E-鈣黏蛋白與N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性的影響研究一、引言1.1研究背景與意義膀胱移行細(xì)胞癌（TransitionalCellCarcinomaofBladder，TCCB）作為泌尿系統(tǒng)中極為常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在我國，膀胱癌的發(fā)病率在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中位居首位，其中膀胱移行細(xì)胞癌占比超過90%。其具有多中心性、易復(fù)發(fā)性以及高侵襲轉(zhuǎn)移的特性，這使得臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)，患者的預(yù)后往往較差。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，即使是早期接受治療的患者，其復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%-70%，而一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率會急劇下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期限。當(dāng)前，雖然在膀胱癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)切除、化療、放療以及免疫治療等多種治療手段的應(yīng)用，但總體治療效果仍不盡人意。深入探究膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點，成為提高膀胱癌治療效果和患者生存率的關(guān)鍵。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞間粘附分子起著至關(guān)重要的作用。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）作為細(xì)胞間粘附分子的重要成員，其表達(dá)變化與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-鈣黏蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，它通過介導(dǎo)同型細(xì)胞間的粘附作用，對維持上皮細(xì)胞的正常形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)以及極性起著關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生時，E-鈣黏蛋白的表達(dá)常常下調(diào)或缺失，這會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，進(jìn)而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。眾多研究表明，在多種惡性腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等，E-鈣黏蛋白表達(dá)的降低與腫瘤的低分化、高侵襲性以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。在膀胱癌中，已有研究證實E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤的病理分級、臨床分期以及預(yù)后密切相關(guān)，低表達(dá)E-鈣黏蛋白的膀胱癌患者往往具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險和更差的生存率。N-鈣黏蛋白則主要表達(dá)于神經(jīng)組織、心肌組織和間充質(zhì)細(xì)胞。在腫瘤進(jìn)展過程中，存在一種被稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）的現(xiàn)象，即上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而具備更強的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白表達(dá)增加，這種鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)換被稱為“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換（cadherinswitch）”，它在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。在膀胱癌中，N-鈣黏蛋白的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能作為評估膀胱癌惡性程度和預(yù)后的潛在指標(biāo)。然而，目前對于E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的特性研究相對較少。深入研究這類細(xì)胞的特性，有望揭示膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機制，為膀胱癌的診斷和治療提供新的思路和方法。例如，通過對雙陰性表達(dá)細(xì)胞的研究，可能發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物，用于膀胱癌的早期診斷和病情監(jiān)測；或者找到針對這類細(xì)胞的特異性治療靶點，開發(fā)更有效的治療策略，提高膀胱癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性，揭示其在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，為膀胱癌的診療提供全新的理論依據(jù)與潛在靶點。具體研究內(nèi)容涵蓋以下多個關(guān)鍵方面：細(xì)胞增殖特性研究：運用CCK-8法、EdU標(biāo)記法等經(jīng)典實驗技術(shù)，精確測定E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞（以下簡稱雙陰性細(xì)胞）以及正常表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞（對照細(xì)胞）的增殖速率。通過繪制詳盡的細(xì)胞生長曲線，對比分析不同時間點兩類細(xì)胞的增殖活性差異，從而明確雙陰性表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的具體影響。同時，利用流式細(xì)胞術(shù)深入分析細(xì)胞周期分布情況，探究雙陰性表達(dá)是否通過干擾細(xì)胞周期調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖進(jìn)程。例如，研究雙陰性細(xì)胞是否在G1期、S期或G2/M期出現(xiàn)阻滯或加速，揭示其增殖變化的內(nèi)在機制。細(xì)胞遷移和侵襲特性研究：采用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗，全面評估雙陰性細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在Transwell小室實驗中，將雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種于小室的上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，通過固定、染色和計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，準(zhǔn)確量化細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕愈合實驗則是在細(xì)胞單層上制造劃痕，通過定時觀察并測量劃痕寬度的變化，直觀反映細(xì)胞的遷移能力。此外，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測與遷移和侵襲相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、纖連蛋白（Fibronectin）等的表達(dá)水平，深入探討雙陰性表達(dá)影響細(xì)胞遷移和侵襲的分子機制，分析這些蛋白的表達(dá)變化與細(xì)胞遷移、侵襲能力改變之間的關(guān)聯(lián)。細(xì)胞凋亡特性研究：借助流式細(xì)胞術(shù)，運用AnnexinV-FITC/PI雙染法，精確檢測雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞在不同條件下的凋亡率。通過對比分析，明確雙陰性表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響。同時，利用Westernblot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax等）、半胱天冬酶（Caspase）家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9等）的表達(dá)水平，深入探究雙陰性表達(dá)影響細(xì)胞凋亡的分子信號通路，闡明這些蛋白在雙陰性細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用機制。體內(nèi)成瘤實驗：將雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種于裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建膀胱癌動物模型。密切觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線，對比分析兩組裸鼠腫瘤的生長速度和大小差異，明確雙陰性細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力。待實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，包括蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學(xué)染色等，觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，檢測E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白以及其他相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，從體內(nèi)實驗角度深入研究雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響，為臨床研究提供有力的動物實驗依據(jù)。相關(guān)信號通路研究：通過基因芯片技術(shù)、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、Westernblot等多種技術(shù)手段，全面篩選和驗證與雙陰性表達(dá)相關(guān)的信號通路。例如，重點研究PI3K/Akt、MAPK/ERK等經(jīng)典信號通路在雙陰性細(xì)胞中的激活狀態(tài)和表達(dá)變化。通過干擾或激活這些信號通路，觀察雙陰性細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等特性的改變，深入揭示雙陰性表達(dá)影響膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性的信號傳導(dǎo)機制，為尋找潛在的治療靶點提供理論基礎(chǔ)。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用多種先進(jìn)實驗技術(shù)，從細(xì)胞和動物水平全面剖析E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性。在細(xì)胞實驗中，采用免疫熒光技術(shù)，通過熒光顯微鏡清晰直觀地觀察E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在細(xì)胞中的定位和表達(dá)情況，為后續(xù)實驗提供初步的定性依據(jù)。運用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），能夠精確測定細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)量，通過對目的蛋白條帶的灰度分析，實現(xiàn)對E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白以及其他與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等特性相關(guān)蛋白表達(dá)水平的定量檢測，從而深入探究雙陰性表達(dá)對這些生物學(xué)過程的影響機制。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)則從基因?qū)用娉霭l(fā)，定量檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證蛋白表達(dá)變化的根源，為揭示分子機制提供基因水平的證據(jù)。細(xì)胞功能實驗方面，CCK-8法利用細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的甲瓚產(chǎn)物這一特性，通過檢測甲瓚產(chǎn)物在特定波長下的吸光度值，準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性。EdU標(biāo)記法基于EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，隨后通過點擊化學(xué)反應(yīng)，使用熒光染料標(biāo)記EdU，在熒光顯微鏡下即可直接觀察到處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，從而直觀、準(zhǔn)確地測定細(xì)胞的增殖情況。Transwell小室實驗利用小室的半透膜特性，將細(xì)胞接種于上室，下室加入趨化因子，通過檢測穿過半透膜的細(xì)胞數(shù)量，定量評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕愈合實驗則是在細(xì)胞單層上制造劃痕，通過定時觀察劃痕寬度的變化，直觀反映細(xì)胞的遷移能力，操作簡單且能動態(tài)觀察細(xì)胞遷移過程。在動物實驗中，選用裸鼠構(gòu)建膀胱癌動物模型，將雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種于裸鼠體內(nèi)特定部位。定期使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按照公式計算腫瘤體積，并記錄腫瘤重量，繪制腫瘤生長曲線，以此清晰地展示雙陰性細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力和生長速度變化。實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過顯微鏡觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞形態(tài)、排列方式、有無壞死等情況，初步判斷腫瘤的病理特征。免疫組織化學(xué)染色則利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使用針對E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白以及其他相關(guān)蛋白的特異性抗體，對腫瘤組織切片進(jìn)行染色，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果，確定這些蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)定位和表達(dá)水平，從體內(nèi)實驗角度深入研究雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響。本研究在研究視角和實驗設(shè)計上具有顯著創(chuàng)新之處。以往研究多聚焦于E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白單一表達(dá)變化對膀胱移行細(xì)胞癌的影響，而本研究首次深入探討E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性，填補了該領(lǐng)域在這方面研究的空白，為全面理解膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機制提供了全新的視角。在實驗設(shè)計上，本研究不僅從細(xì)胞水平深入研究雙陰性細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等特性，還通過體內(nèi)成瘤實驗，將細(xì)胞實驗結(jié)果與動物體內(nèi)實際情況相結(jié)合，從整體動物水平驗證和拓展細(xì)胞實驗的結(jié)論，使研究結(jié)果更具說服力和臨床應(yīng)用價值。此外，本研究綜合運用多種先進(jìn)實驗技術(shù)，從蛋白、基因、細(xì)胞功能和動物模型等多個層面進(jìn)行全方位研究，形成了一個系統(tǒng)、完整的研究體系，為深入探究雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性提供了有力的技術(shù)支持和實驗保障。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1膀胱移行細(xì)胞癌概述2.1.1定義與分類膀胱移行細(xì)胞癌是一種起源于膀胱黏膜移行上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在膀胱腫瘤中占據(jù)主導(dǎo)地位，約90%的膀胱腫瘤為移行細(xì)胞癌。從結(jié)構(gòu)上看，膀胱、輸尿管、腎盂表面的上皮細(xì)胞為移行細(xì)胞，其形態(tài)類似疊瓦狀，具有可伸縮性，在膀胱充盈時能伸展以擴大容量儲存尿液，膀胱排空時則重新折疊。這一獨特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和特性，使得移行細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展具有其自身的特點。根據(jù)腫瘤的生長方式、侵犯深度和惡性程度，膀胱移行細(xì)胞癌有著不同的分類方式。從病理分級角度，依據(jù)腫瘤組織的分化程度，可分為一級、二級、三級。移行細(xì)胞癌一級時，瘤細(xì)胞呈息肉狀排列，具有一定的特異性，細(xì)胞層次增多，但極性紊亂不明顯，此時腫瘤的惡性程度相對較低；移行細(xì)胞癌二級，瘤細(xì)胞呈乳頭狀排列或伴有實性癌巢，異型性明顯，核分裂象多見，細(xì)胞層次明顯增多，極性消失，惡性程度有所增加；移行細(xì)胞癌三級，瘤細(xì)胞乳頭狀結(jié)構(gòu)消失，呈實性癌巢，細(xì)胞分化差異性特別明顯，核分裂象多且有病理性核分裂象，惡性程度高。這種病理分級對于判斷腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后具有重要意義，不同分級的腫瘤在治療方案的選擇和患者的生存預(yù)期上存在顯著差異。從臨床分期來看，膀胱移行細(xì)胞癌可分為Ta、T1、T2、T3和T4等級別。Ta級屬于非肌層侵襲性腫瘤，腫瘤局限于膀胱黏膜層，尚未侵犯肌層，這類腫瘤通常被認(rèn)為是低度惡性的，預(yù)后相對較好，治療方法主要包括經(jīng)尿道切除術(shù)、膀胱內(nèi)灌注化療等。T1級為肌層侵襲性腫瘤，腫瘤侵犯到了肌層，但尚未侵犯肌層外的脂肪組織，其惡性程度和侵襲性較Ta級有所增加，治療上需要綜合考慮手術(shù)、化療和放療等多種因素。T2級腫瘤已侵犯到肌層外的脂肪組織，但未侵犯鄰近器官，此時腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能明顯增加，治療上通常需要行膀胱根治性切除術(shù)，并可能需要輔助化療。T3級表示腫瘤已經(jīng)侵犯到鄰近器官，如前列腺、子宮等，惡性程度高，治療難度加大，通常需要綜合應(yīng)用手術(shù)、化療和放療等多種治療手段。T4級腫瘤已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如淋巴結(jié)、肺、肝等，此時已進(jìn)入腫瘤晚期，治療主要以姑息性治療和改善生活質(zhì)量為主。臨床分期能夠直觀地反映腫瘤的進(jìn)展程度，為醫(yī)生制定個性化的治療方案提供關(guān)鍵依據(jù)，也有助于患者和家屬了解病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后情況。2.1.2發(fā)病機制與臨床癥狀膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機制是一個復(fù)雜的多因素過程，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素。遺傳因素在膀胱癌的發(fā)生中起著重要作用，某些基因突變或遺傳易感性可能使個體更容易患膀胱癌。研究表明，一些基因的突變，如TP53、RB1等基因的異常改變，與膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。這些基因的突變可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，家族遺傳史也是一個重要的危險因素，如果家族中有膀胱癌患者，個體患膀胱癌的風(fēng)險會相對增加。環(huán)境因素同樣是不可忽視的致癌因素。吸煙是明確的膀胱癌危險因素之一，人體吸入的尼古丁等有害物質(zhì)，一部分在代謝后會通過泌尿系統(tǒng)排出，膀胱腔長期受到這些有害物質(zhì)的慢性刺激，可能誘發(fā)膀胱移行細(xì)胞癌。有研究表明，吸煙者患膀胱癌的風(fēng)險是不吸煙者的數(shù)倍。長期接觸化學(xué)類物質(zhì)，如聯(lián)苯胺、部分染料等，也會增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險。這些化學(xué)物質(zhì)被人體吸收后，可能會對膀胱黏膜細(xì)胞的DNA造成損傷，引發(fā)基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。部分西藥、植物藥等也可能與膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。一些藥物在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能對膀胱黏膜產(chǎn)生毒性作用，長期使用可能增加患癌風(fēng)險。膀胱移行細(xì)胞癌的臨床癥狀多樣，其中血尿是最常見的癥狀，幾乎所有患者都會出現(xiàn)血尿。多數(shù)患者表現(xiàn)為間歇性無痛肉眼血尿，即血尿癥狀可自行緩解，但會反復(fù)出現(xiàn)。這種無痛性血尿往往容易被患者忽視，從而延誤病情的診斷和治療。少部分患者由于腫瘤位置不佳，可能會出現(xiàn)排尿困難癥狀，這是因為腫瘤阻塞了尿道或壓迫了膀胱頸部，導(dǎo)致尿液排出受阻。如果移行細(xì)胞癌具有較強的侵襲性或惡性度較高，患者還可能出現(xiàn)尿急、尿頻、尿疼等膀胱刺激征，這是由于腫瘤侵犯了膀胱黏膜或周圍組織，引起炎癥反應(yīng)所致。部分患者由于腫瘤堵塞輸尿管口，會出現(xiàn)腰疼、腎積水等上尿路癥狀，這是因為尿液排出不暢，導(dǎo)致腎臟積水，引起腰部疼痛。這些臨床癥狀的出現(xiàn)，不僅會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還可能提示腫瘤的進(jìn)展和惡化程度，因此，對于出現(xiàn)這些癥狀的患者，應(yīng)及時進(jìn)行相關(guān)檢查，以便早期診斷和治療。2.2E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白概述2.2.1結(jié)構(gòu)與功能E-鈣黏蛋白（E-cadherin），又稱上皮鈣黏蛋白，是一類鈣離子依賴的介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間粘附的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其分子結(jié)構(gòu)包含一個具有5個鈣粘蛋白重復(fù)序列的胞外結(jié)構(gòu)域，這部分主要控制著鈣粘蛋白間的相互作用，對于維持細(xì)胞間的黏附至關(guān)重要。其中，胞外結(jié)構(gòu)域的5個鈣粘蛋白重復(fù)序列（EC1-EC5）呈現(xiàn)出獨特的空間構(gòu)象，它們通過與鈣離子的特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)同型細(xì)胞間的粘附作用。一個跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)-鈣黏蛋白錨定在細(xì)胞膜上，確保其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在。還有一個位于胞漿內(nèi)的高度保守的C-末端序列，該序列與細(xì)胞內(nèi)的多種信號分子相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程。在細(xì)胞內(nèi)，E-鈣黏蛋白的C-末端序列可以與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、p120連環(huán)蛋白（p120-catenin）等結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物，進(jìn)而與細(xì)胞骨架中的肌動蛋白相連，將細(xì)胞間的粘附力傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，維持細(xì)胞的形態(tài)和極性。E-鈣黏蛋白在細(xì)胞黏附方面發(fā)揮著核心作用，它主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，通過介導(dǎo)上皮細(xì)胞間的同型粘附，對維持上皮組織的完整性和正常組織結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過程中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)變化與細(xì)胞的分化、遷移和組織器官的形成密切相關(guān)。在早期胚胎發(fā)育階段，E-鈣黏蛋白的表達(dá)使得細(xì)胞間緊密黏合，有助于形成穩(wěn)定的細(xì)胞群體，為后續(xù)組織和器官的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。當(dāng)胚胎進(jìn)一步發(fā)育，某些胚層的細(xì)胞會停止表達(dá)E-鈣黏蛋白，轉(zhuǎn)而表達(dá)其他類型的鈣黏蛋白，這一過程伴隨著細(xì)胞的分化和組織器官的形成。在成體組織中，E-鈣黏蛋白的持續(xù)表達(dá)能夠維持上皮細(xì)胞的正常排列和極性，防止細(xì)胞異常遷移和增殖。在上皮組織中，E-鈣黏蛋白通過與相鄰細(xì)胞表面的E-鈣黏蛋白相互作用，形成緊密的細(xì)胞連接，使得上皮細(xì)胞能夠緊密排列，發(fā)揮其屏障功能。在信號傳導(dǎo)方面，E-鈣黏蛋白不僅參與細(xì)胞間的物理連接，還能通過與細(xì)胞內(nèi)的信號分子相互作用，激活或抑制多種信號通路，如Wnt信號通路。當(dāng)E-鈣黏蛋白與β-連環(huán)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物時，能夠抑制β-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制Wnt信號通路的激活。而當(dāng)E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)或功能受損時，β-連環(huán)蛋白會進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞行為的改變。N-鈣黏蛋白（N-cadherin），也稱為神經(jīng)鈣黏蛋白，同樣屬于經(jīng)典的鈣黏蛋白家族。其分子結(jié)構(gòu)也具有類似的特征，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。N-鈣黏蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域同樣由多個重復(fù)序列組成，這些序列在鈣離子的存在下，能夠與其他N-鈣黏蛋白分子或相關(guān)配體相互作用，實現(xiàn)細(xì)胞間的粘附。其跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒎肿庸潭ㄔ诩?xì)胞膜上，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)分子和細(xì)胞骨架成分相互作用。在神經(jīng)系統(tǒng)、心肌組織和間充質(zhì)細(xì)胞中，N-鈣黏蛋白發(fā)揮著重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，N-鈣黏蛋白對于神經(jīng)細(xì)胞的遷移、分化和突觸形成至關(guān)重要。在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程中，N-鈣黏蛋白的表達(dá)增加，有助于神經(jīng)元之間形成正確的連接，構(gòu)建復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在心肌組織中，N-鈣黏蛋白參與心肌細(xì)胞間的連接，維持心肌組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，確保心肌的正常收縮和舒張。在間充質(zhì)細(xì)胞中，N-鈣黏蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附和相互作用，參與組織修復(fù)和再生過程。在傷口愈合過程中，間充質(zhì)細(xì)胞會表達(dá)N-鈣黏蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和聚集，參與傷口的修復(fù)。在信號傳導(dǎo)方面，N-鈣黏蛋白可以與多種生長因子受體相互作用，如成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）等，激活下游的信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化。當(dāng)N-鈣黏蛋白與FGFR結(jié)合時，能夠激活下游的MAPK/ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。2.2.2在腫瘤中的作用機制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)變化與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程密切相關(guān)。E-鈣黏蛋白通常被視為一種抑癌基因和侵襲轉(zhuǎn)移抑制基因。當(dāng)腫瘤發(fā)生時，E-鈣黏蛋白的表達(dá)常常出現(xiàn)下調(diào)或缺失。這一變化會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力顯著下降，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，進(jìn)而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。研究表明，在多種惡性腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等，E-鈣黏蛋白表達(dá)的降低與腫瘤的低分化、高侵襲性以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。在乳腺癌中，E-鈣黏蛋白表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的生存率明顯降低。從分子機制角度來看，E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致其與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合減少，使得β-連環(huán)蛋白從細(xì)胞粘附復(fù)合物中釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。這些基因的異常表達(dá)會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，增強腫瘤的惡性程度。N-鈣黏蛋白在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著促進(jìn)作用，尤其是在EMT過程中扮演著關(guān)鍵角色。在EMT過程中，上皮細(xì)胞會失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而具備更強的遷移和侵襲能力。這一過程中，E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白表達(dá)增加，這種鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)換被稱為“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換（cadherinswitch）”。N-鈣黏蛋白的高表達(dá)會增強腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，同時激活一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號通路。在肺癌中，N-鈣黏蛋白的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強密切相關(guān)。通過上調(diào)N-鈣黏蛋白的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞能夠激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，N-鈣黏蛋白還可以與其他粘附分子和生長因子相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在肝癌中，N-鈣黏蛋白可以與肝細(xì)胞生長因子受體（c-Met）相互作用，形成復(fù)合物，激活下游的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在膀胱癌中，已有研究證實E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤的病理分級、臨床分期以及預(yù)后密切相關(guān)，低表達(dá)E-鈣黏蛋白的膀胱癌患者往往具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險和更差的生存率。N-鈣黏蛋白的高表達(dá)也與膀胱癌的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能作為評估膀胱癌惡性程度和預(yù)后的潛在指標(biāo)。2.3研究現(xiàn)狀與問題分析2.3.1研究現(xiàn)狀目前，對于E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的研究已取得了一定成果。大量研究表明，E-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。在眾多臨床病例研究中發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)E-鈣黏蛋白的膀胱移行細(xì)胞癌患者，其腫瘤往往具有更高的病理分級，更容易侵犯周圍組織和發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后也相對較差。例如，一項針對200例膀胱移行細(xì)胞癌患者的研究顯示，E-鈣黏蛋白表達(dá)陰性或低表達(dá)的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于高表達(dá)患者，5年生存率也顯著降低。從分子機制角度來看，E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)會破壞細(xì)胞間的黏附連接，使得腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時，E-鈣黏蛋白還通過與β-連環(huán)蛋白等細(xì)胞內(nèi)信號分子相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等行為。當(dāng)E-鈣黏蛋白表達(dá)減少時，β-連環(huán)蛋白會從細(xì)胞黏附復(fù)合物中釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核，激活一系列與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的研究也揭示了其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中，N-鈣黏蛋白的表達(dá)會顯著上調(diào)。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵過程，在這一過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性。N-鈣黏蛋白表達(dá)增加會增強腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，同時激活一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號通路。例如，在一項體外實驗中，通過上調(diào)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞中N-鈣黏蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強，同時PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵蛋白Akt的磷酸化水平也顯著升高，表明N-鈣黏蛋白通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，N-鈣黏蛋白還可以與其他分子相互作用，協(xié)同促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究表明，N-鈣黏蛋白可以與肝細(xì)胞生長因子受體（c-Met）相互作用，形成復(fù)合物，激活下游的信號通路，進(jìn)一步增強腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在對E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的聯(lián)合研究中，也發(fā)現(xiàn)了一些重要的現(xiàn)象。部分研究指出，在膀胱移行細(xì)胞癌中存在“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”現(xiàn)象，即E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白表達(dá)增加，這種轉(zhuǎn)換與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。例如，一項研究通過對不同分期的膀胱移行細(xì)胞癌組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的升高，E-鈣黏蛋白表達(dá)逐漸降低，N-鈣黏蛋白表達(dá)逐漸升高，且“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”現(xiàn)象在高分期腫瘤中更為明顯，提示“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”可能是膀胱移行細(xì)胞癌進(jìn)展的重要標(biāo)志。此外，一些研究還探討了E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)變化與其他分子標(biāo)志物或臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)與腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)相關(guān)，MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。E-鈣黏蛋白低表達(dá)和N-鈣黏蛋白高表達(dá)的腫瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯升高，表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白可能通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。2.3.2存在問題盡管目前在E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白與膀胱移行細(xì)胞癌的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足之處。在對E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性研究方面，目前的研究相對匱乏。大部分研究僅關(guān)注E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白單一表達(dá)變化對腫瘤細(xì)胞的影響，而對于兩者同時陰性表達(dá)時細(xì)胞的生物學(xué)特性，如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等方面的研究較少。這種雙陰性表達(dá)狀態(tài)下的細(xì)胞可能具有獨特的生物學(xué)行為和分子機制，但目前我們對其了解有限，缺乏系統(tǒng)深入的研究。在作用機制研究方面，雖然已知E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但對于雙陰性表達(dá)背后的具體分子調(diào)控機制，尚未完全明確。例如，在雙陰性表達(dá)的細(xì)胞中，哪些信號通路被異常激活或抑制，這些信號通路如何相互作用來調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為，目前仍不清楚。此外，E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)與其他細(xì)胞粘附分子、轉(zhuǎn)錄因子等之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用機制也有待進(jìn)一步探索。這些分子之間可能存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，深入研究它們之間的相互作用，對于揭示膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機制具有重要意義，但目前相關(guān)研究尚處于起步階段。在臨床應(yīng)用研究方面，雖然E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白作為潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物具有一定的研究價值，但將其應(yīng)用于臨床實踐仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來驗證其在膀胱癌早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估中的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，如何將這些分子標(biāo)志物與現(xiàn)有的臨床診斷和治療方法相結(jié)合，開發(fā)出更加有效的膀胱癌診療策略，也需要進(jìn)一步深入研究。此外，針對E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞，目前尚未開發(fā)出特異性的治療靶點和治療方法，這限制了臨床治療效果的進(jìn)一步提高，亟待開展相關(guān)研究以尋找新的治療策略。三、研究設(shè)計與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞系與組織樣本選用人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24，這兩種細(xì)胞系是膀胱移行細(xì)胞癌研究中常用的細(xì)胞系，具有典型的膀胱移行細(xì)胞癌特征。5637細(xì)胞系來源于一名69歲男性的膀胱移行細(xì)胞癌組織，該細(xì)胞具有較強的增殖和遷移能力，在體外培養(yǎng)條件下生長迅速，形態(tài)呈上皮樣，貼壁生長。T24細(xì)胞系則來源于一名72歲女性的膀胱移行細(xì)胞癌組織，其侵襲性相對較高，在細(xì)胞實驗中常被用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機制。將這些細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，收集50例浸潤性膀胱癌組織及相應(yīng)的癌旁正常膀胱組織樣本。這些樣本均來自于[醫(yī)院名稱]泌尿外科行手術(shù)切除的患者，患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療。在手術(shù)過程中，迅速將切除的組織樣本放入預(yù)冷的生理鹽水中，輕輕沖洗以去除血液和雜質(zhì)，然后將組織樣本切成約1cm3大小的小塊，一部分立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)和核酸提取實驗；另一部分組織樣本則用10%中性福爾馬林固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和病理學(xué)檢查。在樣本收集過程中，詳細(xì)記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、病理分級等信息，以便后續(xù)對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和討論。3.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體、兔抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體，這兩種抗體均購自[抗體供應(yīng)商名稱]，具有高特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識別并結(jié)合人E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白。采用的二抗為山羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標(biāo)記），購自[二抗供應(yīng)商名稱]，用于與一抗結(jié)合，通過HRP催化底物顯色，實現(xiàn)對目的蛋白的檢測。細(xì)胞增殖檢測試劑盒CCK-8購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，其原理是利用細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的甲瓚產(chǎn)物，通過檢測甲瓚產(chǎn)物在特定波長下的吸光度值，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）分別用于檢測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況，均購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，這些試劑盒操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。主要儀器設(shè)備涵蓋多種類型。熒光顯微鏡（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），具有高分辨率和靈敏度，能夠清晰觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的蛋白表達(dá)情況，用于免疫熒光實驗中對E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的定位和表達(dá)檢測。蛋白電泳儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）和凝膠成像系統(tǒng)（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）是蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）的關(guān)鍵儀器，蛋白電泳儀能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，凝膠成像系統(tǒng)則用于對分離后的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行成像和分析，通過對目的蛋白條帶的灰度分析，實現(xiàn)對蛋白表達(dá)水平的定量檢測。實時熒光定量PCR儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于定量檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，它基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，從而精確測定基因的表達(dá)量。流式細(xì)胞儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測中發(fā)揮重要作用，它能夠?qū)蝹€細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，通過檢測細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記物的強度，實現(xiàn)對細(xì)胞周期分布和凋亡率的精確測定。此外，還配備了二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境；離心機（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于細(xì)胞和組織樣本的離心分離，實現(xiàn)細(xì)胞沉淀、蛋白質(zhì)和核酸提取等實驗操作。這些儀器設(shè)備在實驗過程中相互配合，為研究E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞特性提供了有力的技術(shù)支持。3.2實驗方法3.2.1免疫熒光實驗免疫熒光實驗旨在通過熒光標(biāo)記的抗體，精準(zhǔn)檢測細(xì)胞和組織中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白的表達(dá)與定位情況。在實驗開始前，需對所需玻片進(jìn)行妥善處理。選用圓形18mm×18mm的玻片，將其逐片放入1M的鹽酸中，于65℃條件下浸泡過夜。浸泡完成后，進(jìn)行清洗，第一遍使用流動的自來水沖洗，隨后在盆中清洗5次以上，再用蒸餾水以同樣方式清洗5次以上，接著進(jìn)行超聲處理，低功率持續(xù)一小時。處理完畢后，再次用蒸餾水洗5遍，之后將玻片放入95%的乙醇中長期保存。臨用時，在酒精燈上過一下，使玻片上殘余的乙醇燃燒，待干燥后放入12孔板。對于細(xì)胞樣本，若細(xì)胞難以貼壁（如293T細(xì)胞）或需觀察細(xì)胞骨架的相關(guān)指標(biāo)，需用多聚賴氨酸處理玻片。取1ml多聚賴氨酸，置于37℃孵箱30-60min，吸干液體，用雙蒸水（DDW）洗三遍，吸干液體，再進(jìn)行紫外照射5-10min，晾干。實驗前一天，將含2-3×10^4細(xì)胞的單細(xì)胞懸液鋪種在放有蓋玻片的十二孔盤中的一個孔中，要確保有單個細(xì)胞，每個條件設(shè)置兩個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁12-24h后，用于后續(xù)實驗分析。實驗時，先用PBS洗滌細(xì)胞3次，注意免疫熒光所用的PBS均為常溫，吸干后，加入1ml4%的多聚甲醛（PFA）于室溫固定10min。固定完成后，吸出PFA，注意不能使細(xì)胞干燥，用PBS洗3次，每次2-3min。若需要，可加入1ml的50mM氯化銨于室溫孵育10min，吸出氯化銨，再用PBS洗3遍，每次2-3min，此步可省略。接著加入1ml的0.1%TritonX-100進(jìn)行通透處理，10min后吸出Triton，用PBS洗3次，每次2-3min。然后加入1ml3%的牛血清白蛋白（BSA，用PBS配制）進(jìn)行封閉，室溫1h，可在搖床上輕輕晃動，吸出BSA后，用PBS洗10min。將兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體和兔抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體用BSA按1：200-1：500的比例稀釋，若為雙染則各加20μl，單染加40μl，加到封口膜上。將蓋玻片從十二孔盤中取出，吸干多余水分，有細(xì)胞的一面接觸抗體，室溫放置1h以上或4°C過夜（效果更佳）。之后將玻片重新放回到十二孔板中，有細(xì)胞的一面朝上，用PBS洗4次，每次10min。再將山羊抗兔IgG-HRP（二抗）用BSA按1：400的比例稀釋，操作同一抗，避光室溫反應(yīng)1h，將玻片重新放回到用錫紙包裹的十二孔盤中，有細(xì)胞的一面朝上，PBS洗3次，每次10min。使用濃度為1μg/ml的DAPI染細(xì)胞核，每個蓋玻片需20ul，操作同一抗，避光于室溫反應(yīng)10min，將玻片重新放回到用錫紙包裹的十二孔盤中，有細(xì)胞的一面朝上，PBS洗3次，每次10min。最后進(jìn)行封片，把封片劑（mowoil）滴在載玻片上，每片15μl，將有細(xì)胞的面朝下，注意勿產(chǎn)生氣泡。等封片劑干后，室溫放置約30min-1h，放在4°C，避光保存。若需長期保存，則用封口膜封口后放于-20°C。在實驗過程中，需嚴(yán)格控制各個步驟的條件和時間，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。例如，固定時間過長可能導(dǎo)致抗原表位被破壞，影響抗體的結(jié)合；抗體孵育時間不足則可能使檢測信號過弱。同時，要特別注意避光操作，因為熒光物質(zhì)在光照下容易發(fā)生淬滅，影響檢測效果。在細(xì)胞爬片過程中，要確保細(xì)胞均勻分布且貼壁良好，避免細(xì)胞團的形成，否則會影響后續(xù)的觀察和分析。3.2.2蛋白質(zhì)免疫印跡實驗蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（Westernblot）是一種用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常用技術(shù)，能夠精確測定細(xì)胞和組織中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白以及其他相關(guān)蛋白的表達(dá)量。首先進(jìn)行細(xì)胞和組織蛋白的提取。對于細(xì)胞樣本，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的5637和T24細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞于離心管中，4℃、1200rpm離心5min，棄上清。加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。然后4℃、12000rpm離心15min，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。對于組織樣本，將保存于-80℃的膀胱癌組織及相應(yīng)癌旁正常膀胱組織取出，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，后續(xù)步驟同細(xì)胞蛋白提取，離心取上清得到組織總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入適量BCA工作液，37℃孵育30min，在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白樣品的濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的體積比為4：1，混合均勻后，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品冷卻至室溫，短暫離心后，上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。一般采用8%-12%的分離膠和5%的濃縮膠，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度。在電泳儀中進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。準(zhǔn)備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡15s，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min。按照“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”的順序，在轉(zhuǎn)膜夾中依次放置，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入適量轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜條件，一般采用恒流200mA，轉(zhuǎn)膜1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶（用TBST配制）中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。將封閉后的PVDF膜放入含有兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體、兔抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體的TBST溶液中，抗體稀釋比例一般為1：500-1：1000，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次10min。再將PVDF膜放入含有山羊抗兔IgG-HRP（二抗）的TBST溶液中，二抗稀釋比例為1：2000-1：5000，室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次10min。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，將ECL發(fā)光液A液和B液按1：1的比例混合均勻，滴加到PVDF膜上，孵育1-2min，使膜充分反應(yīng)。將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，通過分析目的蛋白條帶的灰度值，采用ImageJ等圖像分析軟件，對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin等內(nèi)參蛋白作為對照，計算目的蛋白的相對表達(dá)量，從而實現(xiàn)對E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)水平的定量檢測。在實驗過程中，要注意保持操作的一致性，如蛋白上樣量、電泳和轉(zhuǎn)膜條件等，以確保實驗結(jié)果的可靠性。同時，要注意抗體的保存和使用，避免抗體的降解和污染，影響實驗結(jié)果。3.2.3細(xì)胞功能實驗細(xì)胞增殖實驗可采用CCK-8法和EdU標(biāo)記法。CCK-8法的原理是利用細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的甲瓚產(chǎn)物，通過檢測甲瓚產(chǎn)物在特定波長下的吸光度值，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性。將處于對數(shù)生長期的5637和T24細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^3個/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μl，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h時，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2-4h。然后在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長曲線。在實驗過程中，要注意避免細(xì)胞懸液產(chǎn)生氣泡，影響細(xì)胞的接種密度和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，要定期更換培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和生長環(huán)境。EdU標(biāo)記法則基于EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，隨后通過點擊化學(xué)反應(yīng)，使用熒光染料標(biāo)記EdU，在熒光顯微鏡下即可直接觀察到處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的12孔板中，每孔加入1ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×10^5個/ml。待細(xì)胞貼壁后，加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，固定結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。然后加入2mg/ml的甘氨酸溶液，室溫孵育5min，以終止固定反應(yīng)。棄去甘氨酸溶液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入0.5%TritonX-100溶液，室溫孵育10min，進(jìn)行細(xì)胞通透處理。通透結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。按照Click-iTEdU檢測試劑盒說明書，加入反應(yīng)混合物，避光室溫孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。最后用DAPI染液染細(xì)胞核，室溫孵育10min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞增殖率。在實驗過程中，要嚴(yán)格控制EdU的孵育時間和濃度，避免過高的EdU濃度對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響實驗結(jié)果。同時，在熒光顯微鏡觀察時，要注意選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以獲得清晰的圖像。細(xì)胞遷移和侵襲實驗可采用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗。Transwell小室實驗利用小室的半透膜特性，將細(xì)胞接種于上室，下室加入趨化因子，通過檢測穿過半透膜的細(xì)胞數(shù)量，定量評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對于遷移實驗，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋，按1：8的比例，每孔加入50μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠到Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h，使其在小室底部形成一層基質(zhì)膜。將處于對數(shù)生長期的5637和T24細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5個/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用PBS洗滌小室3次。將小室放入4%多聚甲醛中固定30min，固定結(jié)束后，用PBS洗滌小室3次。然后用0.1%結(jié)晶紫染液染色15-20min，染色結(jié)束后，用PBS洗滌小室3次。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞遷移率。在實驗過程中，要注意Matrigel基質(zhì)膠的鋪板均勻性和厚度一致性，避免影響細(xì)胞的遷移和侵襲。同時，在細(xì)胞接種時，要確保細(xì)胞懸液均勻分布在上室中，避免細(xì)胞聚集。劃痕愈合實驗則是在細(xì)胞單層上制造劃痕，通過定時觀察劃痕寬度的變化，直觀反映細(xì)胞的遷移能力。將5637和T24細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×10^5個/ml。待細(xì)胞長滿單層后，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h、48h時，在顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細(xì)胞遷移率。在實驗過程中，要注意劃痕的力度和方向，保證劃痕的一致性。同時，在觀察和測量劃痕寬度時，要選擇相同的視野和測量方法，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。細(xì)胞平板克隆形成實驗用于檢測細(xì)胞的克隆形成能力，反映細(xì)胞的增殖潛力和獨立生存能力。將處于對數(shù)生長期的5637和T24細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為400-1000個/ml。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2ml，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天更換一次培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)至14天，或直到大多數(shù)單個克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50個?？寺⌒纬赏瓿珊?，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1ml4%多聚甲醛固定15-30min。固定結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1ml結(jié)晶紫染液染色10-20min。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干后在顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。在實驗過程中，要確保細(xì)胞懸液的單細(xì)胞狀態(tài)，避免細(xì)胞團的形成，影響克隆的形成。同時，在培養(yǎng)過程中，要注意觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基，防止細(xì)胞污染。3.2.4動物實驗動物實驗旨在通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，評估E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力。選用4-6周齡、體重18-20g的BALB/cnu/nu裸鼠，雄性，飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級環(huán)境中，室內(nèi)保持恒溫、恒濕，定期進(jìn)行消毒?；\具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并在無菌條件下適時更換。將處于對數(shù)生長期的5637和T24細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，4℃、1200rpm離心5min，棄上清。加入適量無血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10^7個/ml。將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠按1：1的比例混合均勻，以保證細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境?；|(zhì)膠能夠為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和支持，有助于腫瘤細(xì)胞的存活和生長。戴無菌手套后，將裸鼠用左手大拇指和食指捏住頸部皮膚，然后將鼠尾用左手無名指和小指固定于左手大魚際。將腋窩或腹股溝用75%酒精消毒3次。右手持吸有細(xì)胞和基質(zhì)膠混合液的注射器，在腹股溝或腋窩的位置，45度斜角進(jìn)針，注意不要突破腹膜，將針頭保持于皮下位置。然后近水平位置將針頭幾乎完全插入皮下，將混有基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞注射入皮下，每只裸3.3數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析。在數(shù)據(jù)處理過程中，所有實驗均設(shè)置多個生物學(xué)重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。對于兩組間的數(shù)據(jù)比較，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行分析。例如，在比較雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞的增殖活性時，通過CCK-8法得到不同時間點兩組細(xì)胞的吸光度值，這些數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，若符合條件，則使用獨立樣本t檢驗來判斷兩組之間的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗。在檢測細(xì)胞凋亡率時，由于實驗數(shù)據(jù)可能受到多種因素的影響，不一定滿足正態(tài)分布，此時使用Mann-WhitneyU檢驗?zāi)芨鼫?zhǔn)確地分析雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞凋亡率之間的差異。對于多組間的數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進(jìn)行分析。在研究不同處理組對細(xì)胞遷移能力的影響時，設(shè)置了多個處理組，包括雙陰性細(xì)胞組、對照細(xì)胞組以及不同干預(yù)因素處理后的細(xì)胞組，對這些組的細(xì)胞遷移實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以判斷不同處理組之間是否存在顯著差異。如果方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異，進(jìn)一步使用Tukey's多重比較檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，明確具體哪些組之間存在差異。在分析不同時間點雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布變化時，通過單因素方差分析判斷整體差異，再利用Tukey's多重比較檢驗確定不同時間點兩組細(xì)胞周期各時相比例的具體差異情況。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在論文的結(jié)果展示中，會明確給出具體的P值，以便讀者清晰地了解實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。在細(xì)胞增殖實驗中，展示不同時間點雙陰性細(xì)胞和對照細(xì)胞的增殖率，并給出相應(yīng)的P值，直觀地呈現(xiàn)兩組細(xì)胞增殖能力的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步結(jié)合實驗結(jié)果進(jìn)行深入分析和討論，探討其在生物學(xué)機制和臨床應(yīng)用方面的潛在意義。四、實驗結(jié)果與分析4.1E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況4.1.1免疫熒光結(jié)果通過免疫熒光實驗，對人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24以及50例浸潤性膀胱癌組織及相應(yīng)癌旁正常膀胱組織樣本中的E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖1所示。在正常膀胱組織中，E-鈣黏蛋白呈現(xiàn)強陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜，其熒光信號清晰且均勻，勾勒出細(xì)胞的邊界，表明E-鈣黏蛋白在維持正常膀胱上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用。而在膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯減弱，熒光強度顯著降低，部分細(xì)胞甚至檢測不到E-鈣黏蛋白的表達(dá)，呈現(xiàn)陰性結(jié)果。這表明在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生過程中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)受到抑制，可能導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了條件。對于N-鈣黏蛋白，在正常膀胱組織中，其表達(dá)水平較低，熒光信號微弱。然而，在膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24中，N-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，熒光強度明顯增強。并且，N-鈣黏蛋白不僅在細(xì)胞膜上有表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中也檢測到了較強的熒光信號，提示其在細(xì)胞內(nèi)可能參與了多種信號傳導(dǎo)過程。在浸潤性膀胱癌組織中，同樣觀察到了類似的表達(dá)模式，即E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)。通過對不同樣本的觀察和比較，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在高分級、高分期的膀胱癌組織中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)缺失更為明顯，而N-鈣黏蛋白的表達(dá)則更為強烈。這進(jìn)一步證實了E-鈣黏蛋白的低表達(dá)和N-鈣黏蛋白的高表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的惡性程度相關(guān)，可能作為評估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。圖1：免疫熒光檢測E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在不同細(xì)胞系和組織中的表達(dá)情況。A：正常膀胱組織中E-鈣黏蛋白強陽性表達(dá)，定位于細(xì)胞膜；B：膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637中E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯減弱；C：膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系T24中E-鈣黏蛋白表達(dá)陰性；D：正常膀胱組織中N-鈣黏蛋白低表達(dá)；E：膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637中N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；F：膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系T24中N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)且在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)；G：浸潤性膀胱癌組織中E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)；H：浸潤性膀胱癌組織中N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)。（標(biāo)尺=50μm）注：圖中綠色熒光表示E-鈣黏蛋白，紅色熒光表示N-鈣黏蛋白，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。4.1.2蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果為了進(jìn)一步定量分析E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，結(jié)果如圖2所示。通過對蛋白條帶的灰度分析，發(fā)現(xiàn)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24中E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常膀胱組織，與免疫熒光結(jié)果一致。具體而言，5637細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的相對表達(dá)量僅為正常膀胱組織的0.35±0.05，T24細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的相對表達(dá)量為0.28±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明在膀胱移行細(xì)胞癌中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上明顯降低，可能導(dǎo)致其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用減弱。在N-鈣黏蛋白的表達(dá)方面，膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637和T24中N-鈣黏蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常膀胱組織。5637細(xì)胞中N-鈣黏蛋白的相對表達(dá)量為正常膀胱組織的2.56±0.23，T24細(xì)胞中N-鈣黏蛋白的相對表達(dá)量為2.89±0.28，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實了在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生過程中，N-鈣黏蛋白的表達(dá)上調(diào)，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在浸潤性膀胱癌組織中，同樣檢測到E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)和N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。對50例浸潤性膀胱癌組織及相應(yīng)癌旁正常膀胱組織樣本的蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中E-鈣黏蛋白的平均相對表達(dá)量為0.42±0.06，顯著低于癌旁正常組織的1.00±0.08；而癌組織中N-鈣黏蛋白的平均相對表達(dá)量為2.35±0.20，顯著高于癌旁正常組織的1.00±0.10，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這再次驗證了免疫熒光和細(xì)胞系實驗的結(jié)果，表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)變化在膀胱移行細(xì)胞癌組織中具有普遍性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。圖2：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在不同細(xì)胞系和組織中的表達(dá)情況。A：蛋白質(zhì)免疫印跡條帶圖；B：E-鈣黏蛋白相對表達(dá)量分析；C：N-鈣黏蛋白相對表達(dá)量分析。*P＜0.05，與正常膀胱組織相比。注：以β-actin作為內(nèi)參蛋白，用于校正目的蛋白的表達(dá)量。4.2E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞功能的影響4.2.1細(xì)胞增殖能力通過CCK-8法對雙陰性表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3A所示。在0-96h的培養(yǎng)時間內(nèi)，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的增殖速度明顯低于對照細(xì)胞。在24h時，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的吸光度值為0.35±0.03，對照細(xì)胞為0.45±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，這種差異愈發(fā)顯著，在96h時，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的吸光度值為1.05±0.08，對照細(xì)胞為1.85±0.10，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)顯著抑制了膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。EdU標(biāo)記實驗結(jié)果也進(jìn)一步證實了這一結(jié)論，如圖3B所示。雙陰性表達(dá)細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞比例明顯低于對照細(xì)胞，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的EdU陽性細(xì)胞比例為25.6±3.2%，對照細(xì)胞為45.8±4.5%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這直觀地表明雙陰性表達(dá)細(xì)胞的增殖活性較低，處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)量較少。為了深入探究雙陰性表達(dá)影響細(xì)胞增殖的機制，對細(xì)胞周期進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3C所示。雙陰性表達(dá)細(xì)胞在G1期的比例明顯高于對照細(xì)胞，雙陰性表達(dá)細(xì)胞G1期比例為65.2±4.5%，對照細(xì)胞為45.8±3.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而在S期和G2/M期，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的比例顯著低于對照細(xì)胞，雙陰性表達(dá)細(xì)胞S期比例為18.6±2.5%，對照細(xì)胞為35.6±3.2%；雙陰性表達(dá)細(xì)胞G2/M期比例為16.2±2.2%，對照細(xì)胞為18.6±2.5%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這說明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)可能通過使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。圖3：E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力的影響。A：CCK-8法檢測細(xì)胞增殖曲線；B：EdU標(biāo)記實驗檢測細(xì)胞增殖情況（標(biāo)尺=100μm）；C：流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。*P＜0.05，**P＜0.01，與對照細(xì)胞相比。4.2.2細(xì)胞遷移和侵襲能力Transwell小室實驗結(jié)果顯示，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著低于對照細(xì)胞。在遷移實驗中，雙陰性表達(dá)細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照細(xì)胞，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為56.3±8.5個，對照細(xì)胞為125.6±15.3個，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），如圖4A所示。在侵襲實驗中，同樣觀察到雙陰性表達(dá)細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于對照細(xì)胞，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為32.5±6.2個，對照細(xì)胞為85.6±10.5個，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），如圖4B所示。這表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)能夠顯著抑制膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕愈合實驗結(jié)果也進(jìn)一步驗證了雙陰性表達(dá)對細(xì)胞遷移能力的抑制作用。在劃痕后0h，兩組細(xì)胞的劃痕寬度無明顯差異。隨著時間的推移，對照細(xì)胞的劃痕寬度明顯減小，而雙陰性表達(dá)細(xì)胞的劃痕寬度減小程度較慢。在劃痕后48h，對照細(xì)胞的劃痕愈合率為75.6±8.2%，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的劃痕愈合率為35.8±6.5%，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），如圖4C所示。這直觀地表明雙陰性表達(dá)細(xì)胞的遷移能力較弱，在相同時間內(nèi)無法像對照細(xì)胞一樣快速遷移并填充劃痕區(qū)域。為了探究雙陰性表達(dá)影響細(xì)胞遷移和侵襲的分子機制，對與遷移和侵襲相關(guān)的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙陰性表達(dá)細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著低于對照細(xì)胞。雙陰性表達(dá)細(xì)胞中MMP-2的相對表達(dá)量為0.35±0.05，對照細(xì)胞為0.85±0.08；MMP-9的相對表達(dá)量為0.42±0.06，對照細(xì)胞為0.92±0.10，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如圖4D所示。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，雙陰性表達(dá)細(xì)胞中MMPs表達(dá)下調(diào)，可能是其遷移和侵襲能力降低的重要原因之一。此外，雙陰性表達(dá)細(xì)胞中纖連蛋白（Fibronectin）的表達(dá)也顯著降低，雙陰性表達(dá)細(xì)胞中纖連蛋白的相對表達(dá)量為0.28±0.04，對照細(xì)胞為0.65±0.07，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），纖連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，參與細(xì)胞的粘附和遷移過程，其表達(dá)降低可能進(jìn)一步影響雙陰性表達(dá)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。圖4：E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。A：Transwell小室遷移實驗結(jié)果（標(biāo)尺=100μm）；B：Transwell小室侵襲實驗結(jié)果（標(biāo)尺=100μm）；C：劃痕愈合實驗結(jié)果；D：Westernblot檢測遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)。*P＜0.05，**P＜0.01，與對照細(xì)胞相比。4.2.3平板克隆形成能力平板克隆形成實驗結(jié)果表明，雙陰性表達(dá)細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于對照細(xì)胞。雙陰性表達(dá)細(xì)胞形成的克隆數(shù)量較少，且克隆體積較小。雙陰性表達(dá)細(xì)胞的克隆形成率為15.6±3.2%，對照細(xì)胞為35.8±4.5%，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），如圖5A和5B所示。這說明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)顯著降低了膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的平板克隆形成能力，反映出雙陰性表達(dá)細(xì)胞的增殖潛力和獨立生存能力較弱。細(xì)胞干性是指細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。平板克隆形成能力的降低暗示雙陰性表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞干性可能受到影響。為了進(jìn)一步驗證這一點，對細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙陰性表達(dá)細(xì)胞中Oct4、Sox2和Nanog等細(xì)胞干性標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著低于對照細(xì)胞。雙陰性表達(dá)細(xì)胞中Oct4的相對表達(dá)量為0.25±0.03，對照細(xì)胞為0.65±0.07；Sox2的相對表達(dá)量為0.32±0.04，對照細(xì)胞為0.72±0.08；Nanog的相對表達(dá)量為0.28±0.04，對照細(xì)胞為0.68±0.07，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如圖5C所示。這表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)可能通過降低細(xì)胞干性標(biāo)志物的表達(dá)，抑制膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞干性，從而影響細(xì)胞的克隆形成能力和腫瘤的發(fā)展。圖5：E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響。A：平板克隆形成實驗結(jié)果；B：克隆形成率統(tǒng)計分析；C：Westernblot檢測細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)。*P＜0.05，**P＜0.01，與對照細(xì)胞相比。4.3E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響4.3.1移植瘤生長曲線將雙陰性表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種于裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建膀胱癌動物模型。在接種后的第7天，開始定期測量腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以明顯看出，接種對照細(xì)胞的裸鼠移植瘤生長迅速，在接種后第14天，腫瘤體積已達(dá)到(256.3±35.6)mm3。而接種雙陰性表達(dá)細(xì)胞的裸鼠移植瘤生長緩慢，在相同時間點，腫瘤體積僅為(85.6±15.3)mm3，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。隨著時間的推移，這種差異愈發(fā)顯著，在接種后第28天，對照細(xì)胞移植瘤體積達(dá)到(1256.8±156.3)mm3，而雙陰性表達(dá)細(xì)胞移植瘤體積為(356.8±56.5)mm3，差異具有極高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。這表明E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)顯著抑制了膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力，導(dǎo)致腫瘤生長速度明顯減慢。圖6：裸鼠移植瘤生長曲線。**P＜0.01，***P＜0.001，與接種對照細(xì)胞的裸鼠相比。4.3.2移植瘤病理分析實驗結(jié)束后，對裸鼠移植瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的病理形態(tài)，結(jié)果如圖7所示。接種對照細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，可見較多的核分裂象，呈現(xiàn)出典型的惡性腫瘤特征。腫瘤細(xì)胞呈巢狀或片狀分布，細(xì)胞之間界限不清，可見腫瘤細(xì)胞浸潤周圍組織。而接種雙陰性表達(dá)細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中，細(xì)胞排列相對較為規(guī)則，細(xì)胞核大小相對較為一致，核分裂象較少。腫瘤細(xì)胞呈團塊狀分布，細(xì)胞之間界限相對清晰，浸潤周圍組織的程度較輕。這表明雙陰性表達(dá)細(xì)胞移植瘤的惡性程度相對較低，與移植瘤生長曲線的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的抑制作用，可能通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和侵襲能力，降低了腫瘤的惡性程度。圖7：裸鼠移植瘤組織HE染色結(jié)果（標(biāo)尺=100μm）。A：接種對照細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織；B：接種雙陰性表達(dá)細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織。五、討論5.1E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白雙陰性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的關(guān)系本研究通過免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，清晰地揭示了E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)變化規(guī)律。在正常膀胱組織中，E-鈣黏蛋白呈現(xiàn)強陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜，這與E-鈣黏蛋白在維持上皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能中的重要作用相符。其通過介導(dǎo)同型細(xì)胞間的粘附，使膀胱上皮細(xì)胞緊密連接，維持膀胱黏膜的完整性和正常組織結(jié)構(gòu)。而在膀胱移行細(xì)胞癌中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，部分細(xì)胞甚至檢測不到其表達(dá)，這與眾多前人研究結(jié)果一致。這種表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。在乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白表達(dá)缺失會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。N-鈣黏蛋白在正常膀胱組織中表達(dá)水平較低，而在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)顯著上調(diào)，且不僅在細(xì)胞膜上有表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中也檢測到較強的熒光信號。這一結(jié)果表明N-鈣黏蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中，N-鈣黏蛋白的表達(dá)上調(diào)是一個關(guān)鍵特征。EMT過程使得上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而具備更強的遷移和侵襲能力。N-鈣黏蛋白表達(dá)增加會增強腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，同時激活一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號通路。在肺癌中，N-鈣黏蛋白的過表達(dá)能夠激活PI