13I1重要作物病原大麗輪枝菌致病力評價技術(shù)規(guī)程本文件適用于來源于不同寄主的大麗輪枝菌在棉花、茄子、馬鈴薯和向日葵等作物上的致病力下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用在鑒定寄主上表現(xiàn)強致病力（病情指數(shù)40標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)（50.0）與同批次評價試驗中對照病原菌菌株在鑒定寄主上病情指數(shù)的比值，記作K。病情指數(shù)與病情指數(shù)校正系數(shù)的乘積，記作RDI。4儀器設(shè)備2溫度保持在20℃~28℃)、不銹鋼鍋、電磁爐、培養(yǎng)皿、試管、剪子、鑷子、廣口瓶、酒精燈等。選擇對照病原菌菌株為大麗輪枝菌WX-1,落葉型，在棉花、茄子、馬鈴薯和向日葵四種作物的在超凈工作臺上，將分離純化的大麗輪枝菌菌株及對照病原菌菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上進行活化，25℃恒溫培養(yǎng)7d,挑取菌落邊緣的新鮮菌絲塊(直徑5mm)4～5塊轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中，25℃、180rmin?1條件下恒溫震蕩培養(yǎng)5d,培養(yǎng)液用2層滅菌紗布濾除菌絲得到分生孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)濾液中分生孢子數(shù)量，并用滅菌6評價程序始切成立體小三角塊(25g～50g),保證每塊至少有1～2個芽眼。25℃攤開放置4h,待薯塊切口量=1:1,121℃,0.1MPa～0.15MPa,1h)5cm~6cm,壓實，每盆3塊薯塊，上部覆土厚度為3cm~4cm,灌足自來水，在溫室中培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為20℃~28℃,出苗后10h光照，14h黑暗。陰天開補光燈，光照過強使用遮陽網(wǎng))。每個供試大麗輪枝菌菌株致病力評價試驗4次重復(fù)，每5盆為1次重泡30min后取出，用濕紗布包裹種子，置于30℃保濕培養(yǎng)，待種子露白(芽長2mm以上)后種植于4×8孔書式育苗盒中，下部鋪墊滅菌土(大田土壤重量：育苗基質(zhì)重量=1:1,121℃,0.1MPa～0.15MPa,1h))9cm,壓實，每孔3粒種子，上部覆土厚度為2cm,澆足水后在溫室中培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為20℃~28℃,出苗后10h光照，14h黑暗。陰天需開補光燈，光照過強需放遮陽網(wǎng))。每個作物品種底部鋪有2cm滅菌土的同樣新花盆中，在接種液(2.0L)中浸泡30min,繼續(xù)在原來環(huán)境中培養(yǎng)。3根剪斷，制造傷口，關(guān)閉育苗盒，將帶有傷口的植株在接種液（2L/育苗盒）中浸泡30min后，繼續(xù)在原來環(huán)境中培養(yǎng)。每批次評價試驗中均設(shè)對照病原菌菌株處理和清水對照處理。各鑒定寄主接種病原菌后，實時監(jiān)測對照病原菌菌株處理的發(fā)病情況，當(dāng)對照病原菌菌株處理的病情指數(shù)達到50.010.0時，調(diào)查并記錄本批次評價試驗中1級：病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比值≤25%4級：病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比值＞75%，多為褐色枯斑，葉片有的脫落成光桿，整株枯DI=∑（病級值×相應(yīng)病株數(shù)）/（最高病級值×相對病情指數(shù)（RDI）相對病情指數(shù)（RDI計算結(jié)果保留小數(shù)點后1位相應(yīng)作物上的致病力級別。致病力級別的劃分標(biāo)準(zhǔn)見10無2弱3中4強4A.1病原菌的分類地位A.2培養(yǎng)特性和孢子形態(tài)初生菌絲體無色，后變褐色，有分隔，直徑2.0μm～4.0μm。菌絲體常呈膨脹狀，可梗上的瓶梗末端逐個割裂。空氣干燥時，孢子在瓶梗末端聚集成堆，空氣濕潤時，則形成孢子球。顯微鏡下制片觀察時，孢子即散開，只留下梗端新生出的單個孢通常有3～5根，瓶梗長度為13.0μm～18.0μm，輪層間的距離A.3溫室內(nèi)黃萎病癥狀溫室馬鈴薯苗期黃萎病發(fā)病癥狀：下部葉片先表現(xiàn)出癥狀，葉片或葉片主脈間葉肉表現(xiàn)淡黃色不規(guī)則病斑，隨后病斑顏色大部分變黃色和黃褐色，葉肉組織變軟，葉片邊緣有卷枯，有少數(shù)葉片溫室棉花、茄子、向日葵苗期黃萎病發(fā)病癥狀：植株子葉或下部真葉葉緣或葉脈間出現(xiàn)淺黃色斑塊。后逐漸擴展，葉色失綠變黃褐色，病葉出現(xiàn)掌狀斑駁，葉肉變厚，葉緣向下卷曲，發(fā)生嚴重時，整張葉片枯焦破碎，葉片由下而上逐漸脫落，僅剩頂部少數(shù)小葉，發(fā)生嚴重時植株光桿。5