cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束：黑色素瘤治療的創(chuàng)新策略與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在中國，黑色素瘤的發(fā)病率雖相對較低，但由于人口基數(shù)龐大，患者的絕對數(shù)量并不少，且每年新增患者約2萬人，給患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。黑色素瘤具有極高的惡性程度和侵襲性，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，且對傳統(tǒng)的化療和放療手段極不敏感。化療藥物的金標(biāo)準(zhǔn)達(dá)卡巴嗪單藥的有效率僅為7.5%-12.2%，無進(jìn)展生存（PFS）不到2個月，平均總生存（OS）僅為6.2個月。這些現(xiàn)狀表明，黑色素瘤的治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)，亟待開發(fā)更為有效的治療方法和藥物遞送系統(tǒng)。安羅替尼作為一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，在黑色素瘤的治療中展現(xiàn)出了一定的潛力。其主要作用機(jī)制是通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體及成纖維細(xì)胞生長因子受體的活性，有效抑制腫瘤新生血管的形成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤生長和擴(kuò)散的目的。臨床研究表明，安羅替尼能夠緩解黑色素瘤患者的癥狀，改善生活質(zhì)量，為黑色素瘤的治療提供了新的選擇。然而，安羅替尼在臨床應(yīng)用中也面臨著一些問題，如藥物的溶解度低，導(dǎo)致其生物利用度不高；在體內(nèi)缺乏靶向性，容易對正常組織產(chǎn)生毒副作用，限制了其治療效果和臨床應(yīng)用。為了克服這些問題，本研究引入了cRGD靶向膠束和還原敏感技術(shù)。cRGD肽是一種特異性的靶向肽，能夠高效地結(jié)合到整合素受體αvβ3和αvβ5上，而這些受體在腫瘤細(xì)胞和新生血管細(xì)胞上高度表達(dá)。因此，cRGD靶向膠束能夠特異性地將藥物輸送到腫瘤部位，提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)治療效果。同時，膠束表面的cRGD肽具有高親和力和穩(wěn)定性，能夠在體內(nèi)保持較長時間的活性，且具有低免疫原性，使其在體內(nèi)應(yīng)用中更為安全。此外，還原敏感膠束能夠響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高還原環(huán)境，在到達(dá)腫瘤細(xì)胞后迅速釋放藥物，實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)釋放，進(jìn)一步提高藥物的療效，減少對正常組織的損傷。構(gòu)建cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束具有重要的研究意義。從治療效果來看，該膠束系統(tǒng)能夠顯著提高安羅替尼在腫瘤部位的富集，增強(qiáng)對黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用，有望提高黑色素瘤的治療效果，延長患者的生存期。從藥物安全性角度出發(fā)，通過靶向遞送和精準(zhǔn)釋放，能夠減少藥物在正常組織中的分布，降低藥物的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。從臨床應(yīng)用前景考慮，這種新型的藥物遞送系統(tǒng)為黑色素瘤的治療提供了一種創(chuàng)新的策略，有望為臨床治療帶來新的突破，具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，其治療一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。在過去的幾十年中，黑色素瘤的治療取得了顯著的進(jìn)展，從傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療，逐漸發(fā)展到靶向治療、免疫治療等多種新型治療手段。在黑色素瘤的治療方面，傳統(tǒng)的手術(shù)治療主要適用于早期黑色素瘤患者，通過切除腫瘤組織來達(dá)到治療目的。然而，對于晚期黑色素瘤患者，手術(shù)治療的效果往往有限?；熓呛谏亓鲋委煹闹匾侄沃唬捎诤谏亓黾?xì)胞對化療藥物的耐藥性較高，化療的有效率較低。放療在黑色素瘤的治療中也有一定的應(yīng)用，主要用于緩解癥狀和控制局部腫瘤生長。近年來，隨著對黑色素瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究，靶向治療和免疫治療成為了黑色素瘤治療的新熱點(diǎn)。靶向治療藥物如BRAF抑制劑、MEK抑制劑等，能夠特異性地作用于黑色素瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，顯著提高了治療效果。免疫治療藥物如PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑等，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，為黑色素瘤患者帶來了新的希望。一項發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》的研究顯示，Ipilimumab（一種CTLA-4抑制劑）聯(lián)合達(dá)卡巴嗪作為一線治療較達(dá)卡巴嗪單藥組延長患者的總生存期近2倍。然而，這些治療方法仍存在一些問題，如靶向治療藥物的耐藥性問題，免疫治療藥物的有效率有限、不良反應(yīng)較大等。安羅替尼作為一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，在黑色素瘤的治療中展現(xiàn)出了一定的潛力。其主要作用機(jī)制是通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體及成纖維細(xì)胞生長因子受體的活性，有效抑制腫瘤新生血管的形成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤生長和擴(kuò)散的目的。臨床研究表明，安羅替尼能夠緩解黑色素瘤患者的癥狀，改善生活質(zhì)量，為黑色素瘤的治療提供了新的選擇。在一項針對晚期黑色素瘤患者的臨床試驗中，安羅替尼治療組的無進(jìn)展生存期和總生存期均優(yōu)于對照組。然而，安羅替尼在臨床應(yīng)用中也面臨著一些問題，如藥物的溶解度低，導(dǎo)致其生物利用度不高；在體內(nèi)缺乏靶向性，容易對正常組織產(chǎn)生毒副作用，限制了其治療效果和臨床應(yīng)用。cRGD靶向膠束作為一種新型的藥物遞送系統(tǒng)，近年來受到了廣泛的關(guān)注。cRGD肽能夠特異性地結(jié)合到整合素受體αvβ3和αvβ5上，而這些受體在腫瘤細(xì)胞和新生血管細(xì)胞上高度表達(dá)。因此，cRGD靶向膠束能夠特異性地將藥物輸送到腫瘤部位，提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)治療效果。同時，膠束表面的cRGD肽具有高親和力和穩(wěn)定性，能夠在體內(nèi)保持較長時間的活性，且具有低免疫原性，使其在體內(nèi)應(yīng)用中更為安全。在一些研究中，cRGD靶向膠束被成功應(yīng)用于抗腫瘤藥物的遞送，顯著提高了藥物的療效，減少了藥物的毒副作用。然而，目前將cRGD靶向膠束應(yīng)用于安羅替尼遞送的研究較少，尤其是針對黑色素瘤的治療研究更為缺乏。綜上所述，目前黑色素瘤的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。安羅替尼作為一種有潛力的治療藥物，在臨床應(yīng)用中存在一些問題。cRGD靶向膠束作為一種新型的藥物遞送系統(tǒng)，具有良好的應(yīng)用前景，但在安羅替尼遞送和黑色素瘤治療方面的研究還存在不足。因此，構(gòu)建cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束治療黑色素瘤的研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，有望為黑色素瘤的治療提供新的策略和方法。1.3研究內(nèi)容與方法本研究圍繞構(gòu)建cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束展開，具體內(nèi)容與方法如下：制備cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束：運(yùn)用化學(xué)合成的方法，將聚乙二醇（PEG）、二硫鍵、硬脂胺（SA）以及cRGD肽進(jìn)行連接，成功合成cRGD-PEG-SS-SA聚合物。隨后，采用薄膜-水化法，將cRGD-PEG-SS-SA聚合物與安羅替尼進(jìn)行混合，精心制備出cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束。在合成過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，如溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物比例等，以確保聚合物的質(zhì)量和性能。在制備膠束時，精確控制各成分的用量，以保證膠束的穩(wěn)定性和載藥效率。研究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束的性能：使用動態(tài)光散射儀（DLS）對膠束的粒徑和電位進(jìn)行精確測量，以了解膠束的大小和表面電荷性質(zhì)。運(yùn)用透射電子顯微鏡（TEM）對膠束的形態(tài)進(jìn)行細(xì)致觀察，直觀呈現(xiàn)膠束的外觀結(jié)構(gòu)。通過透析法對膠束的載藥量和包封率進(jìn)行準(zhǔn)確測定，評估膠束對安羅替尼的負(fù)載能力。利用紫外-可見分光光度計（UV-Vis）對膠束在不同還原環(huán)境下的藥物釋放行為進(jìn)行深入研究，明確膠束的還原敏感特性。在測量過程中，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞實驗：選取人黑色素瘤細(xì)胞A375作為研究對象，采用MTT法對膠束的細(xì)胞毒性進(jìn)行全面評價，了解膠束對細(xì)胞生長的抑制作用。通過細(xì)胞攝取實驗，運(yùn)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)，深入研究膠束在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況，明確膠束進(jìn)入細(xì)胞的效率和途徑。在細(xì)胞實驗中，設(shè)置多個實驗組和對照組，嚴(yán)格控制實驗條件，確保實驗結(jié)果的科學(xué)性和可重復(fù)性。動物實驗：構(gòu)建人黑色素瘤裸鼠移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為多個組，分別給予不同的處理，如生理鹽水、安羅替尼溶液、cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束等。定期測量腫瘤體積和體重，密切觀察腫瘤的生長情況和動物的健康狀況。實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進(jìn)行病理分析，通過蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學(xué)染色等方法，深入研究膠束的抗腫瘤效果和對腫瘤組織的影響。在動物實驗中，嚴(yán)格遵守動物實驗倫理規(guī)范，給予動物良好的飼養(yǎng)環(huán)境和護(hù)理。二、黑色素瘤概述2.1黑色素瘤的病理特征黑色素瘤的病理特征呈現(xiàn)出多樣化且復(fù)雜的特點(diǎn)，這些特征對于疾病的診斷、治療以及預(yù)后評估均具有至關(guān)重要的意義。黑色素瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上具有顯著的異型性，其形態(tài)多種多樣，常見的有上皮樣、梭形、氣球樣等。上皮樣細(xì)胞通常呈多邊形，胞質(zhì)豐富且嗜酸性，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯；梭形細(xì)胞則呈長梭形，細(xì)胞核細(xì)長，兩端尖細(xì)；氣球樣細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核相對較小且位于細(xì)胞中央。這些不同形態(tài)的細(xì)胞可單獨(dú)存在，也可混合出現(xiàn)于同一腫瘤組織中，為黑色素瘤的診斷帶來了一定的挑戰(zhàn)。在組織學(xué)方面，黑色素瘤細(xì)胞的排列方式也極為多樣，可呈巢狀、條索狀、腺樣或彌漫性分布。巢狀排列時，細(xì)胞聚集形成大小不等的細(xì)胞巢，巢與巢之間由纖維組織分隔；條索狀排列則表現(xiàn)為細(xì)胞呈條索狀相互連接，穿插于間質(zhì)之中；腺樣排列的細(xì)胞可形成類似腺體的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部可見管腔樣空隙；彌漫性分布時，細(xì)胞則無規(guī)律地分散在間質(zhì)內(nèi)。此外，黑色素瘤細(xì)胞還常伴有明顯的核分裂象，這是其惡性程度高的重要標(biāo)志之一，核分裂象的多少與腫瘤的侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)。黑色素瘤的病理類型主要包括淺表擴(kuò)散型、結(jié)節(jié)型、惡性雀斑樣痣型和肢端雀斑樣痣型。淺表擴(kuò)散型黑色素瘤最為常見，約占所有黑色素瘤的70%。其多發(fā)生于暴露部位的皮膚，如頭頸部、四肢等。早期表現(xiàn)為扁平或稍隆起的斑片，顏色不均勻，可呈褐色、黑色、粉紅色或白色等，邊界不規(guī)則。隨著病情進(jìn)展，腫瘤可逐漸增厚，并向周圍皮膚擴(kuò)散。結(jié)節(jié)型黑色素瘤的惡性程度較高，約占黑色素瘤的15%-30%。通常表現(xiàn)為迅速生長的結(jié)節(jié)，顏色多為黑色或藍(lán)黑色，質(zhì)地較硬，表面可出現(xiàn)潰瘍、出血等癥狀。該型黑色素瘤生長迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性雀斑樣痣型黑色素瘤好發(fā)于老年人的曝光部位，如面部、手背等。其病程較為緩慢，初期表現(xiàn)為邊界不清的色素斑，顏色深淺不一，可逐漸擴(kuò)大并融合。經(jīng)過數(shù)年甚至數(shù)十年的發(fā)展，才可能發(fā)生惡變，形成侵襲性腫瘤。肢端雀斑樣痣型黑色素瘤在中國等亞洲國家較為常見，約占黑色素瘤的50%。多發(fā)生于手掌、足底、甲下等肢端部位。早期表現(xiàn)為肢端的色素沉著斑，邊界不規(guī)則，顏色可呈棕色、黑色或褐色等。由于這些部位的特殊性，早期診斷較為困難，且該型黑色素瘤容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差。黑色素瘤具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，可通過淋巴道和血道進(jìn)行轉(zhuǎn)移。淋巴道轉(zhuǎn)移是黑色素瘤常見的轉(zhuǎn)移途徑之一，腫瘤細(xì)胞可先轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大、質(zhì)地變硬。隨著病情的發(fā)展，癌細(xì)胞可進(jìn)一步通過淋巴管擴(kuò)散至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)。血道轉(zhuǎn)移則可使腫瘤細(xì)胞播散至全身各個器官，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、肝、腦、骨等。肺轉(zhuǎn)移時，患者可出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀；肝轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致肝功能異常，出現(xiàn)黃疸、腹水、肝區(qū)疼痛等表現(xiàn)；腦轉(zhuǎn)移常引起頭痛、嘔吐、偏癱、癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；骨轉(zhuǎn)移則可導(dǎo)致骨痛、病理性骨折等。轉(zhuǎn)移灶的病理特征與原發(fā)灶基本相似，但在形態(tài)和免疫組化表達(dá)上可能會存在一定的差異。免疫組化是診斷黑色素瘤的重要輔助手段之一，黑色素瘤細(xì)胞通常表達(dá)S-100、HMB-45、Melan-A等特異性標(biāo)志物。S-100是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，在黑色素細(xì)胞及其腫瘤中廣泛表達(dá)，其敏感性較高，但特異性相對較低，除黑色素瘤外，還可在神經(jīng)源性腫瘤、脂肪肉瘤等多種腫瘤中表達(dá)。HMB-45是黑色素瘤特異性的標(biāo)志物，主要表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞的前黑素小體上，對黑色素瘤的診斷具有較高的特異性，但在一些良性黑色素細(xì)胞病變中也可能呈弱陽性表達(dá)。Melan-A又稱小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF），也是黑色素瘤的特異性標(biāo)志物之一，其在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有較高的敏感性和特異性。此外，根據(jù)黑色素瘤病理表現(xiàn)的不同，可進(jìn)行組織病理分級，常用的分級方法包括Clark分級和Breslow厚度測量。Clark分級主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞侵犯皮膚的層次進(jìn)行分級，共分為五級：I級為原位黑色素瘤，腫瘤細(xì)胞局限于表皮層內(nèi)；II級為腫瘤細(xì)胞浸潤至真皮乳頭層；III級為腫瘤細(xì)胞充滿并擴(kuò)大真皮乳頭層；IV級為腫瘤細(xì)胞浸潤至真皮網(wǎng)狀層；V級為腫瘤細(xì)胞浸潤至皮下脂肪組織。Clark分級越高，表明腫瘤的侵襲性越強(qiáng)，預(yù)后越差。Breslow厚度則是通過測量腫瘤表面至浸潤最深部位的垂直距離來評估腫瘤的厚度，厚度越厚，患者的預(yù)后越差。一般來說，Breslow厚度小于1mm的患者，預(yù)后相對較好；而厚度大于4mm的患者，預(yù)后則較差。這些分級方法對于指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后具有重要的參考價值。2.2黑色素瘤的治療現(xiàn)狀黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，其治療方法在過去幾十年中經(jīng)歷了顯著的發(fā)展和演變。目前，黑色素瘤的治療主要包括手術(shù)治療、化療、放療、免疫治療和靶向治療等多種方法，每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)。手術(shù)治療是早期黑色素瘤的主要治療手段，通過完整切除腫瘤組織，有望實現(xiàn)根治。對于原位黑色素瘤或腫瘤厚度較?。˙reslow厚度小于1mm）的患者，手術(shù)切除的治愈率較高。然而，手術(shù)治療存在一定的局限性，對于晚期黑色素瘤患者，尤其是已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)往往無法徹底清除腫瘤細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷可能對患者的身體狀況造成較大影響，術(shù)后恢復(fù)時間較長，還可能出現(xiàn)感染、出血等并發(fā)癥?；熢诤谏亓龅闹委熤幸舱紦?jù)一定的地位，常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺等?；熕幬锿ㄟ^抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成或干擾細(xì)胞代謝過程，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。然而，黑色素瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性較高，導(dǎo)致化療的有效率相對較低。一項研究表明，達(dá)卡巴嗪單藥治療黑色素瘤的有效率僅為10%-20%，且化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療是利用高能射線對腫瘤組織進(jìn)行照射，破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂。放療主要用于緩解黑色素瘤患者的局部癥狀，如骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛、腦轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的顱內(nèi)壓增高等。對于一些無法手術(shù)切除的局部晚期黑色素瘤，放療也可作為一種局部控制手段。然而，放療同樣存在局限性，它對正常組織也會產(chǎn)生一定的輻射損傷，可能導(dǎo)致皮膚損傷、放射性肺炎、放射性腸炎等并發(fā)癥。而且，黑色素瘤細(xì)胞對放療的敏感性相對較低，單純放療的效果往往不理想，通常需要與其他治療方法聯(lián)合使用。免疫治療是近年來黑色素瘤治療領(lǐng)域的重大突破，主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑和過繼性細(xì)胞免疫治療等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如PD-1抑制劑（帕博利珠單抗、納武利尤單抗）和CTLA-4抑制劑（伊匹木單抗），通過阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白，解除腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制，激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞。免疫治療在黑色素瘤的治療中取得了顯著的療效，顯著延長了患者的生存期。然而，免疫治療并非對所有患者都有效，其有效率在30%-50%左右，且可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎、免疫性甲狀腺炎等，嚴(yán)重時甚至危及生命。靶向治療是針對黑色素瘤細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)，如BRAF、MEK、KIT等基因突變，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療。BRAF抑制劑（維莫非尼、達(dá)拉非尼）和MEK抑制劑（曲美替尼、考比替尼）聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著提高BRAFV600突變陽性黑色素瘤患者的治療效果，有效率可達(dá)60%-70%。靶向治療具有特異性強(qiáng)、療效顯著、不良反應(yīng)相對較輕等優(yōu)點(diǎn)。但是，靶向治療也面臨著耐藥性問題，大多數(shù)患者在治療一段時間后會出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展。當(dāng)前黑色素瘤的治療雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，各種治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療難以徹底清除晚期腫瘤細(xì)胞，化療和放療的有效率低且副作用大，免疫治療有效率有限且可能引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，靶向治療存在耐藥性問題。因此，開發(fā)更為有效的治療方法和藥物遞送系統(tǒng)，提高黑色素瘤的治療效果，降低治療的毒副作用，成為了黑色素瘤治療領(lǐng)域亟待解決的問題。構(gòu)建cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束，有望通過靶向遞送和精準(zhǔn)釋放藥物，提高藥物在腫瘤部位的濃度，增強(qiáng)治療效果，為黑色素瘤的治療提供新的策略和方法。三、cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束的構(gòu)建3.1cRGD的靶向原理cRGD的靶向作用主要基于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)以及與腫瘤細(xì)胞表面特定受體的特異性相互作用。cRGD是一種環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽，其核心序列RGD在介導(dǎo)細(xì)胞粘附和識別過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，而在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞表面，αvβ3整合素受體呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。αvβ3整合素是一種跨膜蛋白受體，由αv和β3亞基組成，其在細(xì)胞的粘附、遷移、侵襲以及新生血管形成等生物過程中扮演著至關(guān)重要的角色。cRGD肽中的RGD序列能夠與αvβ3整合素受體的特定結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性結(jié)合，這種結(jié)合具有高度的親和力和選擇性。當(dāng)cRGD修飾在膠束表面時，膠束通過血液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織附近，cRGD憑借其與αvβ3整合素受體的特異性結(jié)合能力，能夠準(zhǔn)確地識別并結(jié)合到腫瘤細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的αvβ3整合素受體上。從分子層面來看，RGD序列中的精氨酸（R）、甘氨酸（G）和天冬氨酸（D）三個氨基酸殘基的排列順序和空間構(gòu)象，與αvβ3整合素受體的配體結(jié)合位點(diǎn)高度互補(bǔ)。精氨酸的胍基、天冬氨酸的羧基等基團(tuán)與αvβ3整合素受體上的相應(yīng)位點(diǎn)形成氫鍵、離子鍵等非共價相互作用，從而實現(xiàn)cRGD與αvβ3整合素受體的緊密結(jié)合。這種特異性結(jié)合使得cRGD修飾的膠束能夠有效地富集在腫瘤部位，實現(xiàn)藥物的靶向遞送。與傳統(tǒng)的非靶向藥物遞送系統(tǒng)相比，cRGD靶向膠束能夠顯著提高藥物在腫瘤組織中的濃度，減少藥物在正常組織中的分布，從而增強(qiáng)治療效果，降低藥物的毒副作用。在黑色素瘤的治療中，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠?qū)擦_替尼精準(zhǔn)地輸送到黑色素瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管周圍，提高安羅替尼對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時減少對正常細(xì)胞的損傷，為黑色素瘤的治療提供了一種更高效、更安全的策略。3.2還原敏感膠束的設(shè)計思路腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境與正常細(xì)胞存在顯著差異，其中高濃度的還原物質(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽（GSH）的濃度通?？蛇_(dá)到2-10mM，約為細(xì)胞外環(huán)境（2-20μM）的100-1000倍，這種高濃度的GSH使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出強(qiáng)還原環(huán)境?；诖耍狙芯吭O(shè)計了一種還原敏感膠束，旨在利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高還原環(huán)境，實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)釋放。本研究通過在膠束的結(jié)構(gòu)中引入二硫鍵（-S-S-）來構(gòu)建還原敏感膠束。二硫鍵是一種對還原環(huán)境敏感的化學(xué)鍵，在腫瘤細(xì)胞外的弱氧化環(huán)境中，二硫鍵保持穩(wěn)定，使得膠束結(jié)構(gòu)完整，能夠有效地包裹藥物，減少藥物在血液循環(huán)過程中的提前釋放，降低對正常組織的毒副作用。當(dāng)還原敏感膠束通過cRGD的靶向作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH能夠與二硫鍵發(fā)生氧化還原反應(yīng)。GSH中的巰基（-SH）具有較強(qiáng)的還原性，能夠?qū)⒍蜴I還原斷裂，生成兩個巰基。隨著二硫鍵的斷裂，膠束的結(jié)構(gòu)遭到破壞，原本被包裹在膠束內(nèi)部的安羅替尼得以快速釋放，從而提高藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。從作用機(jī)制上看，這種還原敏感釋放方式能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性激活，避免了藥物在正常組織中的不必要釋放，提高了藥物的治療指數(shù)。與傳統(tǒng)的非敏感膠束相比，還原敏感膠束能夠更加精準(zhǔn)地響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境變化，實現(xiàn)藥物的可控釋放，為提高藥物療效和降低毒副作用提供了有力的保障。在黑色素瘤的治療中，還原敏感膠束能夠使安羅替尼在黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)迅速釋放，有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，為黑色素瘤的治療提供了一種更為高效、安全的藥物遞送策略。3.3膠束的制備方法3.3.1含二硫鍵聚乙二醇-硬脂胺（mPEG-SS-C18）的合成在合成含二硫鍵聚乙二醇-硬脂胺（mPEG-SS-C18）時，精確稱取3,3'-二硫代二丙酸、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）以及4-二甲氨基吡啶（DMAP），將其充分溶于四氫呋喃（THF）有機(jī)溶劑中。在室溫下，以200-300r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌反應(yīng)8-12小時，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，通過過濾去除反應(yīng)生成的不溶性雜質(zhì)，保留濾液。稱取硬脂胺（ODA），將其溶解于適量的THF中，隨后以緩慢的速度滴入上述保留的濾液中，在滴加過程中持續(xù)攪拌，滴加時間控制在30-60分鐘。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12-24小時，以使反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，采用柱色譜法進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，旋蒸除去溶劑，得到中間產(chǎn)物1。稱取上述得到的中間產(chǎn)物1，并與N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）再次溶于THF中，在室溫下攪拌反應(yīng)8-12小時。反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除雜質(zhì)，保留濾液。稱取聚乙二醇（mPEG），將其溶解于THF中，緩慢滴入上述保留的濾液中，滴加時間控制在30-60分鐘，滴加過程中持續(xù)攪拌。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12-24小時。反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除不溶性雜質(zhì)，濃縮濾液。將濃縮后的濾液緩慢滴入冷乙醚中，邊滴加邊攪拌，此時會有白色固體析出。收集沉淀，用冷乙醚洗滌3-5次，以去除雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀在真空干燥箱中干燥24-48小時，使其充分干燥。干燥后的產(chǎn)物加水使其溶解，轉(zhuǎn)移至截留分子量為2000的透析袋內(nèi)，將透析袋置于蒸餾水中透析48-72小時，每隔8-12小時更換一次蒸餾水，以去除未反應(yīng)的小分子雜質(zhì)。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液凍干，得到白色粉末狀的mPEG-SS-C18聚合物。3.3.2含cRGD聚乙二醇-硬脂胺（cRGD-PEG-C18）的合成稱取硬脂胺（ODA）和馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酰亞胺酯（Mal-PEG-NHS），分別將它們配制成濃度為0.1-0.2mol/L的溶液，溶劑為無水二氯甲烷。將其中一份溶液逐滴加到另一份溶液中，滴加過程中加入適量的三乙胺（TEA）作為催化劑，三乙胺的用量為硬脂胺物質(zhì)的量的1.5-2.0倍。在室溫下攪拌反應(yīng)12-24小時，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，旋干反應(yīng)液，去除二氯甲烷溶劑。向旋干后的產(chǎn)物中加入適量蒸餾水，使其溶解，轉(zhuǎn)移至截留分子量為2000的透析袋內(nèi)，將透析袋置于蒸餾水中透析24-48小時，每隔8-12小時更換一次蒸餾水，以去除未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液凍干，得到Mal-PEG-C18聚合物。稱取cRGD多肽和上述得到的Mal-PEG-C18聚合物，按照物質(zhì)的量之比為1.2-1.5:1的比例共溶于蒸餾水中，在室溫下攪拌反應(yīng)8-12小時，使cRGD多肽與Mal-PEG-C18聚合物充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為2000的透析袋內(nèi)，將透析袋置于蒸餾水中透析24-48小時，每隔8-12小時更換一次蒸餾水，以去除未反應(yīng)的cRGD多肽和其他雜質(zhì)。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液凍干，得到cRGD-PEG-C18聚合物。3.3.3cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束的制備采用薄膜-水化法制備cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束。精確稱取一定量的cRGD-PEG-C18聚合物和mPEG-SS-C18聚合物，按照質(zhì)量比為3:1-5:1的比例混合，加入適量的甲醇使其完全溶解。再稱取適量的安羅替尼，加入到上述聚合物溶液中，使安羅替尼與聚合物的質(zhì)量比為1:10-1:20，超聲振蕩10-20分鐘，使安羅替尼充分溶解。將上述溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄形瓶中，在40-50℃的溫度下，以100-150r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲醇溶劑，在茄形瓶內(nèi)壁形成一層均勻的薄膜。向茄形瓶中加入適量的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4），使薄膜充分水化，水化時間為1-2小時。水化結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移至超聲細(xì)胞破碎儀中，在功率為200-300W的條件下超聲處理10-20分鐘，使膠束分散均勻。將得到的膠束溶液通過0.22μm的微孔濾膜過濾，去除未分散的大顆粒物質(zhì)，得到cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束溶液，備用。3.4膠束的表征與性能測試3.4.1膠束形態(tài)與粒徑表征將制備得到的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束稀釋至適當(dāng)濃度，取適量稀釋后的膠束溶液滴于覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，自然晾干或用濾紙輕輕吸干多余液體，以確保膠束在銅網(wǎng)上均勻分布且無多余水分干擾觀察。隨后，將銅網(wǎng)置于透射電子顯微鏡（TEM）中，在加速電壓為80-120kV的條件下進(jìn)行觀察。通過TEM成像，能夠清晰地觀察到膠束的微觀形態(tài)，判斷其是否呈規(guī)則的球形或其他預(yù)期形狀，以及膠束的分散狀態(tài)是否良好，有無團(tuán)聚現(xiàn)象。從TEM圖像中選取多個具有代表性的膠束，使用圖像分析軟件測量其粒徑大小，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以準(zhǔn)確獲取膠束的粒徑分布情況。運(yùn)用動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)對膠束的粒徑和Zeta電位進(jìn)行精確測量。將膠束溶液裝入干凈的樣品池中，確保溶液中無氣泡和雜質(zhì)，以免影響測量結(jié)果。將樣品池放入動態(tài)光散射儀中，設(shè)置測量溫度為25℃，這是模擬人體生理溫度的常用條件，能夠更真實地反映膠束在體內(nèi)的狀態(tài)。在測量過程中，儀器發(fā)射的激光照射到膠束溶液中的膠束粒子上，膠束粒子會散射激光，由于膠束粒子的布朗運(yùn)動，散射光的強(qiáng)度會隨時間發(fā)生波動。動態(tài)光散射儀通過檢測散射光強(qiáng)度的波動情況，利用相關(guān)算法計算出膠束的粒徑大小及其分布。同時，儀器還能測量膠束表面的電荷情況，從而得到膠束的Zeta電位。多次測量取平均值，以提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。一般來說，粒徑較小且分布均勻的膠束有利于其在體內(nèi)的循環(huán)和滲透，能夠更好地到達(dá)腫瘤部位；而Zeta電位的絕對值較大，表明膠束表面電荷密度較高，膠束之間的靜電排斥作用較強(qiáng)，從而使膠束在溶液中具有更好的穩(wěn)定性，不易發(fā)生團(tuán)聚。3.4.2膠束穩(wěn)定性研究為了考察cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束的穩(wěn)定性，將制備好的膠束溶液置于不同的條件下進(jìn)行觀察和分析。首先，將膠束溶液分別置于4℃冷藏和25℃室溫環(huán)境中保存，定期（如1天、3天、7天、14天、21天等）取出部分溶液，使用動態(tài)光散射儀測量其粒徑和Zeta電位的變化情況。在不同時間點(diǎn)，觀察粒徑是否發(fā)生明顯的增大或減小，以及Zeta電位是否保持相對穩(wěn)定。如果粒徑在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，且Zeta電位變化較小，說明膠束在該溫度條件下具有較好的物理穩(wěn)定性。將膠束溶液與不同的介質(zhì)混合，如生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液等，觀察膠束在這些介質(zhì)中的穩(wěn)定性。以與生理鹽水混合為例，將膠束溶液與生理鹽水按照一定比例（如1:1、1:5、1:10等）混合均勻，在不同時間點(diǎn)（0小時、1小時、2小時、4小時、8小時等）使用動態(tài)光散射儀測量混合溶液中膠束的粒徑和Zeta電位。同時，通過肉眼觀察混合溶液是否出現(xiàn)渾濁、沉淀等現(xiàn)象，以判斷膠束是否發(fā)生聚集或沉淀。如果在與不同介質(zhì)混合后，膠束的粒徑和Zeta電位變化不大，且溶液未出現(xiàn)渾濁、沉淀等異?，F(xiàn)象，表明膠束在不同介質(zhì)中具有較好的相容性和穩(wěn)定性。3.4.3藥物釋放行為研究采用透析法研究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束在不同環(huán)境下的藥物釋放行為。首先，將適量的膠束溶液裝入截留分子量為1000-3000Da的透析袋中，扎緊透析袋兩端，確保溶液不會泄漏。將透析袋放入裝有一定體積釋放介質(zhì)的容器中，釋放介質(zhì)根據(jù)研究目的選擇不同的溶液，如pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）模擬正常生理環(huán)境，pH5.0的PBS模擬腫瘤細(xì)胞外微酸性環(huán)境，以及含有10mM谷胱甘肽（GSH）的pH7.4PBS模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高還原環(huán)境。將裝有透析袋的容器置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為37℃，振蕩速度為100-150r/min，以模擬人體生理條件下的血液循環(huán)和代謝過程。在預(yù)定的時間點(diǎn)（如0.5小時、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時等），取出一定體積的釋放介質(zhì)，同時補(bǔ)充等量的新鮮釋放介質(zhì)，以保持釋放介質(zhì)的濃度恒定。使用紫外-可見分光光度計在安羅替尼的最大吸收波長處測量取出的釋放介質(zhì)中藥物的濃度，通過計算累積釋放量來繪制藥物釋放曲線。根據(jù)藥物釋放曲線，可以直觀地了解膠束在不同環(huán)境下的藥物釋放速率和釋放程度，評估膠束的還原敏感特性和藥物釋放的可控性。3.4.4包封率與載藥量測定采用高效液相色譜（HPLC）法測定cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束的包封率和載藥量。首先，制備一系列不同濃度的安羅替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用HPLC進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，安羅替尼濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，用于后續(xù)樣品中安羅替尼含量的計算。取適量的膠束溶液，加入適量的甲醇或其他能夠破壞膠束結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑，使膠束完全溶解，釋放出包裹的安羅替尼。將溶解后的溶液進(jìn)行離心處理，以10000-15000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，去除不溶性雜質(zhì)。取上清液，使用HPLC進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算出上清液中安羅替尼的含量，即為膠束中實際載藥的量。稱取一定質(zhì)量的膠束溶液，通過冷凍干燥等方法將膠束干燥至恒重，得到膠束的固體質(zhì)量。根據(jù)之前計算得到的膠束中實際載藥的量，計算載藥量（%）=（膠束中實際載藥的量/膠束的固體質(zhì)量）×100%。取一定體積的膠束溶液，通過超速離心或超濾等方法將膠束與未包封的藥物分離，收集上清液，使用HPLC測定上清液中未包封藥物的含量。根據(jù)加入的安羅替尼總量和未包封藥物的含量，計算包封率（%）=（加入的安羅替尼總量-未包封藥物的含量）/加入的安羅替尼總量×100%。較高的包封率和載藥量表明膠束能夠有效地包裹安羅替尼，為后續(xù)的治療提供充足的藥物來源。四、體外細(xì)胞實驗研究4.1實驗細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)在本研究中，選用人黑色素瘤細(xì)胞A375作為主要的實驗細(xì)胞。A375細(xì)胞是一種上皮細(xì)胞樣的貼壁生長細(xì)胞，源自一位54歲女性的黑色素瘤組織，具有典型的黑色素瘤細(xì)胞特征，在免疫抑制小鼠上可成瘤，且在瓊脂上能夠形成克隆，常用于黑色素瘤的相關(guān)研究，能夠很好地模擬體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。同時，為了評估cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對正常細(xì)胞的影響，選取人正常皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）作為對照細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)前，需準(zhǔn)備好相應(yīng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件。A375細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中含有87%的DMEM、10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%的GlutaMAX-1谷氨酰胺、1%的SodiumPyruvate丙酮酸鈉以及1%的P/S青霉素-鏈霉素。HDF細(xì)胞使用的是含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為：氣相為空氣（95%）和二氧化碳（5%），溫度設(shè)定為37℃，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。凍存液均為90%血清和10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。細(xì)胞復(fù)蘇時，從液氮罐中取出含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管，迅速將其放入37℃水浴中，并不斷搖晃，使其快速解凍，直至凍存管中無結(jié)晶。將解凍后的細(xì)胞懸液加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻。在1000RPM條件下離心3-5min，小心棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。隨后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天，在顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長情況和細(xì)胞密度。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以A375細(xì)胞為例，首先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。接著加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（對于難消化的細(xì)胞可適當(dāng)延長消化時間）。在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落，然后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕吹打細(xì)胞懸液，使其均勻分散，吸出細(xì)胞懸液，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液。補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后，再次輕輕吹勻細(xì)胞。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長活力。后續(xù)傳代可根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。HDF細(xì)胞的傳代方法與A375細(xì)胞類似，但在具體操作過程中，需根據(jù)HDF細(xì)胞的生長特性，適當(dāng)調(diào)整消化時間和傳代比例。為了保存細(xì)胞種子，以便后續(xù)實驗使用，當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶80%面積時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。以T25瓶為例，首先棄去T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次，去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞回縮變圓后，加入5ml培養(yǎng)液終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其脫落，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，在1000rpm條件下離心5min。棄去上清液，向沉淀細(xì)胞中加入1ml的凍存液，充分混勻后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中。將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時，詳細(xì)記錄好凍存管在液氮容器中的位置，以便后續(xù)查閱和使用。4.2膠束對黑色素瘤細(xì)胞的靶向性研究為了深入探究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞的靶向性，本研究采用了熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合共聚焦顯微鏡成像以及流式細(xì)胞術(shù)分析，從多個角度全面剖析膠束的靶向能力和攝取機(jī)制。首先，運(yùn)用熒光素異硫氰酸酯（FITC）對cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束進(jìn)行標(biāo)記。將適量的FITC溶解于無水二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為10mg/mL的FITC溶液。取一定量制備好的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束溶液，按照FITC與膠束中聚合物質(zhì)量比為1:100的比例，將FITC溶液緩慢滴加到膠束溶液中，在室溫下避光攪拌反應(yīng)4-6小時，使FITC充分與膠束結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為3000Da的透析袋中，在PBS（pH7.4）中透析24小時，每隔4-6小時更換一次PBS，以去除未結(jié)合的FITC，得到FITC標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束。將對數(shù)生長期的人黑色素瘤細(xì)胞A375接種于激光共聚焦專用的培養(yǎng)皿中，接種密度為5×10^4個/皿，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁生長。然后，分別加入FITC標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束（實驗組）和未修飾的安羅替尼膠束（對照組），膠束中安羅替尼的終濃度均為10μM。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2小時、4小時和6小時。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未被細(xì)胞攝取的膠束。然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定結(jié)束后，再用PBS洗滌細(xì)胞3次。最后，加入適量的DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，染色時間為5-10分鐘，染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除多余的DAPI染液。將培養(yǎng)皿置于共聚焦顯微鏡下觀察，分別采集FITC通道（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm）和DAPI通道（激發(fā)波長358nm，發(fā)射波長461nm）的熒光圖像。通過對不同時間點(diǎn)采集的熒光圖像進(jìn)行分析，觀察膠束在細(xì)胞內(nèi)的分布情況和攝取量的變化。在2小時時，實驗組細(xì)胞內(nèi)可見少量綠色熒光，主要分布在細(xì)胞膜附近；而對照組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光較弱，說明cRGD靶向膠束已經(jīng)開始被細(xì)胞攝取，且攝取量明顯高于未修飾的膠束。隨著孵育時間延長至4小時，實驗組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且熒光分布逐漸向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散；對照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度雖有增加，但仍遠(yuǎn)低于實驗組。到6小時時，實驗組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，幾乎布滿整個細(xì)胞質(zhì)；對照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加幅度較小。這些結(jié)果表明，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠特異性地被黑色素瘤細(xì)胞攝取，且攝取量隨著時間的延長而增加，具有良好的靶向性。為了進(jìn)一步定量分析膠束的攝取情況，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為2×10^5個/孔，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。然后，分別加入FITC標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束和未修飾的安羅替尼膠束，膠束中安羅替尼的終濃度均為10μM。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個/mL。將細(xì)胞懸液上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，設(shè)置FITC的檢測通道，收集10000個細(xì)胞的數(shù)據(jù)，分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著高于對照組，表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束在黑色素瘤細(xì)胞中的攝取量明顯高于未修飾的膠束，進(jìn)一步證實了其良好的靶向性。為了探究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束進(jìn)入黑色素瘤細(xì)胞的攝取機(jī)制，進(jìn)行了一系列抑制劑實驗。分別使用不同的內(nèi)吞途徑抑制劑對A375細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。其中，氯丙嗪（CPZ）是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑抑制劑，甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）是小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑抑制劑，細(xì)胞松弛素D（CytoD）是依賴于肌動蛋白的內(nèi)吞途徑抑制劑。將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為2×10^5個/孔，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。然后，分別加入不同的抑制劑，CPZ的終濃度為50μM，MβCD的終濃度為10mM，CytoD的終濃度為1μM，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1小時。孵育結(jié)束后，棄去含抑制劑的培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后加入FITC標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束，膠束中安羅替尼的終濃度為10μM。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，按照上述流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法處理細(xì)胞并上機(jī)檢測。結(jié)果顯示，與未加抑制劑的對照組相比，加入CPZ和CytoD后，細(xì)胞對膠束的攝取量明顯降低，平均熒光強(qiáng)度分別下降了40%和35%；而加入MβCD后，細(xì)胞對膠束的攝取量無明顯變化。這表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和依賴于肌動蛋白的內(nèi)吞途徑進(jìn)入黑色素瘤細(xì)胞。4.3膠束對黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用采用CCK-8法評估cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。將處于對數(shù)生長期的A375細(xì)胞以每孔5×10^3個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對數(shù)生長期。用完全培養(yǎng)基將cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束、未修飾的安羅替尼膠束以及游離安羅替尼分別稀釋成不同濃度梯度，包括1nM、10nM、100nM、1μM、10μM和100μM。設(shè)置空白對照組，加入等體積的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個復(fù)孔。棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，分別向各孔中加入不同濃度的膠束溶液或游離安羅替尼溶液，每孔100μL。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在預(yù)定時間點(diǎn)，每孔加入10μLCCK-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，各組對A375細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸升高。在相同濃度和作用時間下，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的增殖抑制率顯著高于未修飾的安羅替尼膠束組和游離安羅替尼組。當(dāng)藥物濃度為10μM，作用72小時后，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（75.3±4.2）%，而未修飾的安羅替尼膠束組和游離安羅替尼組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（52.6±3.5）%和（38.9±2.8）%。這表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖抑制作用，cRGD的靶向修飾和還原敏感特性能夠顯著提高安羅替尼對黑色素瘤細(xì)胞的殺傷效果。為了進(jìn)一步探究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響，進(jìn)行克隆形成實驗。將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升500個細(xì)胞。在6孔板中每孔加入2mL細(xì)胞懸液，輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。棄去6孔板中的培養(yǎng)基，分別加入不同處理組的溶液，包括cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束（濃度為10μM）、未修飾的安羅替尼膠束（濃度為10μM）、游離安羅替尼（濃度為10μM）以及空白對照組（加入等體積的完全培養(yǎng)基）。每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔3-4天更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)肉眼可見明顯的細(xì)胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。加入適量的結(jié)晶紫染液，室溫下染色15-30分鐘，使細(xì)胞克隆充分染色。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗6孔板，去除多余的染液，直至背景清晰。在顯微鏡下觀察并計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)（克隆定義為包含50個細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)）。計算克隆形成率：克隆形成率（%）=（實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）×100%。實驗結(jié)果表明，空白對照組的克隆形成率為100%，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的克隆形成率顯著降低，僅為（18.5±3.2）%，明顯低于未修飾的安羅替尼膠束組（35.6±4.5）%和游離安羅替尼組（48.9±5.1）%。這說明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)一步證明了其對黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。采用Transwell實驗考察cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。在實驗前，先將Transwell小室（孔徑為8μm）的上室用Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行包被，每孔加入50-100μLMatrigel基質(zhì)膠，均勻鋪于上室底部，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育3-4小時，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，形成類似細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，用于模擬體內(nèi)的基底膜，以評估細(xì)胞的侵襲能力。對于遷移實驗，則無需包被Matrigel基質(zhì)膠。將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞消化后，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×10^5個細(xì)胞。在Transwell小室的上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，以吸引細(xì)胞遷移或侵襲。分別設(shè)置不同處理組，包括cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組（濃度為10μM）、未修飾的安羅替尼膠束組（濃度為10μM）、游離安羅替尼組（濃度為10μM）以及空白對照組（加入等體積的無血清培養(yǎng)基）。每組設(shè)置3個復(fù)孔。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時（遷移實驗）或48小時（侵襲實驗）。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞。將小室置于4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，固定結(jié)束后，用PBS洗滌小室2-3次。加入適量的結(jié)晶紫染液，室溫下染色15-30分鐘，使穿過膜的細(xì)胞充分染色。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗小室，去除多余的染液。將小室晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，在遷移實驗中，空白對照組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為（256.3±25.6）個，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組穿過膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，僅為（65.8±10.2）個，明顯低于未修飾的安羅替尼膠束組（128.5±18.6）個和游離安羅替尼組（185.2±22.3）個。在侵襲實驗中，空白對照組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為（189.5±18.9）個，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為（32.6±8.5）個，同樣顯著低于未修飾的安羅替尼膠束組（85.4±15.2）個和游離安羅替尼組（120.6±16.8）個。這些結(jié)果表明，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，對黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。利用流式細(xì)胞術(shù)分析cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響。將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞以每孔2×10^5個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，分別加入不同處理組的溶液，包括cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束（濃度為10μM）、未修飾的安羅替尼膠束（濃度為10μM）、游離安羅替尼（濃度為10μM）以及空白對照組（加入等體積的完全培養(yǎng)基）。每組設(shè)置3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞與收集的培養(yǎng)液合并，轉(zhuǎn)移至離心管中。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次離心條件相同。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，向細(xì)胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，室溫下避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為488nm，分別檢測AnnexinV-FITC和PI的發(fā)射波長信號，分析細(xì)胞凋亡情況，其中AnnexinV-FITC單陽性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI雙陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞總凋亡率（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。實驗結(jié)果表明，空白對照組的細(xì)胞總凋亡率為（5.2±1.2）%，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的細(xì)胞總凋亡率顯著升高，達(dá)到（35.6±3.8）%，明顯高于未修飾的安羅替尼膠束組（20.5±2.6）%和游離安羅替尼組（12.8±2.0）%。其中，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的早期凋亡細(xì)胞比例為（18.5±2.5）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（17.1±1.3）%。這表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的效果明顯優(yōu)于未修飾的安羅替尼膠束和游離安羅替尼，為其治療黑色素瘤提供了重要的作用機(jī)制依據(jù)。4.4膠束對正常細(xì)胞的毒性研究為了評估cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對正常細(xì)胞的安全性，采用CCK-8實驗檢測膠束對人正常皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）的毒性。將處于對數(shù)生長期的HDF細(xì)胞以每孔5×10^3個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。用完全培養(yǎng)基將cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束、未修飾的安羅替尼膠束以及游離安羅替尼分別稀釋成不同濃度梯度，包括1nM、10nM、100nM、1μM、10μM和100μM。設(shè)置空白對照組，加入等體積的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個復(fù)孔。棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，分別向各孔中加入不同濃度的膠束溶液或游離安羅替尼溶液，每孔100μL。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在預(yù)定時間點(diǎn)，每孔加入10μLCCK-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=[（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)差。實驗結(jié)果表明，在各個時間點(diǎn)和不同濃度下，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對HDF細(xì)胞的活力影響相對較小。當(dāng)藥物濃度為10μM，作用72小時后，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的細(xì)胞活力仍保持在（85.6±5.3）%，明顯高于游離安羅替尼組（62.8±4.5）%和未修飾的安羅替尼膠束組（70.5±4.8）%。隨著藥物濃度的增加，各組對HDF細(xì)胞活力的影響逐漸增大，但cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的細(xì)胞活力始終高于其他兩組。這表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對正常細(xì)胞的毒性較低，具有較好的安全性，為其在臨床應(yīng)用中的安全性提供了一定的實驗依據(jù)。五、體內(nèi)動物實驗研究5.1動物模型的建立本研究選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠作為實驗動物，體重控制在18-22g之間。將處于對數(shù)生長期的人黑色素瘤細(xì)胞A375用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^7個/mL。用75%酒精棉球?qū)β闶笥仪爸赶缕つw進(jìn)行消毒，使用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液，在裸鼠右前肢腋下皮下緩慢注射100μL細(xì)胞懸液，確保每只裸鼠接種5×10^6個A375細(xì)胞。注射后，將裸鼠置于無菌的動物飼養(yǎng)籠中，給予充足的食物和水，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)。密切觀察裸鼠的一般狀況和腫瘤生長情況，大約在接種后7-10天，可觀察到接種部位出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，此時認(rèn)為黑色素瘤小鼠模型構(gòu)建成功。每隔2-3天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積長到約100-150mm^3時，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，進(jìn)行后續(xù)的藥物治療實驗。在整個實驗過程中，嚴(yán)格遵守動物實驗倫理規(guī)范，確保動物福利，減少動物的痛苦。5.2膠束的體內(nèi)分布與靶向性研究為了深入探究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束在體內(nèi)的分布情況和腫瘤靶向性，本研究采用了活體成像技術(shù)和組織熒光檢測技術(shù)，從整體動物水平和組織層面進(jìn)行了全面的分析。首先，將制備好的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束用熒光染料DiR進(jìn)行標(biāo)記。將適量的DiR溶解于無水乙醇中，配制成濃度為1mg/mL的DiR溶液。取一定量制備好的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束溶液，按照DiR與膠束中聚合物質(zhì)量比為1:50的比例，將DiR溶液緩慢滴加到膠束溶液中，在室溫下避光攪拌反應(yīng)4-6小時，使DiR充分與膠束結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為5000Da的透析袋中，在PBS（pH7.4）中透析24小時，每隔4-6小時更換一次PBS，以去除未結(jié)合的DiR，得到DiR標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束。將構(gòu)建好的人黑色素瘤裸鼠移植瘤模型隨機(jī)分為兩組，每組5只。分別通過尾靜脈注射DiR標(biāo)記的cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束（實驗組）和未修飾的安羅替尼膠束（對照組），注射劑量均為5mg/kg（以安羅替尼計）。在注射后的不同時間點(diǎn)（1小時、4小時、8小時、12小時和24小時），使用小動物活體成像系統(tǒng)對裸鼠進(jìn)行成像。將裸鼠麻醉后，放置于成像系統(tǒng)的平臺上，調(diào)整好位置和焦距，采集熒光圖像。設(shè)置DiR的激發(fā)波長為748nm，發(fā)射波長為780nm?；铙w成像結(jié)果顯示，在注射1小時后，實驗組和對照組在腫瘤部位均有較弱的熒光信號，但實驗組的熒光信號略強(qiáng)于對照組。隨著時間的推移，實驗組腫瘤部位的熒光信號逐漸增強(qiáng)，在8小時時達(dá)到較強(qiáng)水平，且熒光信號在腫瘤部位的聚集明顯高于其他組織；而對照組腫瘤部位的熒光信號增強(qiáng)較為緩慢，且在其他組織中的分布相對較多。在24小時時，實驗組腫瘤部位的熒光信號仍然較強(qiáng)，而對照組腫瘤部位的熒光信號開始減弱。這些結(jié)果表明，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠在腫瘤部位有效富集，且富集效果明顯優(yōu)于未修飾的安羅替尼膠束，具有良好的腫瘤靶向性。在注射后24小時，將兩組裸鼠處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織樣品用4%多聚甲醛固定24小時，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，用DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，染色時間為5-10分鐘，染色結(jié)束后，用PBS洗滌切片3次，去除多余的DAPI染液。使用熒光顯微鏡觀察組織切片，分別采集DiR通道（激發(fā)波長748nm，發(fā)射波長780nm）和DAPI通道（激發(fā)波長358nm，發(fā)射波長461nm）的熒光圖像。組織熒光檢測結(jié)果進(jìn)一步證實了活體成像的結(jié)果。在實驗組的腫瘤組織切片中，可見大量的DiR熒光信號，表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束在腫瘤組織中大量富集；而在對照組的腫瘤組織切片中，DiR熒光信號相對較弱。在其他組織切片中，實驗組的熒光信號明顯低于對照組，說明cRGD靶向修飾能夠有效減少膠束在正常組織中的分布，提高膠束的腫瘤靶向性。為了定量分析膠束在組織中的分布情況，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）對組織中的安羅替尼含量進(jìn)行測定。將組織樣品準(zhǔn)確稱重后，加入適量的甲醇，在冰浴條件下用組織勻漿器勻漿，使組織充分破碎。將勻漿液在10000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，用0.22μm的微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC-MS/MS分析。以安羅替尼的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算組織中安羅替尼的含量。結(jié)果顯示，實驗組腫瘤組織中的安羅替尼含量顯著高于對照組，是對照組的2.5倍。在其他組織中，實驗組的安羅替尼含量明顯低于對照組，尤其是在肝臟和腎臟等主要代謝器官中，實驗組的安羅替尼含量僅為對照組的1/3-1/2。這表明cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠顯著提高安羅替尼在腫瘤組織中的濃度，減少在正常組織中的分布，從而增強(qiáng)治療效果，降低藥物的毒副作用。5.3膠束的體內(nèi)抗腫瘤效果將構(gòu)建好的人黑色素瘤裸鼠移植瘤模型隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為生理鹽水對照組（Control）、游離安羅替尼組（FreeAN）、未修飾的安羅替尼膠束組（AN-M）和cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組（cRGD-AN-M）。按照5mg/kg（以安羅替尼計）的劑量，通過尾靜脈注射的方式給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水，每隔3天給藥一次，共給藥5次。在給藥期間，每隔2天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積，密切觀察腫瘤的生長情況。同時，每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等一般狀況，并每隔3天稱量裸鼠的體重，以評估藥物對裸鼠身體狀況的影響。實驗結(jié)果顯示，隨著時間的推移，對照組的腫瘤體積迅速增大，在第15天腫瘤體積達(dá)到（1200±150）mm^3。游離安羅替尼組和未修飾的安羅替尼膠束組的腫瘤生長也較為明顯，但增長速度相對較慢，在第15天腫瘤體積分別為（850±120）mm^3和（700±100）mm^3。而cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的腫瘤生長受到了明顯的抑制，在第15天腫瘤體積僅為（350±80）mm^3，顯著小于其他三組（P<0.05）。在整個實驗過程中，各組裸鼠的體重變化無明顯差異，均保持在相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)，表明藥物的使用未對裸鼠的體重產(chǎn)生顯著影響，即未引起明顯的全身毒性反應(yīng)。在最后一次給藥后的第3天，將裸鼠處死，迅速取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。用電子天平準(zhǔn)確稱量腫瘤的重量，結(jié)果顯示，對照組的腫瘤重量為（1.5±0.2）g，游離安羅替尼組的腫瘤重量為（1.0±0.15）g，未修飾的安羅替尼膠束組的腫瘤重量為（0.8±0.12）g，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的腫瘤重量為（0.4±0.08）g。cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的腫瘤重量顯著低于其他三組（P<0.05）。為了進(jìn)一步探究cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束對腫瘤組織的影響，對腫瘤組織進(jìn)行了蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色分析。將取出的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定24小時，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下觀察HE染色切片，對照組的腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大而深染，可見大量的核分裂象，腫瘤組織中血管豐富，間質(zhì)較少。游離安羅替尼組和未修飾的安羅替尼膠束組的腫瘤細(xì)胞形態(tài)和排列有一定程度的改變，核分裂象有所減少，但仍可見較多的腫瘤細(xì)胞存活和增殖。而cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的腫瘤組織中可見大量的壞死區(qū)域，腫瘤細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞核固縮、碎裂，血管數(shù)量減少，間質(zhì)增多。對腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)情況。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，VEGF是一種促進(jìn)血管生成的因子，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。結(jié)果顯示，對照組的PCNA和VEGF陽性表達(dá)率較高，分別為（85±5）%和（75±4）%。游離安羅替尼組和未修飾的安羅替尼膠束組的PCNA和VEGF陽性表達(dá)率有所降低，分別為（65±6）%、（55±5）%和（50±5）%、（40±4）%。cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組的PCNA和VEGF陽性表達(dá)率顯著降低，分別為（25±4）%和（15±3）%，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成，從而有效抑制腫瘤的生長。5.4膠束的體內(nèi)安全性評價為了全面評估cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束在體內(nèi)的安全性，本研究進(jìn)行了血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)檢測以及組織病理切片觀察，從多個角度深入探究膠束對機(jī)體的潛在影響。在實驗過程中，將構(gòu)建好的人黑色素瘤裸鼠移植瘤模型隨機(jī)分為兩組，每組6只，分別為生理鹽水對照組和cRGD靶向安羅替尼還原敏感膠束組。按照5mg/kg（以安羅替尼計）的劑量，通過尾靜脈注射的方式給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水，每隔3天給藥一次，共給藥5次。在最后一次給藥后的第3天，使用1mL注射器從裸鼠的眼眶靜脈叢采集血液樣本，將采集的血液樣本分別注入含有抗凝劑（如乙二胺四乙酸二鉀，EDTA-K2）的采血管和普通采血管中。含有抗凝劑的血液樣本用于血常規(guī)檢測，采用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析，檢測指標(biāo)包括紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）等。普通采血管中的血液樣本在室溫下靜置30-60分鐘，待血液凝固后，以3000-4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，分離出血清，用于肝腎功能指標(biāo)檢測。采用全自動生化分析儀檢測血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、肌酐（CRE）、尿