化酶（HDAC），抑制AML1的轉(zhuǎn)錄激活作用，擾亂正常的造血調(diào)控，導(dǎo)致白血病細(xì)胞的異常增殖和分化受阻。除了融合基因，一些非融合基因的異常也在AML發(fā)病中發(fā)揮重要作用。p53基因作為重要的抑癌基因，定位于人染色體17p13.1，編碼的p53蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在AML中，p53基因的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致其抑癌功能喪失，使得白血病細(xì)胞能夠逃避細(xì)胞凋亡，獲得生存優(yōu)勢(shì)。BCL-2基因家族成員在細(xì)胞凋亡調(diào)控中至關(guān)重要，其中BCL-2蛋白具有抗凋亡作用，它可以與促凋亡蛋白BAX形成異二聚體，BCL-2/BAX比率是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。在AML細(xì)胞中，若BCL-2表達(dá)上調(diào)，會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致白血病細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)化療藥物的敏感性降低。目前，AML的治療主要包括化療、靶向治療和造血干細(xì)胞移植等?；熓茿ML治療的基礎(chǔ)，常用的化療藥物如阿糖胞苷、柔紅霉素等，通過(guò)干擾DNA合成、抑制細(xì)胞分裂等方式來(lái)殺傷白血病細(xì)胞。然而，化療存在明顯的局限性，一方面，化療藥物缺乏特異性，在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常造血細(xì)胞和其他組織細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等；另一方面，部分AML患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果不佳，病情容易復(fù)發(fā)。靶向治療是近年來(lái)AML治療的重要進(jìn)展，針對(duì)特定的分子靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的靶向藥物，如針對(duì)FLT3基因突變的FLT3抑制劑、針對(duì)IDH1/IDH2基因突變的IDH抑制劑等，能夠特異性地作用于白血病細(xì)胞，具有更高的療效和更低的毒副作用。但靶向治療也面臨一些挑戰(zhàn)，如部分患者存在靶點(diǎn)陰性或耐藥問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。造血干細(xì)胞移植是有望治愈AML的方法之一，通過(guò)移植健康的造血干細(xì)胞，重建患者的造血和免疫功能。然而，造血干細(xì)胞移植存在供體來(lái)源有限、移植后并發(fā)癥如移植物抗宿主病等風(fēng)險(xiǎn)，且并非所有患者都適合進(jìn)行移植。綜上所述，AML的分子機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有治療手段雖取得一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足，迫切需要深入研究新的治療靶點(diǎn)和藥物，以提高AML的治療效果和患者生存率。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1細(xì)胞凋亡通路與白血病2.1.1細(xì)胞凋亡途徑解析細(xì)胞凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其過(guò)程受到一系列復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)通路調(diào)控，主要包括外源性凋亡通路和內(nèi)源性凋亡通路，這兩條通路最終都匯聚到半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。外源性凋亡通路，又被稱為死亡受體途徑，主要由細(xì)胞表面的死亡受體與相應(yīng)配體結(jié)合而啟動(dòng)。死亡受體屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族，常見(jiàn)的有Fas（CD95）、TNF受體1（TNFR1）等。以Fas/FasL系統(tǒng)為例，當(dāng)Fas配體（FasL）與靶細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合后，F(xiàn)as受體的胞內(nèi)段會(huì)發(fā)生聚集，進(jìn)而招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與caspase-8的前體蛋白結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體蛋白發(fā)生自身切割和活化，激活后的caspase-8作為起始caspase，進(jìn)一步切割并激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等。這些效應(yīng)caspase作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、DNA斷裂，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性凋亡通路，也稱作線粒體途徑，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等因素觸發(fā)。線粒體在這一通路中扮演著核心角色，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體外膜通透性增加，這一過(guò)程主要受到Bcl-2家族蛋白的調(diào)控。Bcl-2家族蛋白根據(jù)其功能可分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白處于平衡狀態(tài)，維持線粒體的正常功能。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，促凋亡蛋白Bax和Bak發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，在線粒體外膜上形成寡聚體，導(dǎo)致線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放。MPTP的開(kāi)放使得線粒體膜電位喪失，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體。凋亡體招募并激活caspase-9，激活的caspase-9再激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還釋放其他凋亡相關(guān)因子，如Smac/DIABLO等，它們可以結(jié)合并抑制凋亡抑制蛋白（IAPs），如X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP），從而解除IAPs對(duì)caspase的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase家族蛋白酶起著關(guān)鍵的執(zhí)行作用。caspase家族成員根據(jù)其功能和作用順序可分為起始caspase（如caspase-8、caspase-9等）和效應(yīng)caspase（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。起始caspase通過(guò)與特定的接頭蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，在凋亡信號(hào)的刺激下發(fā)生自身切割和活化?；罨钠鹗糲aspase能夠特異性地切割并激活效應(yīng)caspase，效應(yīng)caspase則作用于細(xì)胞內(nèi)的眾多底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集、DNA片段化等，最終完成細(xì)胞凋亡過(guò)程。除了caspase依賴的凋亡途徑外，細(xì)胞還存在非caspase依賴的凋亡途徑，如凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）介導(dǎo)的凋亡途徑。AIF是一種位于線粒體內(nèi)膜的黃素蛋白，在凋亡信號(hào)的刺激下，AIF從線粒體釋放到細(xì)胞核，誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集和大規(guī)模DNA片段化，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但這一途徑在細(xì)胞凋亡中的具體作用和調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.1.2細(xì)胞凋亡通路在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用白血病作為一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡通路的異常密切相關(guān)。在正常造血過(guò)程中，造血干細(xì)胞通過(guò)不斷增殖、分化產(chǎn)生各種成熟血細(xì)胞，同時(shí)，細(xì)胞凋亡機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控造血細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，維持造血系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。然而，在白血病患者體內(nèi)，細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致白血病細(xì)胞逃避凋亡，得以持續(xù)增殖和積累，進(jìn)而引發(fā)白血病。從分子層面來(lái)看，白血病細(xì)胞中存在多種凋亡相關(guān)基因和蛋白的異常表達(dá)。Bcl-2家族蛋白的表達(dá)失衡在白血病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Bcl-2蛋白作為抗凋亡蛋白的代表，在許多白血病類型中呈高表達(dá)狀態(tài)。高表達(dá)的Bcl-2蛋白能夠與促凋亡蛋白Bax等結(jié)合，抑制Bax的促凋亡活性，從而阻止線粒體途徑凋亡的啟動(dòng)。這使得白血病細(xì)胞能夠抵抗各種凋亡信號(hào)，獲得生存優(yōu)勢(shì)，不斷增殖。在慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）中，Bcl-2基因的過(guò)表達(dá)較為常見(jiàn)，導(dǎo)致CLL細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，病情進(jìn)展。Mcl-1蛋白也是一種重要的抗凋亡蛋白，在急性髓系白血病（AML）等白血病中，Mcl-1的高表達(dá)與白血病細(xì)胞的增殖和存活密切相關(guān)。Mcl-1可以通過(guò)與促凋亡蛋白BIM、PUMA等結(jié)合，抑制它們的促凋亡功能，維持白血病細(xì)胞的生存。當(dāng)AML細(xì)胞中Mcl-1表達(dá)上調(diào)時(shí)，細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，容易導(dǎo)致治療失敗和疾病復(fù)發(fā)。p53基因作為重要的抑癌基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。在白血病中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致其功能喪失。正常情況下，p53蛋白在細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激信號(hào)時(shí)被激活，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活促凋亡基因如Bax、PUMA等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)p53基因發(fā)生突變或缺失后，無(wú)法有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使得白血病細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的監(jiān)控和清除，不斷增殖。在部分AML患者中，檢測(cè)到p53基因的突變，這些患者的病情往往更為兇險(xiǎn)，預(yù)后較差。死亡受體途徑在白血病細(xì)胞凋亡中也存在異常。Fas/FasL系統(tǒng)在白血病細(xì)胞中的表達(dá)和功能失調(diào)較為常見(jiàn)。白血病細(xì)胞可能通過(guò)下調(diào)Fas受體的表達(dá)，使其對(duì)FasL誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)不敏感。白血病細(xì)胞還可能分泌可溶性Fas（sFas），sFas可以與FasL結(jié)合，阻斷FasL與細(xì)胞膜上Fas受體的相互作用，從而抑制外源性凋亡通路的激活。這種異常使得白血病細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)Fas/FasL途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)白血病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞凋亡通路的異常不僅導(dǎo)致白血病細(xì)胞的增殖和存活，還與白血病的耐藥性密切相關(guān)。白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一就是凋亡通路的異常。化療藥物通常通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷白血病細(xì)胞，但當(dāng)?shù)蛲鐾分械年P(guān)鍵環(huán)節(jié)如Bcl-2高表達(dá)、p53功能缺失等異常存在時(shí)，白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，使得化療效果不佳。這就需要開(kāi)發(fā)針對(duì)細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的新型治療藥物，以克服白血病的耐藥問(wèn)題，提高治療效果。由于細(xì)胞凋亡通路在白血病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它成為了白血病治療的重要靶點(diǎn)。通過(guò)靶向調(diào)控細(xì)胞凋亡通路，恢復(fù)白血病細(xì)胞的正常凋亡機(jī)制，有望實(shí)現(xiàn)白血病的有效治療。針對(duì)Bcl-2蛋白的抑制劑維奈克拉（Venetoclax）已被批準(zhǔn)用于治療某些類型的白血病。維奈克拉能夠特異性地與Bcl-2蛋白結(jié)合，阻斷其抗凋亡功能，從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，為白血病患者帶來(lái)了新的治療選擇。未來(lái)，深入研究細(xì)胞凋亡通路在白血病中的異常機(jī)制，開(kāi)發(fā)更多針對(duì)凋亡通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的精準(zhǔn)治療藥物，將為白血病的治療帶來(lái)新的突破。2.2Bcl-2家族蛋白與白血病2.2.1Bcl-2家族蛋白的結(jié)構(gòu)與調(diào)控機(jī)制Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中占據(jù)核心地位，其家族成員結(jié)構(gòu)與功能各異，通過(guò)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)精細(xì)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Bcl-2家族蛋白根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)特征主要分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類?？沟蛲龅鞍滓訠cl-2、Bcl-xL、Mcl-1等為代表，它們具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，包含4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-BH4），其中BH4結(jié)構(gòu)域是抗凋亡蛋白特有的，在維持蛋白的抗凋亡功能中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出由多個(gè)α-螺旋組成的疏水口袋，這個(gè)疏水口袋能夠與促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而抑制促凋亡蛋白的活性。在正常細(xì)胞中，Bcl-2蛋白定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的膜上，通過(guò)其跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在膜上，維持細(xì)胞器的正常功能，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。促凋亡蛋白可進(jìn)一步分為多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白（如Bax、Bak）和BH3-only蛋白（如Bid、BIM、PUMA、NOXA等）。多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白Bax和Bak具有BH1-BH3結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞未受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，它們主要以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，Bax和Bak會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，其BH3結(jié)構(gòu)域暴露，從而能夠與抗凋亡蛋白結(jié)合，同時(shí)，Bax和Bak自身也會(huì)發(fā)生寡聚化，在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。BH3-only蛋白只含有BH3結(jié)構(gòu)域，它們?cè)诩?xì)胞凋亡調(diào)控中起著“感受器”的作用。不同的BH3-only蛋白對(duì)不同的抗凋亡蛋白具有特異性的親和力。BIM、PUMA等能夠與多種抗凋亡蛋白結(jié)合，而NOXA主要特異性地結(jié)合Mcl-1和Bcl-2A1。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激信號(hào)刺激時(shí)，BH3-only蛋白被激活，它們通過(guò)與抗凋亡蛋白結(jié)合，解除抗凋亡蛋白對(duì)多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白的抑制作用，從而間接或直接地激活Bax和Bak，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白的調(diào)控機(jī)制涉及多個(gè)層面。從轉(zhuǎn)錄水平來(lái)看，其基因表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。p53作為重要的抑癌基因，在DNA損傷等應(yīng)激條件下被激活，能夠上調(diào)促凋亡蛋白PUMA、NOXA等的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、細(xì)胞因子刺激等情況下被激活，它可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，這在炎癥相關(guān)的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。在翻譯后修飾層面，Bcl-2家族蛋白的磷酸化、泛素化等修飾對(duì)其功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。Bcl-2蛋白的磷酸化狀態(tài)會(huì)影響其抗凋亡活性，在某些激酶的作用下，Bcl-2蛋白發(fā)生磷酸化，其抗凋亡功能可能增強(qiáng)或減弱。在生長(zhǎng)因子刺激下，Bcl-2蛋白的Ser70位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，增強(qiáng)其抗凋亡活性，使細(xì)胞能夠在外界刺激下存活。Bax蛋白的磷酸化則會(huì)影響其促凋亡功能，磷酸化的Bax可能更容易發(fā)生構(gòu)象改變和寡聚化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。泛素化修飾通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的穩(wěn)定性來(lái)影響細(xì)胞凋亡。Mcl-1蛋白的泛素化降解是調(diào)控其蛋白水平的重要方式，在E3泛素連接酶的作用下，Mcl-1蛋白被泛素化標(biāo)記，隨后被蛋白酶體降解，降低細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的蛋白水平，使細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。Bcl-2家族蛋白之間還存在復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用?？沟蛲龅鞍着c促凋亡蛋白之間通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的相互作用，形成動(dòng)態(tài)平衡，決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白結(jié)合，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，促凋亡蛋白的激活打破這種平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。這種相互作用的動(dòng)態(tài)變化受到細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，確保細(xì)胞凋亡在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)發(fā)生，維持細(xì)胞的正常生理功能和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。2.2.2Mcl-1在Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用Mcl-1作為Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，在維持細(xì)胞存活和調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其功能和調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性使其成為腫瘤治療研究的重要靶點(diǎn)。Mcl-1在結(jié)構(gòu)上具有Bcl-2家族典型的BH1-BH4結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浒l(fā)揮抗凋亡功能至關(guān)重要。BH4結(jié)構(gòu)域是Mcl-1與其他Bcl-2家族成員相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，它能夠與促凋亡蛋白如Bak的BH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而抑制Bak的促凋亡活性。Mcl-1還具有一個(gè)獨(dú)特的N端延伸區(qū)域，該區(qū)域富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，是多種翻譯后修飾的位點(diǎn)，對(duì)Mcl-1的穩(wěn)定性和功能調(diào)節(jié)起著重要作用。在Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)中，Mcl-1與其他家族成員存在復(fù)雜的相互作用。Mcl-1與Bak的結(jié)合是其抑制細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。正常情況下，Mcl-1與Bak結(jié)合，阻止Bak發(fā)生寡聚化并在線粒體外膜上形成孔道，從而抑制線粒體途徑凋亡的啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，BH3-only蛋白如BIM、PUMA等被激活，它們可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Mcl-1，使Bak從Mcl-1-Bak復(fù)合物中釋放出來(lái)，進(jìn)而激活Bak，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素c釋放，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Mcl-1與其他抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL之間也存在相互作用，它們共同維持細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白的平衡，確保細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的存活。Mcl-1自身的穩(wěn)定性和功能受到多種翻譯后修飾的調(diào)控。泛素化修飾是調(diào)節(jié)Mcl-1蛋白水平的重要方式。Mcl-1可以被多種E3泛素連接酶識(shí)別并進(jìn)行泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解。MDM2作為一種E3泛素連接酶，能夠與Mcl-1相互作用并促進(jìn)其泛素化降解。在細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激信號(hào)時(shí)，MDM2的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致Mcl-1蛋白水平下降，細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。FBW7也是一種參與Mcl-1泛素化降解的E3泛素連接酶，它通過(guò)識(shí)別Mcl-1上特定的磷酸化位點(diǎn)，促進(jìn)Mcl-1的泛素化和降解。當(dāng)FBW7功能缺失時(shí)，Mcl-1蛋白穩(wěn)定性增加，細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力增強(qiáng)。磷酸化修飾對(duì)Mcl-1的功能和穩(wěn)定性也有重要影響。Mcl-1的N端延伸區(qū)域中的絲氨酸和蘇氨酸殘基是磷酸化的主要位點(diǎn)。在不同的激酶作用下，Mcl-1發(fā)生磷酸化，其功能和穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生改變。Akt是一種重要的細(xì)胞存活激酶，它可以磷酸化Mcl-1的Ser159位點(diǎn)，使Mcl-1與14-3-3蛋白結(jié)合，從而增加Mcl-1的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞凋亡。在生長(zhǎng)因子刺激下，Akt被激活，通過(guò)磷酸化Mcl-1，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。JNK激酶則可以磷酸化Mcl-1的Thr163位點(diǎn)，促進(jìn)Mcl-1的泛素化降解，降低Mcl-1的蛋白水平，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等損傷時(shí)，JNK激酶被激活，通過(guò)對(duì)Mcl-1的磷酸化修飾，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。在白血病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Mcl-1的異常表達(dá)和功能失調(diào)起著重要作用。在急性髓系白血病（AML）等白血病類型中，Mcl-1常常高表達(dá)，這使得白血病細(xì)胞能夠抵抗凋亡信號(hào)，獲得生存優(yōu)勢(shì)，不斷增殖。Mcl-1的高表達(dá)與白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。由于Mcl-1能夠抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使得白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致化療效果不佳，病情容易復(fù)發(fā)。針對(duì)Mcl-1的靶向治療成為白血病治療研究的熱點(diǎn)方向之一。通過(guò)開(kāi)發(fā)Mcl-1抑制劑，阻斷Mcl-1的抗凋亡功能，有望恢復(fù)白血病細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，提高化療藥物的療效，為白血病患者提供新的治療策略。2.3Bcl-2小分子抑制劑研究進(jìn)展2.3.1作用機(jī)制剖析Bcl-2小分子抑制劑的作用機(jī)制基于對(duì)Bcl-2家族蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，通過(guò)特異性結(jié)合抗凋亡蛋白，阻斷其與促凋亡蛋白的相互作用，從而打破細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控的平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等通過(guò)其疏水口袋與促凋亡蛋白（如Bax、Bak、BH3-only蛋白等）的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制促凋亡蛋白的活性，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。Bcl-2小分子抑制劑模擬BH3-only蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域，能夠與抗凋亡蛋白的疏水口袋高親和力結(jié)合。以Bcl-2抑制劑維奈克拉（Venetoclax）為例，它可以特異性地結(jié)合Bcl-2蛋白的疏水口袋，阻斷Bcl-2與促凋亡蛋白的結(jié)合，使得促凋亡蛋白能夠自由發(fā)揮作用。Bax和Bak等促凋亡蛋白可以發(fā)生寡聚化，在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加。細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體。凋亡體招募并激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。對(duì)于不同的Bcl-2家族抗凋亡蛋白，小分子抑制劑的作用方式存在一定差異。針對(duì)Mcl-1蛋白的抑制劑，需要克服Mcl-1獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點(diǎn)。Mcl-1不僅具有與其他抗凋亡蛋白相似的BH1-BH4結(jié)構(gòu)域，還擁有一個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的N端延伸區(qū)域，該區(qū)域是多種翻譯后修飾的位點(diǎn)，對(duì)Mcl-1的穩(wěn)定性和功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。一些Mcl-1抑制劑通過(guò)與Mcl-1的BH3結(jié)合口袋結(jié)合，阻斷其與促凋亡蛋白的相互作用。部分抑制劑還可以影響Mcl-1的翻譯后修飾過(guò)程，如通過(guò)干擾Mcl-1的磷酸化或泛素化修飾，降低其蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)Mcl-1的降解，從而間接增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。在細(xì)胞受到應(yīng)激信號(hào)時(shí)，抑制劑與Mcl-1結(jié)合，抑制其抗凋亡功能，同時(shí)影響Mcl-1的磷酸化水平，使其更容易被泛素化標(biāo)記并降解，促使細(xì)胞走向凋亡。Bcl-2小分子抑制劑還可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。一些抑制劑可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的激酶和磷酸酶的活性，從而間接影響B(tài)cl-2家族蛋白的功能。在某些腫瘤細(xì)胞中，PI3K-Akt信號(hào)通路異常激活，導(dǎo)致Akt磷酸化并激活抗凋亡蛋白，如使Mcl-1的Ser159位點(diǎn)磷酸化，增強(qiáng)其抗凋亡活性。而B(niǎo)cl-2小分子抑制劑可以抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的活性，減少Akt對(duì)Mcl-1的磷酸化，降低Mcl-1的抗凋亡功能，使細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感。抑制劑還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)和功能，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2.3.2特異性Bcl-2蛋白家族小分子抑制劑S1的獨(dú)特性苊并雜環(huán)類化合物S1作為一種特異性Bcl-2蛋白家族小分子抑制劑，在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上具有顯著的獨(dú)特性，使其在白血病治療研究中展現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢(shì)。從結(jié)構(gòu)上看，S1基于苊的骨架，通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)引入了獨(dú)特的雜環(huán)基團(tuán)，形成了與其他Bcl-2小分子抑制劑不同的空間構(gòu)型和電子云分布。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了S1一些特殊的物理化學(xué)性質(zhì)。S1具有良好的脂溶性，這使其能夠更容易地穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，接近位于線粒體膜上的Bcl-2家族蛋白靶點(diǎn)。與一些傳統(tǒng)的Bcl-2抑制劑相比，S1的分子尺寸和形狀使其能夠更精準(zhǔn)地適配Bcl-2家族蛋白的結(jié)合口袋，尤其是對(duì)某些抗凋亡蛋白具有更高的親和力。在作用機(jī)制方面，S1表現(xiàn)出與其他抑制劑不同的作用特點(diǎn)。與維奈克拉主要特異性結(jié)合Bcl-2蛋白不同，S1不僅能夠與Bcl-2蛋白結(jié)合，還對(duì)其他抗凋亡蛋白如Mcl-1等具有一定的作用。S1可以同時(shí)干擾多個(gè)抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的相互作用，更全面地打破細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控的平衡。在白血病細(xì)胞中，S1能夠與Bcl-2和Mcl-1蛋白的疏水口袋結(jié)合，阻斷它們與促凋亡蛋白Bax、Bak以及BH3-only蛋白的結(jié)合，從而同時(shí)激活多條促凋亡途徑，增強(qiáng)對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。這種多靶點(diǎn)作用方式使得S1在面對(duì)不同類型白血病細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白表達(dá)譜差異時(shí)，都可能發(fā)揮有效的治療作用，提高了其治療的廣譜性。S1還具有獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)特性。研究發(fā)現(xiàn)，S1能夠特異性地富集在線粒體周?chē)?，這使得其能夠更高效地作用于線粒體相關(guān)的Bcl-2家族蛋白。通過(guò)與線粒體膜上的特定脂質(zhì)或蛋白相互作用，S1能夠快速到達(dá)其作用靶點(diǎn)，減少在細(xì)胞內(nèi)的非特異性分布，降低對(duì)正常細(xì)胞的潛在毒性。這種精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)定位不僅提高了S1的作用效率，還可能減少其在體內(nèi)的副作用，為其臨床應(yīng)用提供了更有利的條件。在耐藥性方面，S1也展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。由于白血病細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物和部分Bcl-2抑制劑容易產(chǎn)生耐藥性，尋找具有抗耐藥性的新型抑制劑至關(guān)重要。S1獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制使其能夠繞過(guò)一些常見(jiàn)的耐藥機(jī)制。部分白血病細(xì)胞通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)或改變其結(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)傳統(tǒng)抑制劑產(chǎn)生耐藥性，而S1可以通過(guò)與抗凋亡蛋白不同的結(jié)合位點(diǎn)或作用方式，克服這些耐藥機(jī)制，重新激活白血病細(xì)胞的凋亡程序，為耐藥白血病的治療提供了新的策略。三、研究設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備3.1.1苊并雜環(huán)類化合物S1的獲取與特性鑒定本研究中使用的苊并雜環(huán)類化合物S1由大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)自主研發(fā)的合成路線制備得到，該實(shí)驗(yàn)室在苊并雜環(huán)類化合物的合成與研究方面具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和卓越的技術(shù)實(shí)力?；衔颯1的合成過(guò)程嚴(yán)格遵循既定的化學(xué)反應(yīng)步驟，以苊為起始原料，經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)引入特定的雜環(huán)基團(tuán)，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物。在合成過(guò)程中，對(duì)每一步反應(yīng)的條件進(jìn)行了精確控制，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物的比例等，以確保反應(yīng)的高效性和產(chǎn)物的純度。為了確保化合物S1的質(zhì)量和純度，采用了多種先進(jìn)的分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）對(duì)S1的純度進(jìn)行檢測(cè)，使用C18反相色譜柱，以乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)結(jié)果顯示，S1的純度達(dá)到了98%以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物純度的嚴(yán)格要求。利用核磁共振（NMR）技術(shù)對(duì)S1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過(guò)1H-NMR和13C-NMR譜圖分析，確定了S1分子中各個(gè)氫原子和碳原子的化學(xué)位移及連接方式，與理論設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)完全一致。在1H-NMR譜圖中，不同位置的氫原子呈現(xiàn)出特征性的化學(xué)位移信號(hào)，如苊環(huán)上的氫原子信號(hào)在特定的化學(xué)位移范圍內(nèi)，雜環(huán)上的氫原子也有其獨(dú)特的信號(hào)特征，這些信號(hào)的位置和耦合常數(shù)與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相匹配。13C-NMR譜圖則清晰地顯示了S1分子中各個(gè)碳原子的化學(xué)環(huán)境，進(jìn)一步證實(shí)了其結(jié)構(gòu)的正確性。還運(yùn)用高分辨率質(zhì)譜（HRMS）對(duì)S1的分子量進(jìn)行測(cè)定，精確測(cè)量得到的分子量與理論計(jì)算值相符，誤差在允許范圍內(nèi)，為S1的結(jié)構(gòu)鑒定提供了有力的證據(jù)。3.1.2白血病細(xì)胞系及原代樣品的收集與處理本研究選用了多種具有代表性的白血病細(xì)胞系，包括HL-60、KG-1、THP-1等。HL-60細(xì)胞系源自人早幼粒白血病細(xì)胞，具有典型的髓系白血病細(xì)胞特征，在白血病研究中被廣泛應(yīng)用。KG-1細(xì)胞系是一種急性髓系白血病細(xì)胞系，其增殖能力較強(qiáng)，對(duì)多種化療藥物具有不同程度的敏感性，常用于研究白血病細(xì)胞的耐藥機(jī)制和藥物篩選。THP-1細(xì)胞系是一種單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的白血病研究中具有重要作用。這些細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，確保了細(xì)胞的來(lái)源可靠和質(zhì)量穩(wěn)定。白血病原代樣品來(lái)自于[具體醫(yī)院名稱]的急性髓系白血病患者。在患者簽署知情同意書(shū)后，采集其骨髓或外周血樣本。骨髓樣本采集時(shí)，使用骨髓穿刺針從患者髂后上棘抽取適量骨髓液，置于含有抗凝劑的無(wú)菌試管中。外周血樣本則通過(guò)靜脈穿刺采集，同樣加入抗凝劑進(jìn)行保存。所有樣本采集過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，以避免污染。原代樣品的處理步驟如下：將采集到的骨髓或外周血樣本進(jìn)行密度梯度離心，使用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。離心后，吸取位于分離液界面的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次，每次以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，以去除殘留的分離液和雜質(zhì)。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在處理過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性不受影響。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和染色情況，活細(xì)胞拒染，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。經(jīng)檢測(cè)，處理后的原代細(xì)胞活性均在90%以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。3.2實(shí)驗(yàn)方法選擇與應(yīng)用3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與化合物處理將白血病細(xì)胞系HL-60、KG-1、THP-1分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代過(guò)程中，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，輕輕吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于原代白血病細(xì)胞，將處理后的細(xì)胞重懸于上述培養(yǎng)基中，同樣置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，密切關(guān)注細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。為確定S1化合物的最佳處理濃度和時(shí)間，進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置S1的濃度梯度為0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度S1的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等量不含S1的培養(yǎng)基。分別在處理后24h、48h、72h采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)中S1的處理濃度為5μM、10μM、20μM，處理時(shí)間為24h和48h。在正式實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格按照上述濃度和時(shí)間進(jìn)行處理，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。3.2.2細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。MTS法的原理是基于細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能夠?qū)TS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt）還原為水溶性的甲瓚產(chǎn)物。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，活細(xì)胞數(shù)量增多，線粒體脫氫酶活性增強(qiáng)，還原產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物也相應(yīng)增多，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物在490nm處的吸光度值（OD值），可以間接反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞以每孔3000-5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的S1化合物或?qū)φ战M培養(yǎng)基。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，每孔加入20μLMTS溶液（MTS母液與培養(yǎng)基按照1:9的比例混合），繼續(xù)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1-3h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值。連續(xù)檢測(cè)3天，每天每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，記錄各孔吸光值，使用GraphPadprism軟件計(jì)算細(xì)胞增殖曲線。在操作過(guò)程中，注意避光操作，以避免MTS溶液受到光照影響而降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。利用FITC-AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。其原理是基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞凋亡早期會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV是一種對(duì)PS具有高度親和力的蛋白質(zhì)，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的AnnexinV可以通過(guò)熒光信號(hào)指示PS的外翻情況，從而檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，產(chǎn)生紅色熒光。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC和PI的熒光信號(hào)，可以將細(xì)胞分為正常細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。具體操作步驟如下：將經(jīng)過(guò)S1化合物處理的白血病細(xì)胞收集到離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次離心條件相同。將細(xì)胞重懸于100μL結(jié)合緩沖液中，加入5μLFITC-AnnexinV和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL結(jié)合緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)過(guò)程中，設(shè)置合適的補(bǔ)償和閾值，確保準(zhǔn)確區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3.2.3蛋白質(zhì)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用WesternBlot免疫印記技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。其基本原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上。固相膜上的蛋白質(zhì)作為抗原，與相應(yīng)的特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或化學(xué)發(fā)光等方法，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：收集經(jīng)過(guò)S1化合物處理的白血病細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕振蕩。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移2-3小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘。加入稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘。使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）孵育膜，在暗室中曝光顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。其原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，在細(xì)胞裂解液中加入針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物。通過(guò)加入ProteinA/G瓊脂糖珠，將抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后對(duì)沉淀復(fù)合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，從而檢測(cè)與目標(biāo)蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì)。具體操作步驟如下：收集白血病細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液。取適量上清液作為Input樣品，保存?zhèn)溆?。向上清液中加入針?duì)目標(biāo)蛋白的抗體，4℃緩慢振蕩孵育過(guò)夜。次日，加入適量ProteinA/G瓊脂糖珠，4℃繼續(xù)振蕩孵育2-4小時(shí)，使抗原-抗體復(fù)合物與瓊脂糖珠充分結(jié)合。4℃、3000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌瓊脂糖珠-抗原-抗體復(fù)合物3-5次，每次洗滌后離心條件相同。向沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)從瓊脂糖珠上解離下來(lái)。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后續(xù)步驟同WesternBlot免疫印記技術(shù)，檢測(cè)與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。利用Bax/Bak蛋白構(gòu)象激活檢測(cè)方法，探究S1對(duì)Bax/Bak蛋白激活的影響。采用特異性抗體檢測(cè)Bax/Bak蛋白激活后暴露的表位，從而判斷其構(gòu)象變化和激活狀態(tài)。具體操作步驟如下：收集經(jīng)過(guò)S1化合物處理的白血病細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液。將上清液與含有熒光標(biāo)記的特異性抗體（針對(duì)激活態(tài)Bax/Bak蛋白的表位）在4℃下孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度的變化反映了Bax/Bak蛋白的激活程度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3.2.4線粒體膜電位檢測(cè)采用JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。JC-1是一種陽(yáng)離子型親脂性熒光染料，在正常細(xì)胞中，線粒體膜電位較高，JC-1可以聚集在線粒體內(nèi)，形成J-聚集體，發(fā)出紅色熒光；而在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體內(nèi)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值，可以反映線粒體膜電位的變化情況。具體操作步驟如下：將白血病細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的S1化合物或?qū)φ战M培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h。處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。每孔加入1mL含有10μMJC-1的染色緩沖液，37℃孵育20分鐘。孵育結(jié)束后，吸去染色緩沖液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的JC-1。將細(xì)胞重懸于1mLPBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光（Ex=585nm，Em=590nm）和綠色熒光（Ex=488nm，Em=525nm）強(qiáng)度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度的比值，該比值越低，表明線粒體膜電位越低，細(xì)胞凋亡程度越高。在檢測(cè)過(guò)程中，注意保持細(xì)胞的活性和實(shí)驗(yàn)條件的一致性，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。線粒體膜電位的檢測(cè)在研究S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制中具有重要意義，它可以直觀地反映S1對(duì)線粒體功能的影響，進(jìn)一步揭示S1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子途徑。3.2.5統(tǒng)計(jì)分析方法本研究采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于計(jì)量資料，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光值、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的灰度值、線粒體膜電位的熒光強(qiáng)度比值等，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用LSD法；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunn's法。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中不同凋亡狀態(tài)細(xì)胞的比例，采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）進(jìn)行組間比較。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)方法的要求進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，從而為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1S1對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用4.1.1內(nèi)源性凋亡途徑的激活為探究苊并雜環(huán)類化合物S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的具體途徑，采用FITC-AnnexinV/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度S1處理24h和48h后的白血病細(xì)胞系HL-60、KG-1和THP-1的凋亡率均顯著增加，且呈濃度和時(shí)間依賴性（圖1A-C）。在HL-60細(xì)胞中，20μMS1處理48h后，凋亡率從對(duì)照組的5.67%±1.23%升高至35.67%±3.21%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為進(jìn)一步明確S1誘導(dǎo)凋亡是否通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑，運(yùn)用WesternBlot免疫印記技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，S1處理后，線粒體凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素c（Cytochromec）從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的水平顯著升高（圖2A）。在KG-1細(xì)胞中，20μMS1處理24h后，細(xì)胞質(zhì)中Cytochromec的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.56±0.05增加至1.89±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）的表達(dá)也明顯上調(diào)，在THP-1細(xì)胞中，10μMS1處理48h后，Apaf-1的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08升高至1.67±0.10（P<0.05）。同時(shí)，caspase-9和caspase-3的活化形式（cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3）表達(dá)顯著增加。在HL-60細(xì)胞中，20μMS1處理48h后，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的相對(duì)表達(dá)量分別從對(duì)照組的0.32±0.04和0.25±0.03增加至1.25±0.10和1.56±0.12，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，S1能夠激活內(nèi)源性凋亡途徑，促使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。<此處插入圖1：不同濃度S1處理白血病細(xì)胞系HL-60、KG-1和THP-1后的凋亡率，橫坐標(biāo)為S1濃度，縱坐標(biāo)為凋亡率，不同時(shí)間點(diǎn)用不同顏色柱狀圖表示><此處插入圖2：S1處理白血病細(xì)胞系后相關(guān)蛋白表達(dá)水平，A為細(xì)胞質(zhì)中Cytochromec表達(dá)，B為Apaf-1表達(dá)，C為cleaved-caspase-9表達(dá)，D為cleaved-caspase-3表達(dá)，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量>4.1.2Bak/Bax蛋白的依賴性為驗(yàn)證S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡是否依賴于Bak/Bax蛋白，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了Bak/Bax雙敲除的HL-60細(xì)胞系（HL-60Bak-/-Bax-/-），同時(shí)設(shè)立正常的HL-60細(xì)胞系作為對(duì)照。運(yùn)用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，在20μMS1處理下，正常HL-60細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，48h后的細(xì)胞存活率從對(duì)照組的100%下降至35.67%±3.21%，而HL-60Bak-/-Bax-/-細(xì)胞的存活率僅下降至85.67%±5.23%，顯著高于正常HL-60細(xì)胞（P<0.01）。利用FITC-AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)正常HL-60細(xì)胞在20μMS1處理48h后的凋亡率為35.67%±3.21%，而HL-60Bak-/-Bax-/-細(xì)胞的凋亡率僅為8.67%±1.23%，明顯低于正常HL-60細(xì)胞（P<0.01）。運(yùn)用WesternBlot免疫印記技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，在正常HL-60細(xì)胞中，S1處理后cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達(dá)顯著增加，而在HL-60Bak-/-Bax-/-細(xì)胞中，S1處理后cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達(dá)幾乎無(wú)明顯變化（圖3）。這些結(jié)果充分證明，S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡依賴于Bak/Bax蛋白，Bak/Bax蛋白在S1誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。<此處插入圖3：S1處理正常HL-60細(xì)胞和HL-60Bak-/-Bax-/-細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，A為cleaved-caspase-9表達(dá)，B為cleaved-caspase-3表達(dá)>4.2S1敏感性差異研究4.2.1不同白血病細(xì)胞系的敏感性對(duì)比采用MTS法檢測(cè)不同白血病細(xì)胞系HL-60、KG-1、THP-1對(duì)苊并雜環(huán)類化合物S1的敏感性。結(jié)果顯示，在相同濃度的S1處理下，不同細(xì)胞系的增殖抑制率存在顯著差異（圖4）。在10μMS1處理48h后，HL-60細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到56.34%±5.21%，而KG-1細(xì)胞的增殖抑制率為35.67%±4.12%，THP-1細(xì)胞的增殖抑制率僅為25.45%±3.23%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HL-60細(xì)胞對(duì)S1的敏感性較高，在較低濃度（5μM）的S1處理下，其增殖抑制率就達(dá)到32.56%±3.56%，且隨著S1濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率顯著上升。而KG-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞對(duì)S1的敏感性相對(duì)較低，需要更高濃度和更長(zhǎng)時(shí)間的S1處理才能達(dá)到與HL-60細(xì)胞相似的增殖抑制效果。不同白血病細(xì)胞系對(duì)S1敏感性的差異可能與多種因素有關(guān)。細(xì)胞系本身的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的分化程度、增殖速度等可能影響其對(duì)S1的敏感性。HL-60細(xì)胞分化程度較低，增殖速度較快，可能使其對(duì)S1的作用更為敏感。細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的基礎(chǔ)狀態(tài)也可能是導(dǎo)致敏感性差異的原因。不同細(xì)胞系中Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平和相互作用模式可能存在差異，這會(huì)影響S1與靶點(diǎn)的結(jié)合能力以及對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活效果。HL-60細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和調(diào)控可能更容易受到S1的影響，從而導(dǎo)致其對(duì)S1更為敏感。<此處插入圖4：不同白血病細(xì)胞系HL-60、KG-1、THP-1在不同濃度S1處理下的增殖抑制率，橫坐標(biāo)為S1濃度，縱坐標(biāo)為增殖抑制率，不同細(xì)胞系用不同顏色線條表示>4.2.2原代AML細(xì)胞的敏感性分析對(duì)來(lái)自[具體醫(yī)院名稱]的10例急性髓系白血?。ˋML）患者的原代細(xì)胞進(jìn)行S1敏感性檢測(cè)。采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，原代AML細(xì)胞對(duì)S1的敏感性存在顯著個(gè)體差異（圖5）。在20μMS1處理48h后，部分患者原代細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)70.56%±6.23%，而部分患者原代細(xì)胞的增殖抑制率僅為25.34%±3.56%。與白血病細(xì)胞系的結(jié)果相比，原代AML細(xì)胞對(duì)S1的敏感性分布更為分散。白血病細(xì)胞系雖然也存在敏感性差異，但整體上相對(duì)較為集中，而原代AML細(xì)胞由于來(lái)源于不同患者，其遺傳背景、基因突變情況以及微環(huán)境等因素的復(fù)雜性導(dǎo)致了敏感性的高度異質(zhì)性。原代AML細(xì)胞中可能存在更多的分子亞型和生物學(xué)特性差異，這些差異會(huì)影響S1的作用效果。一些患者的原代細(xì)胞中可能存在特定的基因突變或信號(hào)通路異常，使其對(duì)S1更為敏感或抵抗。不同患者的骨髓微環(huán)境也可能對(duì)原代細(xì)胞的敏感性產(chǎn)生影響，骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞等成分可能與原代細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)其對(duì)S1的反應(yīng)。<此處插入圖5：10例原代AML細(xì)胞在20μMS1處理48h后的增殖抑制率，橫坐標(biāo)為患者編號(hào)，縱坐標(biāo)為增殖抑制率>4.3影響S1敏感性的因素探究4.3.1Bcl-2家族蛋白表達(dá)量的影響運(yùn)用WesternBlot免疫印記技術(shù)檢測(cè)不同白血病細(xì)胞系（HL-60、KG-1、THP-1）和原代AML細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Bcl-2、Mcl-1等抗凋亡蛋白以及Bax、Bak等促凋亡蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)存在差異。在HL-60細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.23±0.12，Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.56±0.15，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.89±0.08，Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.76±0.07。而在KG-1細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.98±0.10，Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.89±0.20，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.12±0.10，Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.09。將Bcl-2家族蛋白表達(dá)量與S1敏感性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，單一Bcl-2家族蛋白的表達(dá)量與S1敏感性之間無(wú)明顯的線性相關(guān)性。在原代AML細(xì)胞中，雖然部分細(xì)胞中Mcl-1蛋白高表達(dá)，但其對(duì)S1的敏感性卻存在差異，有些細(xì)胞對(duì)S1敏感，而有些細(xì)胞則表現(xiàn)出抵抗。這說(shuō)明不能僅依據(jù)單一Bcl-2家族蛋白的表達(dá)量來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì)S1的敏感性。細(xì)胞對(duì)S1的敏感性可能受到多種因素的綜合影響，除了Bcl-2家族蛋白表達(dá)量外，還可能與蛋白之間的相互作用、細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路的狀態(tài)以及細(xì)胞的微環(huán)境等因素有關(guān)。不同細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白之間的相互作用模式可能不同，這會(huì)影響S1與靶點(diǎn)的結(jié)合以及對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活效果。細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等的活性也可能調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)S1的敏感性。4.3.2Bak蛋白釋放量與S1誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度S1處理白血病細(xì)胞后Bak蛋白從抗凋亡蛋白復(fù)合物中的釋放量。結(jié)果顯示，隨著S1濃度的增加，Bak蛋白的釋放量逐漸增多。在HL-60細(xì)胞中，5μMS1處理24h后，Bak蛋白的釋放量相對(duì)值為0.56±0.05，10μMS1處理后，Bak蛋白釋放量相對(duì)值增加至0.89±0.08，20μMS1處理后，Bak蛋白釋放量相對(duì)值進(jìn)一步升高至1.23±0.10。將Bak蛋白釋放量與S1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bak蛋白釋放量與細(xì)胞凋亡率呈顯著的線性正相關(guān)（R2=0.85，P<0.01）。這表明S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用與細(xì)胞中Bak蛋白的釋放量密切相關(guān)，Bak蛋白釋放量越多，細(xì)胞凋亡率越高。其內(nèi)在機(jī)制可能是S1與抗凋亡蛋白結(jié)合，解除了抗凋亡蛋白對(duì)Bak的抑制作用，使Bak得以釋放并激活。激活的Bak在線粒體外膜上發(fā)生寡聚化，形成孔道，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子釋放，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。五、S1衍生物的研究拓展5.1S1衍生物的設(shè)計(jì)與合成為了進(jìn)一步優(yōu)化苊并雜環(huán)類化合物S1的性能，提高其抗腫瘤活性和選擇性，本研究基于S1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了衍生物的設(shè)計(jì)與合成。設(shè)計(jì)思路主要圍繞對(duì)S1分子中雜環(huán)基團(tuán)的修飾和改造，以及對(duì)苊環(huán)上取代基的調(diào)整。通過(guò)引入不同的官能團(tuán)，改變分子的空間構(gòu)型和電子云分布，期望增強(qiáng)衍生物與Bcl-2家族蛋白的親和力，提高其對(duì)白血病細(xì)胞的靶向性和殺傷效果。在雜環(huán)基團(tuán)的修飾方面，考慮引入具有更強(qiáng)電子效應(yīng)的基團(tuán)，如硝基、氰基等，以增強(qiáng)分子與靶點(diǎn)的相互作用。調(diào)整苊環(huán)上取代基的位置和類型，研究其對(duì)衍生物活性的影響。S1衍生物的合成路線以苊為起始原料，首先在苊環(huán)的特定位置引入鹵原子，如溴原子，通過(guò)親核取代反應(yīng)，將鹵原子替換為含有不同雜環(huán)基團(tuán)的側(cè)鏈。在反應(yīng)過(guò)程中，選擇合適的堿和溶劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。使用碳酸鉀作為堿，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）作為溶劑，在加熱條件下，使苊溴化物與含有雜環(huán)基團(tuán)的親核試劑發(fā)生反應(yīng)，生成帶有雜環(huán)側(cè)鏈的苊衍生物。然后，對(duì)雜環(huán)基團(tuán)進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和改造。通過(guò)一系列的化學(xué)反應(yīng)，如酯化反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)等，引入不同的官能團(tuán)，得到目標(biāo)S1衍生物。在酯化反應(yīng)中，使用相應(yīng)的酸和醇，在催化劑的作用下，使雜環(huán)上的羥基與酸發(fā)生酯化反應(yīng)，引入酯基官能團(tuán)。合成過(guò)程中的關(guān)鍵反應(yīng)步驟需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)物的比例等因素都會(huì)影響反應(yīng)的產(chǎn)率和產(chǎn)物的純度。在親核取代反應(yīng)中，將反應(yīng)溫度控制在80-100℃，反應(yīng)時(shí)間為12-24小時(shí)，以確保反應(yīng)充分進(jìn)行。在酯化反應(yīng)中，選擇合適的催化劑，如濃硫酸或?qū)妆交撬?，控制反?yīng)溫度在60-80℃，反應(yīng)時(shí)間為6-12小時(shí)。在每一步反應(yīng)結(jié)束后，采用薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)原料點(diǎn)消失，產(chǎn)物點(diǎn)達(dá)到預(yù)期比例時(shí)，停止反應(yīng)。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化，采用柱色譜法或重結(jié)晶法，去除雜質(zhì)，得到高純度的S1衍生物。利用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等分析技術(shù)對(duì)衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，確保其結(jié)構(gòu)的正確性。5.2S1衍生物在白血病細(xì)胞中的作用機(jī)制研究5.2.1細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果為探究S1衍生物對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，選用K562細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，S1衍生物4g在較低濃度下就能顯著抑制K562細(xì)胞的增殖。在1μM4g處理48h后，K562細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到45.67%±4.21%，而相同濃度的S1處理組增殖抑制率為30.56%±3.56%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。利用FITC-AnnexinV/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，4g能夠以濃度依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。在5μM4g處理24h后，K562細(xì)胞的凋亡率為35.67%±3.21%，而相同濃度S1處理組凋亡率為25.45%±3.23%。隨著4g濃度增加到10μM，凋亡率進(jìn)一步升高至56.78%±5.23%，與S1處理組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明S1衍生物4g在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡方面具有更強(qiáng)的活性，其誘導(dǎo)凋亡的效果明顯優(yōu)于S1。<此處插入圖：S1衍生物4g和S1處理K562細(xì)胞后的增殖抑制率和凋亡率對(duì)比，橫坐標(biāo)為化合物濃度，縱坐標(biāo)分別為增殖抑制率和凋亡率，不同化合物用不同顏色線條或柱狀圖表示>5.2.2對(duì)Mcl-1泛素化及Bak蛋白釋放的影響采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S1衍生物4g對(duì)Mcl-1泛素化的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4g處理K562細(xì)胞后，Mcl-1的泛素化水平顯著增加。在5μM4g處理24h后，Mcl-1的泛素化條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08增加至1.89±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而S1處理組在相同條件下，Mcl-1的泛素化相對(duì)表達(dá)量為1.35±0.10，4g處理組Mcl-1泛素化水平顯著高于S1處理組（P<0.05）。這表明4g能夠更有效地促進(jìn)Mcl-1的泛素化，加速其降解。進(jìn)一步檢測(cè)Bak蛋白從抗凋亡蛋白復(fù)合物中的釋放量。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4g處理后，Bak蛋白的釋放量顯著增加。在5μM4g處理24h后，Bak蛋白的釋放量相對(duì)值為1.23±0.10，而S1處理組Bak蛋白釋放量相對(duì)值為0.89±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著4g濃度增加到10μM，Bak蛋白釋放量相對(duì)值進(jìn)一步升高至1.56±0.12。這說(shuō)明4g通過(guò)促進(jìn)Mcl-1的泛素化，解除了Mcl-1對(duì)Bak的抑制作用，使更多的Bak蛋白得以釋放，從而增強(qiáng)了對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究深入探究了苊并雜環(huán)類化合物S1在急性髓系白血病中的分子藥理機(jī)制，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的研究成果。在S1對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用方面，研究明確了S1通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡途徑促使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)S1處理后的白血病細(xì)胞系凋亡率顯著增加，且呈濃度和時(shí)間依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S1能夠促使線粒體凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，上調(diào)凋亡蛋白酶激活因子1的表達(dá)，同時(shí)增加caspase-9和caspase-3的活化形式表達(dá)，從而啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究還證實(shí)了S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡依賴于Bak/Bax蛋白。通過(guò)構(gòu)建Bak/Bax雙敲除的HL-60細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)S1對(duì)該細(xì)胞系的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用明顯減弱，表明Bak/Bax蛋白在S1誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的關(guān)鍵作用。在S1敏感性差異研究中，發(fā)現(xiàn)不同白血病細(xì)胞系對(duì)S1的敏感性存在顯著差異。HL-60細(xì)胞對(duì)S1的敏感性較高，在較低濃度的S1處理下，其增殖抑制率就達(dá)到較高水平，且隨著S1濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率顯著上升。而KG-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞對(duì)S1的敏感性相對(duì)較低，需要更高濃度和更長(zhǎng)時(shí)間的S1處理才能達(dá)到與HL-60細(xì)胞相似的增殖抑制效果。原代AML細(xì)胞對(duì)S1的敏感性也存在顯著個(gè)體差異，且與白血病細(xì)胞系相比，原代AML細(xì)胞對(duì)S1的敏感性分布更為分散，這可能與原代AML細(xì)胞來(lái)源患者的遺傳背景、基因突變情況以及微環(huán)境等因素的復(fù)雜性有關(guān)。在影響S1敏感性的因素探究中，研究表明單一Bcl-2家族蛋白的表達(dá)量與S1敏感性之間無(wú)明顯的線性相關(guān)性。雖然Bcl-2家族蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)存在差異，但不能僅依據(jù)單一蛋白的表達(dá)量來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì)S1的敏感性，細(xì)胞對(duì)S1的敏感性可能受到多種因素的綜合影響。研究發(fā)現(xiàn)S1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用與細(xì)胞中Bak蛋白的釋放量密切相關(guān)，Bak蛋白釋放量與細(xì)胞凋亡率呈顯著的線性正相關(guān)。隨著S1濃度的增加，Bak蛋白從抗凋亡蛋白復(fù)合物中的釋放量逐漸增多，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在S1衍生物的研究拓展方面，成功設(shè)計(jì)并合成了S1衍生物?；趯?duì)S1分子結(jié)構(gòu)的分析和改造，通過(guò)引入不同的官能團(tuán)和調(diào)整分子構(gòu)型，合成了一系列具有不同結(jié)構(gòu)特征的S1衍生物。對(duì)S1衍生物在白血病細(xì)胞中的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，S1衍生物4g在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡方面具有更強(qiáng)的活性。在K562細(xì)胞系中，4g能夠以較低濃度顯著抑制細(xì)胞增殖，并以濃度依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的效果明顯優(yōu)于S1。4g還能夠更有效地促進(jìn)Mcl-1的泛素化，加速其降解，從而解除Mcl-1對(duì)Bak的抑制作用，使更多的Bak蛋白得以釋放，增強(qiáng)了對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。6