《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)

技術(shù)規(guī)范》

（征求意見(jiàn)稿）

編制說(shuō)明

《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》

編制組

二。二三年八月

項(xiàng)目名稱(chēng)：大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

項(xiàng)目統(tǒng)一編號(hào)：20231140

承擔(dān)單位：北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、中科院生態(tài)環(huán)境研究中心

目錄

I標(biāo)準(zhǔn)基本情況........................................................1

1.1任務(wù)來(lái)源.....................................................I

1.2起草單位和主要起草人........................................1

2制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義.............................................1

2.1管理支撐.....................................................1

2.2必要性和意義................................................2

3主要工作過(guò)程.......................................................3

3.1查閱國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)........................................4

3.2前期研究成果................................................5

3.3標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)路線.................................................6

4編制原則和編制依據(jù).................................................7

4.1編制原則.....................................................7

4.2編制依據(jù).....................................................7

4.3與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系................................8

5主要條款的說(shuō)明.....................................................9

5.1文件內(nèi)容框架.................................................9

5.2主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的論述.........................11

5.3方法應(yīng)用...................................................27

6重大意見(jiàn)分歧的處理依據(jù)和結(jié)果......................................33

7與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況....................................34

8作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)或者強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的建議及其理由.......................34

9實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的措施....................................................35

10其他應(yīng)說(shuō)明的事項(xiàng).................................................35

1標(biāo)準(zhǔn)基本情況

1.1任務(wù)來(lái)源

2023年1月北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布了《北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于印

發(fā)2023年北京市地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（京市監(jiān)發(fā)（2023）4號(hào)），

《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》列入2023年北京市地方標(biāo)準(zhǔn)

制修訂項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：20231140c項(xiàng)目類(lèi)別為一類(lèi)，標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)為推薦性,

1.2起草單位和主要起草人

《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》行業(yè)主管部門(mén)為北京市生

態(tài)環(huán)境局，主要起草單位為北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究

中心。

主要起草人：常淼、杜澤瑞、沈秀娥、孫成華、陳圓圓、劉康、任帥、晁晶

迪、馬秋月、賀鑫、戰(zhàn)愛(ài)斌、熊薇、陳義永。

2制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

2.1管理支撐

拓展水生態(tài)監(jiān)測(cè)能力，支撐水生態(tài)環(huán)境管理需求工作需要。生態(tài)環(huán)境部發(fā)布

的《生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)劃綱要（2020—2035年）》中提出“地表水監(jiān)測(cè)要逐步實(shí)現(xiàn)水

質(zhì)監(jiān)測(cè)向水生態(tài)監(jiān)測(cè)的系統(tǒng)轉(zhuǎn)變，建立以流域?yàn)閱卧乃鷳B(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)體系和評(píng)

價(jià)體系”。“十四五”重點(diǎn)流域水生態(tài)環(huán)境保護(hù)規(guī)劃要求在長(zhǎng)江、遼河、海河、松花

江等流域開(kāi)展水生生物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)試點(diǎn)。生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《內(nèi)陸大型底棲

無(wú)脊椎動(dòng)物多樣性調(diào)查與評(píng)估技術(shù)規(guī)定》要求在編制大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種名

錄時(shí)要附上憑證，包括照片、DNA序列等。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《長(zhǎng)江十年

禁漁計(jì)劃》，以空前嚴(yán)珞的措施實(shí)施禁漁。而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定損傷性（通常是

致死性）的取樣方式對(duì)所研究的生物群落造成了破壞，違背了保護(hù)生物多樣性的

初衷?，F(xiàn)行的禁漁政策也不允許破壞性樣品采集。北京市生態(tài)環(huán)境局印發(fā)《北京

市“十四五”時(shí)期生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)劃》要求拓展水生態(tài)監(jiān)測(cè)，開(kāi)展水體底棲生物在

水生態(tài)補(bǔ)償領(lǐng)域的應(yīng)用研究，研究水環(huán)境生態(tài)標(biāo)識(shí)物監(jiān)測(cè)指標(biāo)，探索開(kāi)展水生生

物自動(dòng)識(shí)別、水生態(tài)流量監(jiān)測(cè)，為水生態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)納入本市水生態(tài)環(huán)境區(qū)域補(bǔ)償

監(jiān)測(cè)體系奠定基礎(chǔ)。提升水生態(tài)監(jiān)測(cè)能力，探索應(yīng)用環(huán)境DNA宏條形碼生物多

樣性技術(shù)，開(kāi)展水生生物的分子生物學(xué)快速鑒定技術(shù)研究，初步構(gòu)建本地化水生

生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2必要性和意義

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范不足以支撐北京市水生杰環(huán)境管理工作需要。大型底棲

無(wú)脊椎動(dòng)物形態(tài)學(xué)鑒定監(jiān)測(cè)需要借助專(zhuān)業(yè)設(shè)備，不利于開(kāi)展大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。

大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物采樣需要借助專(zhuān)業(yè)的采泥器、踢網(wǎng)、D形網(wǎng)、索伯網(wǎng)、人工

基質(zhì)籃式采樣器和十字采樣器等，點(diǎn)位選擇及采樣人員的經(jīng)驗(yàn)直接影響大型底棲

無(wú)脊椎動(dòng)物樣品的采樣和物種鑒定質(zhì)量。這種損傷性（通常是致死性）的取樣方

式對(duì)所研究的生物群落造成了破壞，違背了保護(hù)生物多樣性的初衷。此外，隨著

監(jiān)測(cè)技術(shù)的發(fā)展和環(huán)境管理需求的變化，使用形態(tài)學(xué)鑒定的方法進(jìn)行水生物種多

樣性監(jiān)測(cè)逐漸暴露出很多局限性：（1）采樣要求高，監(jiān)測(cè)效率低。一次采樣難以

全面準(zhǔn)確的采集到合格的樣品，造成樣品代表性差；（2）分類(lèi)鑒定過(guò)于依賴專(zhuān)家

的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)研究人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，鑒定與分類(lèi)結(jié)果的正確性缺乏依據(jù)，質(zhì)控

困難；（3）在生活史早期階段的大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物及高度近緣的大型底棲無(wú)脊

椎動(dòng)物類(lèi)群往往難以辨別，特定發(fā)育階段及不同性別的樣品往往難以辨別，影響

鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性等。傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法的局限性使其難以適應(yīng)目前水質(zhì)監(jiān)測(cè)要求的

高頻率、大規(guī)模、高要求的監(jiān)測(cè)和管理需求。因此，亟需建立高靈敏度、高準(zhǔn)確

度、高效率、代表性更好的新型水生生物監(jiān)測(cè)技術(shù)和方法。

環(huán)境DNA（environmentalDNA,環(huán)境DNA）是從生物生活環(huán)境中直接提取

到的不同物種DNA的總和，包含動(dòng)植物脫落的細(xì)胞或游離的DNA。環(huán)境DNA

監(jiān)測(cè)方法通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲取樣品中生物物種組成，能夠快速、準(zhǔn)確、大規(guī)

模地得到生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性信息，極大的拓展了生物多樣性調(diào)查方法,

現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水生態(tài)環(huán)境的生物多樣性監(jiān)測(cè)中。相對(duì)于傳統(tǒng)的野外調(diào)查監(jiān)測(cè)

2

方法，環(huán)境DNA技術(shù)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1）采樣方法簡(jiǎn)單，省時(shí)省力。相對(duì)

于傳統(tǒng)的采樣方法，采集水樣耗時(shí)少、成本低。（2）無(wú)損傷采樣。相對(duì)于傳統(tǒng)的

捕獲式采樣，環(huán)境DNA技術(shù)只需要采集生物棲息地的水樣，并不會(huì)危害到目標(biāo)

物種或者采集區(qū)域內(nèi)的其他物種，對(duì)采樣點(diǎn)周?chē)纳鷳B(tài)系統(tǒng)干擾較少。（3）不依

賴動(dòng)物樣本?？朔藗鹘y(tǒng)的動(dòng)物野外調(diào)查方法對(duì)動(dòng)物樣品自身的依賴性，避免了

未遇見(jiàn)或未采集樣本而造成對(duì)物種多樣性及其分布狀況的低估或誤判。（4）采樣

受限小。由于環(huán)境DNA主要采集水樣，與傳統(tǒng)的調(diào)查監(jiān)測(cè)方法相比，在采樣環(huán)

節(jié)對(duì)環(huán)境要求低，可以最大限度地降低因天氣狀況、水位、物候等環(huán)境條件變化

對(duì)采樣的影響和限制。（5）靈敏度高，樣品代表性強(qiáng)。即使在物種密度很低的情

況下也能準(zhǔn)確檢測(cè)到目標(biāo)物種的存在。研究表明對(duì)于監(jiān)測(cè)淡水水生生物，尤其

是外來(lái)入侵或者瀕危乃至稀有動(dòng)物，其靈敏度要高于傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法。（6）快速

和高效檢測(cè)群落多樣性.結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)的環(huán)境DNA宏條形碼方法可以在

短時(shí)間內(nèi)對(duì)混合的環(huán)境樣品包含的所有物種進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)，具有大尺度、大樣

本生物多樣性監(jiān)測(cè)的潛力。（7）流程的標(biāo)準(zhǔn)化程度高，便于質(zhì)量控制。有利于制

定規(guī)范的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，克服了傳統(tǒng)方法受樣品條件限制、操作者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和專(zhuān)業(yè)知

識(shí)等限制?；诖?，環(huán)境DNA技術(shù)已成為高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高效率、代表

性更好和標(biāo)準(zhǔn)化的新一代生物多樣性監(jiān)測(cè)方法。環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)集成了樣品采集、

環(huán)境DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序、生物信息學(xué)分析等一系列操作的綜合技術(shù)體

系，監(jiān)測(cè)的結(jié)果也會(huì)受到諸多方面的影響，規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的操作流程是成功和準(zhǔn)確開(kāi)

展環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵。

《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》的制定將為在全市范圍內(nèi)

進(jìn)行大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)提供統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，滿足國(guó)家與北京

市對(duì)于拓展水生態(tài)監(jiān)測(cè)，提升水生態(tài)監(jiān)測(cè)能力的技術(shù)需求。

3主要工作過(guò)程

北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心接到北京市地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃任務(wù)后，于

2022年成立了標(biāo)準(zhǔn)編制組，編制組由從事大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)和環(huán)境DNA

監(jiān)測(cè)相關(guān)技術(shù)人員組成。

2022年1月~5月，梳理完成了2020年8月?2021年12月北京市典型水體底棲無(wú)

3

脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)結(jié)果，整理分析北京五大水系60余個(gè)點(diǎn)位底棲無(wú)脊椎動(dòng)

物名錄和構(gòu)建的98種北京市本地大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)?？偨Y(jié)環(huán)境

DNA監(jiān)測(cè)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題及規(guī)律，提出《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境

DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》研究總體技術(shù)路線，建立科學(xué)可行的基于環(huán)境DNA技術(shù)的

北京市典型水體底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)的程序、方法。

2022年6月~12月，完成了方法技術(shù)參數(shù)研究和論證工作，編制完成了《環(huán)

境DNA技術(shù)的淡水底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》申報(bào)書(shū)和標(biāo)準(zhǔn)文本草案，申

報(bào)立項(xiàng)。開(kāi)展方法應(yīng)用和相關(guān)技術(shù)的實(shí)際驗(yàn)證工作，繼續(xù)補(bǔ)充北京市本地大型底

棲無(wú)脊椎動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，累計(jì)154種。

2023年1月，標(biāo)準(zhǔn)獲批立項(xiàng)，召開(kāi)了專(zhuān)家研討會(huì)，會(huì)上就《大型底棲無(wú)脊椎

動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》的采樣介質(zhì)、引物等核心技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行了專(zhuān)家質(zhì)

詢和討論c

2023年2月~3月，開(kāi)展了方法核心參數(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品采集分析，繼

續(xù)修改完善標(biāo)準(zhǔn)文本草案和編制說(shuō)明。

2023年4月?5月，召開(kāi)了兩次專(zhuān)家咨詢會(huì)，專(zhuān)家建議1、重點(diǎn)關(guān)注深水型

湖庫(kù)（密云水庫(kù)）開(kāi)展不同深度水樣的系統(tǒng)研究，確定深水型湖庫(kù)環(huán)境DNA采

樣方式。2、增加陽(yáng)性樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2023年6月-7月，根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)，補(bǔ)充采集了深水型湖庫(kù)樣品，補(bǔ)充了陽(yáng)

性樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，修改完善了地標(biāo)草案文本及編制說(shuō)明，

2023年7月?9月，召開(kāi)專(zhuān)家研討會(huì)，匯總專(zhuān)家會(huì)意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修改，編

制組召開(kāi)內(nèi)部討論會(huì)，完善了本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，形成《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境

DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（征求意見(jiàn)稿）及編制說(shuō)明c

3.1查閱國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)

3.1.1國(guó)內(nèi)應(yīng)用進(jìn)展

2019年至今，中國(guó)環(huán)境總站和各省市級(jí)監(jiān)測(cè)站陸續(xù)開(kāi)展了基于環(huán)境DNA的

水生生物監(jiān)測(cè)試點(diǎn)應(yīng)用。中國(guó)環(huán)境總站在2021年啟動(dòng)了《長(zhǎng)江流域魚(yú)類(lèi)環(huán)境DNA

試點(diǎn)監(jiān)測(cè)、通量試點(diǎn)監(jiān)測(cè)及水生生物樣品采集》項(xiàng)目。北京市等省級(jí)環(huán)境監(jiān)測(cè)機(jī)

4

構(gòu)相繼建立環(huán)境DNA分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，購(gòu)置了相關(guān)儀器設(shè)備，建立了環(huán)境

DNA監(jiān)測(cè)能力開(kāi)展試點(diǎn)監(jiān)測(cè)。

3.1.2國(guó)外應(yīng)用進(jìn)展

環(huán)境DNA技術(shù)最早在2008年由美國(guó)開(kāi)始探索研究，環(huán)境DNA最初被用

來(lái)監(jiān)測(cè)水生生態(tài)系統(tǒng)的生物入侵。如美國(guó)牛蛀(Ficctolactal,2008)、亞洲鯉魚(yú)

(Hypophthalmichthysmolitrix)(Jerdeetal,2013)、大西洋蛙(Cyprinus

carpio)(Takaharaetal,2012)、水生腹足類(lèi)(Potamopyrgusantipodarum)(Goldberget

al,2013)、克氏原螯蝦(Procambamsclarkii)(Treguieretal,2014)等入侵物種的監(jiān)測(cè),

上述研究證實(shí)了環(huán)境DNA技術(shù)的可行性。

綜上所述，環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外正處在快速發(fā)展階段，隨著方法技

術(shù)發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化，未來(lái)將為水生生物調(diào)查監(jiān)測(cè)和水生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)提供了重要的技

術(shù)支撐。

3.2前期研究成果

北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心20世紀(jì)70年代末至本世紀(jì)初對(duì)北京市水源地、游

覽水域.、市區(qū)下游主要河道和主要湖泊水庫(kù)進(jìn)行大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物群落監(jiān)測(cè)。

編寫(xiě)了《國(guó)控點(diǎn)及重點(diǎn)水域?qū)嵤┥锉O(jiān)測(cè)方法的可行性》、《昆明湖及“六?！辈糠?/p>

水域水生生物群落調(diào)查報(bào)告》等技術(shù)報(bào)告。先后承擔(dān)過(guò)北京市生態(tài)環(huán)境局組織實(shí)

施的《密云水庫(kù)水質(zhì)保護(hù)技術(shù)研究課題》、《水利工程等人為活動(dòng)對(duì)北京市部分水

域水生生物群落影響》等多項(xiàng)課題。2020年開(kāi)始聯(lián)合中科院生態(tài)環(huán)境研究中心

實(shí)施《北京市五大水系水生生物調(diào)查監(jiān)測(cè)與水生態(tài)環(huán)境狀況評(píng)價(jià)》、《基于環(huán)境

DNA技術(shù)的北京市典型水體水生生物多樣性監(jiān)測(cè)和水生態(tài)環(huán)境狀況評(píng)估》、《水

環(huán)境生態(tài)監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)項(xiàng)目基于環(huán)境DNA水生生物多樣性監(jiān)測(cè)及評(píng)估》項(xiàng)目。每

年選擇不同水體類(lèi)型(河流湖庫(kù))，在山區(qū)、平原右設(shè)60余個(gè)點(diǎn)位開(kāi)展環(huán)境DNA

水生生物監(jiān)測(cè)，至今已開(kāi)展7輪調(diào)查監(jiān)測(cè)。前期開(kāi)展的常規(guī)大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物

監(jiān)測(cè)和調(diào)查工作，積累了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，掌握了北京市各個(gè)流域各類(lèi)水體中大型

底棲無(wú)脊椎動(dòng)物分布狀況，驗(yàn)證了環(huán)境DNA布點(diǎn)采樣方法、選擇了適合北京市

流域大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)的通用引物，并開(kāi)展了基于環(huán)境DNA技術(shù)的大型

底棲無(wú)脊椎動(dòng)物水生態(tài)狀況評(píng)估工作。截至目前，已取得的成果包括兩部分：

(1)在北京市五大水系采集了大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物樣品，獲得了北京地區(qū)

大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物基礎(chǔ)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。構(gòu)建了北京地區(qū)典型水域的大型底棲無(wú)脊椎

動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，包括環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)，節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，軟體動(dòng)物門(mén)共154個(gè)物種。

通過(guò)樣品采集、清理、鑒定、浸制，共得到大型生物標(biāo)本50余種，包含蝦類(lèi)，

貝類(lèi)和水生昆蟲(chóng)。

(2)基于環(huán)境DNA技術(shù)獲得了2020-2023年北京市五大水系60余個(gè)點(diǎn)位

大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物多樣性和群落組成。掌握了大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物季節(jié)變化和

空間分布規(guī)律，不同類(lèi)型水體優(yōu)勢(shì)種和北京市大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種名錄。同

時(shí)開(kāi)展了基于環(huán)境DNA的水生態(tài)環(huán)境狀況評(píng)價(jià)。

3.3標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)路線

2020年起至今，北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中

心在北京市五大水系60余個(gè)點(diǎn)位開(kāi)展了7輪次的大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物形態(tài)學(xué)和

環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)。在實(shí)際工作中優(yōu)化監(jiān)測(cè)方法技術(shù)參數(shù)，展開(kāi)多次交流討論，于

2022年9月完成了《環(huán)境DNA技術(shù)的淡水底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》項(xiàng)目

申報(bào)書(shū)和標(biāo)準(zhǔn)文本草案。經(jīng)過(guò)主管部門(mén)北京市生態(tài)環(huán)境局審核后，報(bào)北京市市場(chǎng)

管理局申請(qǐng)立項(xiàng)為一類(lèi)項(xiàng)目。

2023年1月《大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》獲批立項(xiàng)，標(biāo)

準(zhǔn)編制組多次討論修改標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)路線。編制組根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)，進(jìn)一步修改完善標(biāo)

準(zhǔn)文本形成征求意見(jiàn)稿。2023年8月北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心組織召開(kāi)了《大

型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》專(zhuān)家研討會(huì)。標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)路線見(jiàn)

圖lo

6

圖1標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)路線

4編制原則和編制依據(jù)

4.1編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/TLl?2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》

的規(guī)定進(jìn)行編寫(xiě)。以國(guó)家和北京市現(xiàn)行生態(tài)環(huán)境相關(guān)法律、法規(guī)、政策和規(guī)劃中

水生生物監(jiān)測(cè)的相關(guān)要求為依據(jù)，符合各項(xiàng)法規(guī)要求,與現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)銜接,

滿足水生態(tài)環(huán)境管理要求。規(guī)范編制基本原則如下：

（1）充分考慮北京市實(shí)際情況，與已頒布的各有關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容不矛盾。

（2）總結(jié)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料及大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)的方法

驗(yàn)證和實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)上，規(guī)范內(nèi)容與指標(biāo)明確。

（3）可操作性強(qiáng)，具有普遍適用性，易于推廣使用。

4.2編制依據(jù)

木標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中參照的主要標(biāo)準(zhǔn)：

7

GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程

GB/T35537高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求

GB/T35890高通量測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范

GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測(cè)高通量測(cè)序法

HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

HJ168環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則

HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ710.8生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無(wú)脊椎動(dòng)物

HJ1295水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)(試行)

HJ1296水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南湖泊和水庫(kù)水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)(試行)

DB11/T1368實(shí)驗(yàn)室危險(xiǎn)廢物污染防治技術(shù)規(guī)范

4.3與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

4.3.1國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法

近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)有《高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程》

(GB/T30989-2014)、《高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求》(GB/T35537-2017)、

《高通星測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范》(GB/T35890-2018)、《環(huán)境微生物宏基因組檢

測(cè)高通量測(cè)序法》(GB/T40226.2021)詳細(xì)規(guī)定了DNA提取、PCR擴(kuò)增、文庫(kù)

構(gòu)建和測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)的技術(shù)要求。環(huán)境DNA(EnvironmentalDNA,eDNA)

技術(shù)起源于微生物領(lǐng)域，最早被用于分離純化環(huán)境中微生物的DNA,隨后逐漸

被應(yīng)用被用于監(jiān)測(cè)水生生物。目前:國(guó)內(nèi)己發(fā)布水生生物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)相關(guān)標(biāo)

準(zhǔn)有中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《淡水生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA宏條形碼法》(T/CSES

81—2023)。規(guī)定了利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)淡水生物的方法和質(zhì)量控

制與質(zhì)量保證。適用于基于DNA序列相似性的淡水生物多類(lèi)群監(jiān)測(cè)，包括浮游

植物、著生藻類(lèi)、水生維管束植物、浮游動(dòng)物、大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等。

北京市地方標(biāo)準(zhǔn)《魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范(DB11"2023—2022)》規(guī)

定了魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA(cDNA)識(shí)別的對(duì)象、技術(shù)方法、采集利實(shí)驗(yàn)分析等技

術(shù)要求。正在征求意見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)有遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)DNA條形碼鑒定大型底

8

棲無(wú)脊椎動(dòng)物》，江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)方法》。

4.3.2國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)方法

國(guó)際上各國(guó)已經(jīng)制定基于環(huán)境DNA的生物監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)、指南、手冊(cè)。2015

年由美國(guó)內(nèi)務(wù)部(USD和美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局(USGS)發(fā)布了《環(huán)境DNA采樣技

術(shù)規(guī)范》。2019年日本環(huán)境DNA學(xué)會(huì)《環(huán)境DNA采樣、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》。2020年瑞

士環(huán)境署頒布了聯(lián)合蘇黎世大學(xué)等單位發(fā)布了《環(huán)境DNA水生生態(tài)生物監(jiān)測(cè)和

評(píng)價(jià)技術(shù)導(dǎo)則》。2021年歐盟科技合作聯(lián)盟(COST)出臺(tái)了《環(huán)境DNA生物評(píng)

估方法指南》。

本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行的法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有任何沖突和重合。完全遵循國(guó)家水利、

環(huán)保部門(mén)和相關(guān)部門(mén)的法律法規(guī)，以及相關(guān)國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，與相關(guān)規(guī)范

性文件一致、相互配套、相互銜接。本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合北京市水

生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)狀況，河流、湖庫(kù)狀況，生物地理區(qū)系和歷史監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的實(shí)際情況，

規(guī)定了利用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測(cè)大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的方法。本文件適用于北京

市范圍內(nèi)河流、湖泊、水庫(kù)等淡水水域類(lèi)型中大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的監(jiān)測(cè)。本標(biāo)

準(zhǔn)主要參考《魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范》(DB11/T2023—2022)還參考

了《淡水生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA宏條形碼法》(T/CSES81—2023)以及其他相關(guān)資

料。

5主要條款的說(shuō)明

5.1文件內(nèi)容框架

本標(biāo)準(zhǔn)的主要條款包括：

第1章范圍，規(guī)定了利用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測(cè)大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的方法。

適用于北京市范圍內(nèi)河流、湖泊、水庫(kù)等不同淡水水域類(lèi)型中大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)

物的監(jiān)測(cè)。

第2章規(guī)范性引用文件，本標(biāo)準(zhǔn)引用以下標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范中對(duì)監(jiān)測(cè)布點(diǎn)、DNA實(shí)

驗(yàn)、測(cè)序等的要求

GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程

GB/T35537高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求

HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ1295水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)（試行）

HJ1296水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南湖泊和水庫(kù)水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)（試行）

DBlirri368實(shí)驗(yàn)室危險(xiǎn)廢物污染防治技術(shù)規(guī)范

第3章術(shù)語(yǔ)和定義，給出了本標(biāo)準(zhǔn)中使用的大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物、環(huán)境DNA、

高通量測(cè)序、DNA條形碼、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、索引（Index）、弓I物（Primer）、

操作分類(lèi)單元（OTU）、相對(duì)豐度、陽(yáng)性對(duì)照樣品等專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)的解釋和定義，

第4章介紹了大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)原則及流程，監(jiān)測(cè)原則包

括：科學(xué)性原則、代表性原則、可操作性原則、可比性原則、保護(hù)性原則、安全

性原則.監(jiān)測(cè)流程分為準(zhǔn)備階段（監(jiān)測(cè)目的的確定、監(jiān)測(cè)方案制定、監(jiān)測(cè)安排和

準(zhǔn)備），現(xiàn)場(chǎng)采樣階段（樣品采集、樣品運(yùn)輸和保存），樣品處理階段（樣品前

處理、環(huán)境DNA提取和純化），實(shí)驗(yàn)室分析階段（PCR擴(kuò)增及測(cè)序、結(jié)果分析

及記錄）。

第5章試劑和材料，規(guī)定了本標(biāo)準(zhǔn)中所使用試劑和材料的清單及具體要求。

第6章儀器和設(shè)備，列出了環(huán)境DNA常用儀器設(shè)備清單。

第7章樣品，規(guī)定了不同水體類(lèi)型監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)原則和方法、監(jiān)測(cè)頻次和時(shí)

間、監(jiān)測(cè)安排和準(zhǔn)備、樣品采集方式和保存方法。

第8章分析步驟，規(guī)定了樣品前處理和提取純化方法，DNA濃度檢測(cè)和保

存要求。規(guī)定了PCR引物、擴(kuò)增方法、PCR反應(yīng)產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)方法和產(chǎn)

物質(zhì)量要求，以及高通量測(cè)序要求

第9章結(jié)果分析，規(guī)定了測(cè)序后得到的序列文件的質(zhì)控、OTU聚類(lèi)、物種

注移要求。

第1（）章質(zhì)量保證與質(zhì)量控制，規(guī)定了樣品采集、保存、實(shí)驗(yàn)室分析等過(guò)程

中的質(zhì)控要求。規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控樣品類(lèi)型和精密度控制指標(biāo)。

第11章規(guī)定了注意事項(xiàng)。

第12章規(guī)定了廢棄物處理方法。

10

5.2主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的論述

本標(biāo)準(zhǔn)編制組充分調(diào)研國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和研究方法，收集整理北京市2020至

2023年大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物歷史監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，并對(duì)2022年春夏秋三個(gè)季節(jié)60余

個(gè)點(diǎn)位實(shí)際樣品進(jìn)行分析，分析標(biāo)準(zhǔn)方法的可行性，確定了應(yīng)用環(huán)境DNA宏條

形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)北京市河流湖庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)方法及技術(shù)路線，規(guī)范了質(zhì)量保證質(zhì)量控制

方法，大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)規(guī)范技術(shù)路線圖見(jiàn)圖2。

文獻(xiàn)同研

樣品采生分析方法質(zhì)保質(zhì)控

確定方法核心

參數(shù)開(kāi)展研究

---

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精密度方法應(yīng)用研究

(假陰性和偏陽(yáng)性率)(實(shí)際擇品測(cè)試)

編寫(xiě)完善標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明

圖2大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)路線

5.2.1采樣點(diǎn)位設(shè)置

參考《地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》(HJ91.2—2022)、《水質(zhì)采樣技術(shù)指

導(dǎo)》(HJ494—2009)、《水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)要求淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物》(試行)

的通知(總站水字(2021)629號(hào))、水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測(cè)與

評(píng)價(jià)(試行)(HJ1295-2023)、水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南湖泊和水庫(kù)水生生物監(jiān)

測(cè)與評(píng)價(jià)(試行)(HJ1296—2023)等標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)遵循連續(xù)性原則，

一致性原則，代表性原則和可行性原則。充分考慮大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物生活史、

水體類(lèi)型、深度、連通性、水文和水化學(xué)等因素的影響。

環(huán)境DNA在水體中的時(shí)空分布和濃度受多種因素影響?！董h(huán)境DNA采樣

和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)v2.2》(Minamotoetal,2020)中規(guī)定應(yīng)詳細(xì)記錄采樣點(diǎn)位周邊生鏡

和有無(wú)廢水、生活污水排放等信息。生活污水中可能含有外源水生生物的DNA,

11

導(dǎo)致環(huán)境DNA出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，采樣位點(diǎn)布設(shè)要充分考慮污水處理廠等人類(lèi)

活動(dòng)影響因素。

綜上，按照HJ91.2,采樣點(diǎn)位應(yīng)覆蓋監(jiān)測(cè)區(qū)域代表性生境，綜合考慮大型底

棲無(wú)脊椎動(dòng)物生活史和監(jiān)測(cè)區(qū)域水體類(lèi)型、生境、水文特征等因素的影響。根據(jù)

研究目標(biāo)和污染分布的空間異質(zhì)性等因素可適當(dāng)增加采樣點(diǎn)位。

河流點(diǎn)位布設(shè)原則和布設(shè)方法按照HJ1295。根據(jù)河流的寬度和深度設(shè)置采

樣點(diǎn)位，河流寬度＜50m時(shí)，在兩岸近岸水域布設(shè)2個(gè)采樣點(diǎn)，河流寬度＞50m時(shí)

在兩岸近岸水域和中間共布設(shè)3個(gè)采樣點(diǎn)，等比采集混合水樣。

湖泊、水庫(kù)點(diǎn)位布設(shè)原則和布設(shè)方法按照HJ1296o根據(jù)區(qū)域內(nèi)湖庫(kù)形態(tài)、水

文狀況、水環(huán)境質(zhì)量、水生生物分布等因素的差異，將湖庫(kù)分為不同的小區(qū)域，

如湖庫(kù)濱岸帶、沿岸帶、湖庫(kù)心區(qū)、主要河流出入口等，在每個(gè)小區(qū)域內(nèi)布設(shè)監(jiān)

測(cè)點(diǎn)位.根據(jù)監(jiān)測(cè)任務(wù)的目標(biāo)，確定每個(gè)區(qū)域的監(jiān)測(cè)點(diǎn)位數(shù)量.主要河流入口應(yīng)

設(shè)置采樣點(diǎn)，庫(kù)區(qū)每15km2~20km2應(yīng)設(shè)置不少于1個(gè)采樣點(diǎn)。將湖庫(kù)群作為整體

開(kāi)展監(jiān)測(cè)時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整監(jiān)測(cè)點(diǎn)位數(shù)量。

5.2.2監(jiān)測(cè)頻次及時(shí)間

監(jiān)測(cè)頻次及時(shí)間瓦根據(jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)而定。根據(jù)大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的生命周期、

生活史特征（如羽化期或繁殖期）、季節(jié)變化特征、監(jiān)測(cè)目的等因索確定監(jiān)測(cè)時(shí)

間。按季節(jié)監(jiān)測(cè)，可分別在春季、夏季、秋季、冬季各采樣一次。

5.2.3樣品采集

由于環(huán)境DNA的分布和擴(kuò)散受水體類(lèi)型、水體大小、水流速、地形特征、河

岸結(jié)構(gòu)、人類(lèi)活動(dòng)排放等因素影響，樣品采集時(shí)應(yīng)詳細(xì)記錄采樣點(diǎn)位、天氣、采

樣時(shí)間、采樣點(diǎn)位周邊是否有污水排口、運(yùn)輸和保存條件等信息。

按照HJ91.2,河流、湖庫(kù)岸邊采樣：河流和湖庫(kù)岸邊點(diǎn)位用采水器在水面下

0.5m范圍內(nèi)采集水樣。水深不到0.5m時(shí)，在1/2水深處采樣。河流、湖庫(kù)分層采

樣：按照HJ91.2設(shè)置監(jiān)測(cè)垂線上采樣點(diǎn)位和數(shù)量。深度35m時(shí)，在水面下0.5m

至距底0.5m范圍內(nèi)設(shè)置1個(gè)采樣點(diǎn)位。深度5m?10m時(shí)，在水面下0.5m和建底

0.5m設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)位。深度＞10m時(shí)，在水面下0.5m、1/2水深處和距底0.5m

12

設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)位?？筛鶕?jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)，充分考慮大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物特定類(lèi)群的

生活史調(diào)整分層點(diǎn)位和分層數(shù)量。

河流湖庫(kù)離岸點(diǎn)位：深度05m時(shí)，在水面下Q5m至距底0.5m范圍內(nèi)采集水

樣。水深不到0.5m時(shí)，在1/2水深處采樣。深度5nl~l（）m時(shí)，在水面下（）.5m和距

底0.5m設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)位。深度＞10m時(shí)，在水面下（）.5m、1/2水深處和距底0.5

m設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)位。

水樣采集按照HJ494的規(guī)定，每個(gè)采樣點(diǎn)平行采集3次水樣，每次采集1Lo

同時(shí)攜帶1L超純水作為采樣陰性對(duì)照，用于檢驗(yàn)采樣過(guò)程中引入的污染情;兄。

采水器采集的樣品，裝入采樣瓶中。過(guò)濾體積為1L。

2021年秋季，編制組選取北京市河流湖庫(kù)代表性點(diǎn)位，涵蓋了山區(qū)河流（水

深小于1m）的河流、平原區(qū)河流（水深小于5m）、山區(qū)湖庫(kù)（水深小于5m）。

采集了表層水、表層沉積物和大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物生物樣品，系統(tǒng)地開(kāi)展了采樣

介質(zhì)、樣品前處理研究，點(diǎn)位如表1所示。

表1采樣點(diǎn)位

樣品名點(diǎn)位責(zé)任區(qū)經(jīng)度緯度水系山區(qū)'平原河流、湖庫(kù)

J17白河9密云區(qū)116.756540.62993潮白河水系山區(qū)河流

J29莊戶溝1懷柔區(qū)116.620640,74172潮白河水系山區(qū)河流

J30湯河1懷柔區(qū)116.625340.96544潮白河水系山區(qū)河流

J31湯河3懷柔區(qū)116.661840.75674潮白河水系山區(qū)河流

J65三家店門(mén)頭溝區(qū)116.09539.95979永定河水系山區(qū)湖庫(kù)

J66門(mén)城湖豐臺(tái)區(qū)116.100639,94751永定河水系平原區(qū)湖庫(kù)

J67曉月湖豐臺(tái)區(qū)116.221239.86629永定河水系平原區(qū)湖庫(kù)

J68南大荒橋石景山區(qū)116.162639.88633永定河水系平原區(qū)河流

J69戲水灣門(mén)頭溝區(qū)116.060339.97942永定河水系山區(qū)河流

目前環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的采樣介質(zhì)主要是水樣、沉積物、

混合生物組織樣品。水樣和沉積物采樣方法按照《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)》（HJ494）,

混合生物組織采樣方法按照《生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)則-淡水底棲大型無(wú)脊椎動(dòng)

物》（HJ710.8-2014）同步采集形態(tài)學(xué)鑒定樣品挑揀后獲得混合生物組織樣品。

具體采樣方法和前處理方式如下：

采集水面下0.5m表層水樣，返回實(shí)驗(yàn)室用0.45卜im和0.22Rn纖維素濾膜,

過(guò)濾體積為ILo

沉積物采集表層沉積物（0?5cm）,應(yīng)剔除礫石、木屑、雜草、貝殼及其它

13

大體積生物殘?bào)w，收集至50ml無(wú)菌管中。經(jīng)均質(zhì)器均質(zhì)后冷凍干燥，用網(wǎng)篩過(guò)

濾雜質(zhì)并混勻。

混合生物組織樣品采集：按照HJ710.8的規(guī)定進(jìn)行定量采集與篩選大型底

棲無(wú)脊椎動(dòng)物，野外低溫保存，實(shí)驗(yàn)室-2（）°C保存。4℃解凍，瀝干水分，加入

3?5倍體積的無(wú)水乙醇（純度N99%）,1g換算為1mL,振蕩混勻，室溫靜置5

天，吸取浸出液2ml,真空離心濃縮后提取DNA。

水樣采用離心柱法和磁珠法分別提取純化基因組DNAo沉積物和混合生物

組織采用磁珠法分別提取純化基因組DNAo提取得到的DNA采用mCOIintF>

jgHCO2198引物擴(kuò)增。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，篩選出大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物類(lèi)

群并保留相對(duì)豐度占比大于千分之一的物種。

形態(tài)學(xué)鑒定到軟體動(dòng)物門(mén)、節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)21種底棲動(dòng)物?；旌?/p>

生物組織口NA樣品檢出32種底棲動(dòng)物，與形態(tài)學(xué)結(jié)果重合的有IS種.混合生

物組織的優(yōu)勢(shì)是便于和形態(tài)學(xué)結(jié)果比較，但是混合生物組織采樣是損傷性的，前

處理復(fù)雜難度大，同時(shí)也存在假陽(yáng)性等問(wèn)題。環(huán)境DNA定義是“從生物生活環(huán)境

中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含生物脫落、釋放的細(xì)胞或游離的

DNA”?；旌仙锝M織的采樣方式是從環(huán)境中分離目標(biāo)生物，不符合環(huán)境DNA的

定義。因此重點(diǎn)比較水樣和沉積物。研究結(jié)果表明，水樣和沉積物研究檢測(cè)到的

大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種水平重合度一般（圖3）,水樣檢測(cè)到的大型底棲無(wú)脊椎

動(dòng)物物種數(shù)較多。0.45pm濾膜富集的大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種數(shù)較多。提取方

式對(duì)物種組成影響較小，磁珠法提取得到的大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種數(shù)較多。

圖3大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種數(shù)比較（a:采樣介質(zhì)：b:水樣流膜孔徑：c：DNA提取方法）

2023年春季編制組選擇官?gòu)d水庫(kù)和密云水庫(kù)，系統(tǒng)研究了采樣深度和分層

取樣對(duì)結(jié)果的影響。

14

官?gòu)d水庫(kù)屬于河流型水庫(kù)，深度約為5~15m。按照HJ1296的規(guī)定，遵循與歷

史點(diǎn)位的一致性原則，設(shè)置2個(gè)近岸點(diǎn)位碼頭（G5）和月亮島（G6）,4個(gè)離岸點(diǎn)

位分別為媯1080（G1）、媯大橋（G2）、河口（G3）、壩前（G4）（圖4）。媯1080、

媯大橋、壩前三個(gè)點(diǎn)位深度在10m以上，河口點(diǎn)位深度5m左右。

按照HJ91.2,設(shè)置分層點(diǎn)位和分層數(shù)量。分表、中、底層采集樣品（在水面

下（）.5m、1/2水深處和距底（）.5m設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)位）混合樣品為表、中、底層

樣品等體積混合。媯1080（G1）、媯大橋（G2）、壩前（G4）點(diǎn)位表、中、底、

混合樣品編號(hào)分別為點(diǎn)位名稱(chēng)」、_2、_3、_4o河口點(diǎn)位深度5m左右，采集表

層和底層樣品（表層：水面下0.5m,底層：距底0.5m）以及表層和底層等體積

混合樣品。樣品編號(hào)分別為點(diǎn)位名稱(chēng)」、_2、_3c岸邊點(diǎn)位在水面下0.5m采集

表層水。每個(gè)樣品過(guò)濾1L水樣。在4個(gè)離岸點(diǎn)位媯1080（G1）、媯大橋（G2）、

河口（G3）、壩前（G4）用彼得遜采泥器采集底泥50g左右，樣品編號(hào)為點(diǎn)位名

稱(chēng)_T。mCOIintF、jgHCO2198引物擴(kuò)增。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，篩選出大

型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物類(lèi)群并保留相對(duì)豐度占比大于千分之一的物種。岸邊點(diǎn)位和分

層樣品物種分布如圖5。進(jìn)一步采用組間ANOS1M檢驗(yàn)分析分層分組間物種組

成差異，如圖6所示。分層樣品表、中、底層樣品與混合樣品之間均無(wú)顯著差異。

15

?100

圖5大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種分布

分組RP值

表層/中層-0.0260.559

表層/底層-0.0370.516

表層/混合-0.0680.633

中層/底層0.2960.076

中層/混合-0.0160.445

底層/混合0.2960.173

圖6組間ANOSIM檢驗(yàn)

密云水庫(kù)是華北地區(qū)第一大水庫(kù)。該水庫(kù)坐落在潮、白河中游偏下，系攔蓄

白河、潮河之水而成，庫(kù)區(qū)跨越兩河。水庫(kù)最高水位水面面積達(dá)到188平方公里，

水面13700（）畝，分白河，潮河、內(nèi)湖三個(gè)庫(kù)區(qū)，最大庫(kù)容量為43.75億立方米，

水深40米至60米。按照HJ1296的規(guī)定，遵循與歷史點(diǎn)位的一致性原則，設(shè)置

4個(gè)離岸采樣點(diǎn)位，分別為潮河主壩（CH）、白河主壩（BH）、庫(kù)東（KD）、庫(kù)

西（KX）,2個(gè)岸邊點(diǎn)位分別為九場(chǎng)取水口（JC）和內(nèi)湖岸邊（NH）（圖7）。

16

圖7密云水庫(kù)采樣點(diǎn)位

按照HJ91.2,設(shè)置分層點(diǎn)位和分層數(shù)量。河主壩（CH）、白河主壩（BH）、

庫(kù)東（KD）、庫(kù)西（KX）4個(gè)離岸點(diǎn)位分表、中、底層采集樣品（在水面下0.5

m、1/2水深處和距底0.5m設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)位）,混合樣品為表、中、底層樣品

等體積混合。表、中、底、混合樣品編號(hào)分別為點(diǎn)位名稱(chēng)」、_2、_3、_4。岸邊

點(diǎn)位在水面下0.5m采集表層水。每個(gè)樣品過(guò)濾1L水樣。潮河主壩（CH）、白

河主壩（BH）、庫(kù)東（KD）、庫(kù)西（KX）4個(gè)離岸點(diǎn)位用彼得遜采泥器采集底泥

50g左右，樣品編號(hào)分別為點(diǎn)位名稱(chēng)_T。mCOIintF.jgHCO2198引物擴(kuò)增。測(cè)序

數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，篩選出大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物類(lèi)群并保留相對(duì)豐度占比大于

千分之一的物種。岸邊點(diǎn)位樣品和分層樣品物種分布如圖8。采用組問(wèn)ANOSIM

檢驗(yàn)分析分層分組間物種組成差異，如圖9所示c表、中、底層樣品與混合樣品

之間均無(wú)顯著差異。

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Rnccotagc

>oo

Cna

圖8大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物物種分布

分組RP值

表層/中層-0.0190.513

表層/底層-0.1130.755

表層4昆合-0.0830.747

中層/底層-0.0360.503

中層4昆合-0.1200.743

底層，混合0.0030.397

j**'?KQ!M介

ctmwc

圖9組間ANOSIM檢驗(yàn)

綜上所屬，兼顧采樣便捷性、代表性和北京市城市河道多數(shù)為人工底質(zhì)等因

素,推薦采集水樣。采集樣品時(shí)應(yīng)先采集環(huán)境DNA樣品。

近岸點(diǎn)位：河流點(diǎn)位和湖庫(kù)岸邊點(diǎn)位用采水器在水面下0.5m范圍內(nèi)采集水

樣。水深不到0.5m時(shí)，在1/2水深處采樣。

河流、湖庫(kù)離岸點(diǎn)位按照HJ91.2,設(shè)置分層點(diǎn)位和分層數(shù)量。深度W5m時(shí)，

在水面下().5m至距底0.5m范圍內(nèi)采集水樣。水深不到().5m時(shí)，在1/2水深

處采樣。深度5m~10m時(shí)，在水面下0.5m和距底0.5m設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)位，深

度＞10m時(shí)，在水面下0.5m、1/2水深處和距底0.5m設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)位。建議

根據(jù)研究目標(biāo)設(shè)置分層數(shù)量，采集分層水樣或分層混合水樣。條件具備時(shí)，在同

一點(diǎn)位也可補(bǔ)充采集沉積物樣品，沉積物樣品采樣和前處理方式見(jiàn)附錄C,沉積

18

物監(jiān)測(cè)結(jié)果可與水樣合并使用。

5.2.4環(huán)境DNA富集

選擇大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種類(lèi)較豐富的北京市房山拒馬河水生野生動(dòng)物自

然保護(hù)區(qū)內(nèi)五渡點(diǎn)位采集原位沉積物并挑揀出大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物，形態(tài)學(xué)分類(lèi)

鑒定到扁蜉科(優(yōu)勢(shì)種)、直突搖蚊屬、搖蚊屬、梨形環(huán)棱螺、蛻科、蛭綱、蜻

科。返回實(shí)驗(yàn)室將原位沉積物和大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物放入水箱中，加入無(wú)菌水飼

養(yǎng)15天后開(kāi)展模擬實(shí)驗(yàn)。采用10種不同材質(zhì)和孔徑的濾膜富集環(huán)境DNA,如

表2所示。探討過(guò)濾體積和濾膜材質(zhì)、孔徑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

表2濾膜孔徑和材質(zhì)

序號(hào)材質(zhì)孔徑(pm)備注

SD_1混合纖維素酯(MCE)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_2混合纖維素酯(MCE)0.8國(guó)產(chǎn)

SD_3聚四氟乙烯(PTFE)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_4聚偏二氟乙烯膜(PVDF)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_5聚丙稀(PP)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_6尼龍(NY66)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_7聚酸颯(PES)0.45國(guó)產(chǎn)

SD_8聚醛碉(PES)0.45進(jìn)口

SD_9聚酸颯(PES)0.2進(jìn)口

SD_10玻璃纖維(GF)0.6進(jìn)口

水樣分別過(guò)濾0.5L和IL,mCOIintF、jgHCO2198引物擴(kuò)增。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)

質(zhì)控過(guò)濾后，篩選出大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物類(lèi)群并保留相對(duì)豐度占比大于千分之一

的物種。共鑒定到大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物22屬，隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)的腹足綱和瓣

鯉綱，環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的寡毛綱，節(jié)肢動(dòng)物門(mén)的昆蟲(chóng)綱、蛛形綱、甲殼綱，如表3所

ZJNo

表3物種名錄

門(mén)綱目科屬genus

軟體動(dòng)物門(mén)腹足綱基眼目椎實(shí)螺科蘿卜螺屬Radix

軟體動(dòng)物門(mén)瓣鰥綱真瓣鯉H姆科現(xiàn)屬Corbicula

軟體動(dòng)物門(mén)腹足綱基眼目膀胱螺科膀胱螺屬Physa

軟體動(dòng)物門(mén)腹足綱中腹足目斛螺科狹口螺屬Stcnothyra

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目顫蚓科水絲蚓屬Limnodrilus

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目仙女蟲(chóng)科仙女蟲(chóng)屬Nais

19

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目仙女蟲(chóng)科尾盤(pán)蟲(chóng)屬Dero

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)其毛綱顫蚓目顫蚓科顫蚓屬Tubifex

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目仙女蟲(chóng)科頭鯉蚓屬Branchiodrilus

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目顫蚓科尾鯉蚓屬Branchiura

環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱顫蚓目顫蚓科河蚓屬Rhyacodrilus

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜻蜓目蜻科赤蜻屬Sympetrum

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜉蜥目四節(jié)蜉科原二翅搖蚊Procloeon

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜻蜓目春蜓科葉春蜓Ictinogomphus

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱稹翅目稹科襟稹屬Togoperla

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜻蜓目蜻科灰蜻屬Orthetrum

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱毛翅目紋石蛾科紋石蛾屬Hydropsyche

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜻蜓目春蜓科小葉春蜓屬Gomphidia

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱毛翅目長(zhǎng)角石蛾科須長(zhǎng)角石蛾屬M(fèi)ystacides

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜉蟠目蜉蜥科蜉蜻屬Ephemera

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)蛛形綱蜘蛛目肖靖科肖峭屬Tetragnatha

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱端足目鉤蝦科鉤蝦Gamniarus

過(guò)濾體積和濾膜對(duì)樣晶檢出物種的影響如區(qū)10.11所示，可以看出采用

0.45pm孔徑，混合纖維素酯濾膜過(guò)濾1L水樣，物種檢出數(shù)比較穩(wěn)定。

圖io大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種數(shù)

20

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