EphA2、Ras和MAPK在胃癌中的表達(dá)及其關(guān)聯(lián)機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。從全球范圍來看，胃癌的發(fā)病形勢(shì)不容樂觀。據(jù)2022年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增癌癥病例數(shù)達(dá)1,996萬例，其中胃癌新發(fā)病例數(shù)為96.84萬例，占所有新增癌癥病例的4.9%，在全球癌癥發(fā)病率中位居第五位。在癌癥死亡病例方面，2022年全球癌癥死亡病例數(shù)為974萬例，胃癌的死亡數(shù)達(dá)到65.99萬例，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五。我國同樣是胃癌的高發(fā)國家，胃癌防治工作面臨著巨大挑戰(zhàn)。2022年，中國癌癥新發(fā)病例數(shù)為482.47萬例，其中新發(fā)胃癌病例數(shù)達(dá)到35.87萬例，占全國新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國內(nèi)新發(fā)癌癥第五位，男性和女性的發(fā)病率分別為34.20/10萬人和16.23/10萬人，呈現(xiàn)出明顯的性別差異。更為嚴(yán)峻的是，2022年中國癌癥死亡病例數(shù)為257.42萬例，胃癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬例，占全國癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位，男女死亡率分別為25.18/10萬人和11.41/10萬人。胃癌的高發(fā)病率和死亡率給患者家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，不僅影響患者的生活質(zhì)量，還造成了巨大的醫(yī)療資源消耗。盡管近年來在胃癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的研發(fā)以及靶向治療和免疫治療的應(yīng)用，但總體療效仍不盡人意。早期胃癌患者經(jīng)治療后5年生存率較高，然而臨床上大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有至關(guān)重要的意義。EphA2、Ras和MAPK等基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究這些基因在胃癌中的表達(dá)情況及其相互關(guān)系，有助于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供理論依據(jù)和新的思路，有望改善胃癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，降低胃癌的死亡率，對(duì)公共健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的本研究旨在通過一系列實(shí)驗(yàn)方法，深入探究EphA2、Ras和MAPK在胃癌組織中的表達(dá)情況，全面分析其表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，深入剖析三者之間的相互作用機(jī)制。具體而言，主要包括以下幾個(gè)方面：利用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及WesternBlot等技術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)EphA2、Ras和MAPK在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)差異，明確它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化規(guī)律。系統(tǒng)分析EphA2、Ras和MAPK的表達(dá)水平與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，判斷這些基因的表達(dá)是否可作為評(píng)估胃癌病情進(jìn)展和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究EphA2、Ras和MAPK之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路及相互作用機(jī)制，揭示它們?cè)谖赴┘?xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中的調(diào)控作用，為開發(fā)針對(duì)胃癌的靶向治療藥物提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是臨床上最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，指的是起源于胃黏膜上皮的惡性病變。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率都處于較高水平，嚴(yán)重威脅著人類的健康。從病理類型來看，胃癌主要以腺癌為主，約占所有胃癌病例的90%以上。其他較為少見的類型包括鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌、類癌、小細(xì)胞癌等。不同類型的胃癌，其生物學(xué)行為、治療方法以及預(yù)后情況都存在著一定的差異。例如，腺癌通常起源于胃腺上皮細(xì)胞，具有不同的分化程度，高分化腺癌的癌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)與正常胃腺上皮細(xì)胞較為相似，惡性程度相對(duì)較低；而低分化腺癌和未分化腺癌的癌細(xì)胞則形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)紊亂，惡性程度較高，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。鱗狀細(xì)胞癌則多見于賁門部，其發(fā)病機(jī)制和治療策略與腺癌有所不同。胃癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的多基因、多階段過程。眾多研究表明，多種因素相互作用，共同促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。其中，幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。我國胃癌高發(fā)區(qū)成人Hp感染率在60%以上。Hp能夠促使硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽及亞硝胺等致癌物，其感染引起的胃黏膜慢性炎癥，在環(huán)境致病因素的協(xié)同作用下，會(huì)加速黏膜上皮細(xì)胞的過度增殖，進(jìn)而導(dǎo)致畸變致癌。此外，Hp的毒性產(chǎn)物CagA、VacA可能也具有促癌作用，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者中抗CagA抗體檢出率較一般人群明顯更高。地域環(huán)境及飲食生活因素也與胃癌的發(fā)病密切相關(guān)。在我國，西北與東部沿海地區(qū)的胃癌發(fā)病率明顯高于南方地區(qū)。長(zhǎng)期食用熏烤、鹽腌食品的人群，其胃遠(yuǎn)端癌發(fā)病率較高，這可能與食品中亞硝酸鹽、真菌毒素、多環(huán)芳烴化合物等致癌物或前致癌物含量高有關(guān)。同時(shí)，吸煙也是胃癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，吸煙者的胃癌發(fā)病危險(xiǎn)較不吸煙者高50%。遺傳因素在胃癌的發(fā)生中也起著一定的作用。胃癌患者有血緣關(guān)系的親屬，其胃癌發(fā)病率較對(duì)照組高4倍。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的癌變涉及多個(gè)基因的改變，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡相關(guān)基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等的異常。例如，Ras基因的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，當(dāng)Ras基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物Ras蛋白活性異常時(shí)，就可能使細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而引發(fā)腫瘤形成。p53基因是一種重要的抑癌基因，在胃癌中常常發(fā)生突變或缺失，使得其無法正常發(fā)揮抑制腫瘤的作用。胃癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療、靶向治療以及免疫治療等。手術(shù)治療是胃癌的主要治療方法，可分為根治性手術(shù)和姑息性手術(shù)。根治性手術(shù)的原則是整塊切除包括癌灶和可能受浸潤(rùn)胃壁在內(nèi)的胃的部分或全部，并按臨床分期標(biāo)準(zhǔn)整塊清除胃周圍的淋巴結(jié)，重建消化道，目的是徹底切除腫瘤，達(dá)到根治的效果。對(duì)于原發(fā)灶無法切除，為了減輕由于梗阻、穿孔、出血等并發(fā)癥引起的癥狀而進(jìn)行的手術(shù)，如胃空腸吻合術(shù)、空腸造口、穿孔修補(bǔ)術(shù)等，則屬于姑息性手術(shù)?；熢谖赴┑闹委熤幸舱紦?jù)著重要地位，可用于根治性手術(shù)的術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后，以延長(zhǎng)患者的生存期。對(duì)于晚期胃癌患者，適量化療能減緩腫瘤的發(fā)展速度，改善癥狀，有一定的近期效果。常用的胃癌化療給藥途徑包括口服給藥、靜脈給藥、腹膜腔給藥、動(dòng)脈插管區(qū)域灌注給藥等。常用的口服化療藥有替加氟、優(yōu)福定、氟鐵龍等；常用的靜脈化療藥有氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑、阿霉素、依托泊苷、甲酰四氫葉酸鈣等。近年來，紫杉醇、草酸鉑、拓?fù)涿敢种苿?、希羅達(dá)等新的化療藥物也逐漸應(yīng)用于胃癌治療。靶向治療是一種新興的治療方法，能夠針對(duì)性地?fù)p傷癌細(xì)胞，減輕對(duì)正常細(xì)胞的損害。目前胃癌靶向治療藥物種類及作用均有限，主要包括表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑、血管生成抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等。例如，曲妥珠單抗是一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）的靶向藥物，對(duì)于HER-2陽性的胃癌患者，使用曲妥珠單抗聯(lián)合化療，可顯著提高治療效果。免疫治療也是胃癌治療的新方向，包括非特異生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑如卡介苗、香菇多糖等；細(xì)胞因子如白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等；以及過繼性免疫治療如淋巴細(xì)胞激活后殺傷細(xì)胞（LAK）、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）等的臨床應(yīng)用。此外，抗血管形成基因治療等方法也在研究中，有望為胃癌的治療帶來新的突破。2.2EphA2相關(guān)理論2.2.1EphA2的結(jié)構(gòu)與功能EphA2全稱為EPH受體A2，是人體中由EPHA2基因編碼的蛋白質(zhì)，該基因位于人類染色體1p36.13位置。EphA2屬于蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶家族的肝配蛋白受體亞家族，是該亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)有酪氨酸激酶活性的第一個(gè)基因。其整個(gè)分子可分成三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：一個(gè)氨基末端胞外配體結(jié)合區(qū)，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)包含一個(gè)N端球狀結(jié)構(gòu)域，一個(gè)富含20個(gè)半胱氨酸殘基的半胱氨酸富含區(qū)，以及兩個(gè)纖粘連蛋白III型重復(fù)區(qū)，主要負(fù)責(zé)與配體的識(shí)別和結(jié)合。EphA2可與ephrinA1-5這5種不同的配體結(jié)合，其中與ephrinA1的結(jié)合研究較為深入?？缒そY(jié)構(gòu)域則將EphA2固定于細(xì)胞膜上，起到連接胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的作用。胞內(nèi)區(qū)包括具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域和C端的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域在受體激活后，通過自身磷酸化及下游大量胞內(nèi)底物蛋白質(zhì)分子的酪氨酸磷酸化，啟動(dòng)不同信號(hào)途徑逐級(jí)傳遞。SAM結(jié)構(gòu)域和C端的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序則參與蛋白-蛋白相互作用，對(duì)EphA2的功能調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)起著重要作用。在正常細(xì)胞中，EphA2嚴(yán)格定位于上皮細(xì)胞膜表面的細(xì)胞間連接處。當(dāng)相鄰細(xì)胞膜表面的配體EphrinA1與EphA2結(jié)合后，會(huì)引起EphA2在胞膜上遷移、聚集，形成寡聚化受體-配體復(fù)合物。這一過程激活了胞質(zhì)的酪氨酸磷酸酶，導(dǎo)致EphA2自身磷酸化，進(jìn)而活化下游信號(hào)通路。EphA2參與了許多重要的生理過程，在胚胎發(fā)育過程中，它對(duì)細(xì)胞的遷移和組織器官的形成起到關(guān)鍵的導(dǎo)向作用。比如在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，EphA2通過與配體的相互作用，引導(dǎo)神經(jīng)元的遷移和軸突的生長(zhǎng)，確保神經(jīng)系統(tǒng)的正常布線。在血管形成過程中，EphA2也發(fā)揮著重要作用，它參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，對(duì)于構(gòu)建正常的血管網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。此外，正常表達(dá)的EphA2啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還抑制了Ras/MAPK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，削弱PDGF、EGF、VEGF等多種生長(zhǎng)因子對(duì)MAPK的活化，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)，EphA2可以通過破壞細(xì)胞的灶狀黏附，對(duì)細(xì)胞粘附進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，這對(duì)于維持細(xì)胞的正常形態(tài)和組織的穩(wěn)定性具有重要意義。2.2.2EphA2與腫瘤的關(guān)系近年來，大量研究表明EphA2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達(dá)的情況。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)EphA2的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與乳腺癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌患者的臨床研究顯示，EphA2高表達(dá)的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率顯著高于EphA2低表達(dá)的患者。在結(jié)直腸癌中，EphA2的過表達(dá)也較為常見，它能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。有研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默EphA2基因后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，遷移和侵襲能力也顯著下降。在前列腺癌中，EphA2同樣表現(xiàn)出高表達(dá)，并且與腫瘤的分期、分級(jí)以及患者的生存率相關(guān)。EphA2對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過程有著重要影響。在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面，EphA2可以通過激活PI3K/Akt和Ras/MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后，能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)提供有利條件。Ras/MAPK信號(hào)通路的活化則可以上調(diào)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的分裂。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，EphA2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞間粘附和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，EphA2能夠促使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而更容易從原發(fā)灶脫離并侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EphA2在腫瘤血管生成中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，EphA2可以通過與配體EphrinA1相互作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的行為，促進(jìn)腫瘤血管的生成。研究表明，EphA2和EphrinA1在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上均有表達(dá)，它們之間的相互作用可以激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利的微環(huán)境。綜上所述，EphA2在多種腫瘤中的異常表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，使其成為腫瘤研究中的一個(gè)重要靶點(diǎn)，深入研究EphA2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的意義。2.3Ras相關(guān)理論2.3.1Ras的結(jié)構(gòu)與功能Ras蛋白是由ras基因編碼的一種膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為21kDa，故又被稱為P21蛋白。因其在細(xì)胞信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，近年來一直是細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。人類有3種ras基因，分別是H-ras、K-ras和N-ras，它們分布于不同染色體上。其中，K-ras基因存在K-ras4A和K-ras4B兩種異構(gòu)體，是同一基因不同剪接的結(jié)果。這些不同的Ras蛋白異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上既有相似性，又存在一定差異。Ras蛋白由188或189個(gè)氨基酸組成，從結(jié)構(gòu)上看，它主要包含兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)楹?5個(gè)氨基酸殘基的高度保守序列，這一區(qū)域在不同的Ras蛋白異構(gòu)體中具有很高的相似性，對(duì)于維持Ras蛋白的基本功能至關(guān)重要。在這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域之后，是含有約80個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域，在該區(qū)域中，不同Ras蛋白的結(jié)構(gòu)存在輕微差異，這種差異可能導(dǎo)致它們?cè)谂c不同的效應(yīng)分子相互作用時(shí)具有不同的特異性和親和力。Ras蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著“分子開關(guān)”的重要角色。在非激活狀態(tài)下，Ras蛋白與GDP結(jié)合，呈失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞接收到外部刺激信號(hào)，如生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)事件。首先，生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合導(dǎo)致受體的酪氨酸發(fā)生磷酸化而活化。活化的受體通過其特異性磷酸酪氨酸殘基與含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白GRB2結(jié)合。GRB2還具有兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，它能與具有鳥苷酸交換因子活性的Sos蛋白結(jié)合形成GRB2-Sos復(fù)合物。該復(fù)合物與受體結(jié)合后，將Sos帶到細(xì)胞膜，Sos蛋白與無活性的Ras蛋白結(jié)合。Sos的作用是促使Ras蛋白結(jié)合的GDP釋放，并使Ras與GTP結(jié)合，從而使Ras蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腞as-GTP狀態(tài)?；罨腞as-GTP能夠進(jìn)一步激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，催化其底物蛋白的酪氨酸磷酸化反應(yīng)，并引發(fā)蛋白磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Ras蛋白激活的下游信號(hào)通路中，較為經(jīng)典的是Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路。Ras-GTP與Raf蛋白的氨基端結(jié)合，通過未知機(jī)制激活Raf-1。激活的Raf-1可磷酸化MEK1和MEK2（MAPkinaseERKkinase）上的特定絲氨酸位點(diǎn)，從而激活MEKs。MEKs是雙特異性激酶，能夠使絲蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生磷酸化，最終高度選擇性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。激活的ERK可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一些核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等生物學(xué)過程。除了Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，Ras蛋白還可以激活其他信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路相互協(xié)作，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理活動(dòng)。2.3.2Ras與腫瘤的關(guān)系Ras基因作為一種原癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，Ras基因在多種腫瘤中頻繁發(fā)生突變。在人類腫瘤中，K-ras是最常發(fā)生突變的Ras基因，約占所有Ras基因突變的85%。在結(jié)直腸癌中，K-ras基因突變的頻率可高達(dá)30%-40%。在胰腺癌中，K-ras基因突變的比例更是高達(dá)90%以上。H-ras和N-ras基因突變相對(duì)較少，但在某些腫瘤中也有發(fā)現(xiàn)，例如在黑色素瘤中，H-ras基因突變較為常見。Ras基因的突變主要發(fā)生在第12、13和61密碼子位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致Ras蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而影響其結(jié)構(gòu)和功能。以第12密碼子突變?yōu)槔?，常見的突變形式是甘氨酸被其他氨基酸替代，如甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔℅12D）、甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸（G12V）等。這些突變使得Ras蛋白的GTP酶活性顯著降低，導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)處于與GTP結(jié)合的活化狀態(tài)。正常情況下，Ras蛋白在結(jié)合GTP后，會(huì)通過自身的GTP酶活性將GTP水解為GDP，從而恢復(fù)到非活化狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的精確調(diào)控。而突變后的Ras蛋白由于GTP酶活性受損，無法有效水解GTP，使得Ras蛋白始終保持活化狀態(tài)，持續(xù)激活下游的信號(hào)通路。Ras信號(hào)通路的異常激活對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有多方面的作用。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，持續(xù)活化的Ras蛋白通過激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，上調(diào)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)。例如，它可以促進(jìn)cyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。在腫瘤細(xì)胞存活方面，Ras蛋白激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡。Akt蛋白被激活后，會(huì)磷酸化一系列下游靶點(diǎn)，如Bad、Caspase-9等，抑制它們的促凋亡活性，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，實(shí)現(xiàn)無限增殖。Ras信號(hào)通路還在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。Ras蛋白激活的Rho家族小GTP酶，如Rac和Cdc42，能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，改變細(xì)胞的形態(tài)和黏附特性，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離并侵入周圍組織。Ras信號(hào)通路還可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。在腫瘤血管生成方面，Ras信號(hào)通路可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子的表達(dá)。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。2.4MAPK相關(guān)理論2.4.1MAPK的結(jié)構(gòu)與功能絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化上高度保守，從單細(xì)胞生物到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均廣泛存在。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)至少5條不同的MAPK信號(hào)通路，其中研究最為深入的是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路。以ERK信號(hào)通路為例，它主要由三個(gè)關(guān)鍵激酶組成，分別是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK，如Raf）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK，如MEK1/2）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，如ERK1/2）。這些激酶通過依次磷酸化形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，將細(xì)胞外的信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等外界刺激時(shí)，細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶（RTK）被激活，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并自身磷酸化。磷酸化的受體招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白GRB2，GRB2再結(jié)合鳥苷酸交換因子Sos。Sos促進(jìn)Ras蛋白上的GDP與GTP交換，使Ras蛋白激活。激活的Ras與Raf蛋白結(jié)合，激活Raf激酶。Raf激酶磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2進(jìn)一步磷酸化ERK1/2的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其活化。活化的ERK1/2可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc等。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、存活等生理過程。除了ERK信號(hào)通路，JNK信號(hào)通路主要被應(yīng)激刺激（如紫外線、熱休克、高滲刺激、氧化應(yīng)激等）、細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素IL-1等）和生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子EGF）激活。JNK信號(hào)通路的激活過程與ERK信號(hào)通路有相似之處，也涉及到一系列激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。外界刺激通過Ras依賴或非Ras依賴的途徑激活小G蛋白R(shí)ho家族成員，如Rac和Cdc42?；罨腞ac和Cdc42與p21激活的絲蘇氨酸激酶PAK結(jié)合，使PAK自身磷酸化而被激活。激活的PAK進(jìn)一步激活雙特異性激酶JNKK（包括MKK4和MKK7），JNKK再磷酸化并激活JNK。激活的JNK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的氨基末端，增強(qiáng)c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)c-Jun與c-Fos形成異二聚體或c-Jun自身形成同二聚體，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū)的AP-1位點(diǎn)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等過程。p38MAPK信號(hào)通路同樣是對(duì)各種應(yīng)激刺激（如紫外線、熱休克、高滲、脂多糖LPS等）、細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1等）產(chǎn)生應(yīng)答。其激活過程與JNK信號(hào)通路類似，也是通過一系列激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。上游信號(hào)激活小G蛋白R(shí)ho家族成員，進(jìn)而激活PAK等激酶，PAK激活MKK3和MKK6，MKK3和MKK6磷酸化并激活p38MAPK。激活的p38MAPK可以磷酸化多種底物，包括轉(zhuǎn)錄因子（如ATF2、Elk-1等）、其他蛋白激酶（如MAPKAPK2、MAPKAPK3等），調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、凋亡、分化等過程。2.4.2MAPK與腫瘤的關(guān)系大量研究表明，MAPK信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用。在許多腫瘤中，都存在MAPK信號(hào)通路的異常激活。在非小細(xì)胞肺癌中，大約30%-40%的患者存在Ras基因突變，導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)激活，進(jìn)而過度激活下游的MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在結(jié)直腸癌中，Ras基因突變的頻率也較高，同時(shí)BRAF基因突變也較為常見，BRAF是Raf家族的成員，BRAF基因突變會(huì)導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路的異?；罨Ｔ诤谏亓鲋?，BRAF基因突變的比例可高達(dá)50%-70%，這些突變使得MAPK信號(hào)通路持續(xù)激活，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。MAPK信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有著重要影響。激活的ERK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，如c-myc、cyclinD1等基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。c-myc是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。cyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。ERK還可以通過磷酸化其他信號(hào)通路的分子，如PI3K/Akt信號(hào)通路中的分子，協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞的凋亡方面，MAPK信號(hào)通路的作用較為復(fù)雜。在某些情況下，激活的ERK可以通過磷酸化并激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員，抑制細(xì)胞凋亡。ERK還可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白，如Bad，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。然而，在另一些情況下，JNK和p38MAPK信號(hào)通路的激活則可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。JNK可以磷酸化c-Jun，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)。p38MAPK可以激活下游的蛋白激酶，如MAPKAPK2，磷酸化并激活促凋亡蛋白，如熱休克蛋白27（HSP27），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路中不同成員的活性，來決定細(xì)胞的命運(yùn)，是增殖存活還是凋亡。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，MAPK信號(hào)通路也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。激活的ERK可以磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如微管相關(guān)蛋白MAP-1、MAP-2和MAP-4，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重分布，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。MAPK信號(hào)通路還可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。例如，激活的ERK可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)MMP-2、MMP-9等的表達(dá)。JNK和p38MAPK信號(hào)通路也參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，它們可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.5EphA2、Ras和MAPK的關(guān)聯(lián)理論在正常生理狀態(tài)下，EphA2與配體EphrinA1結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，對(duì)Ras/MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到抑制作用。具體來說，EphA2通過其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與一些抑制性蛋白相互作用，阻斷了Ras蛋白的激活過程。在生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞時(shí)，正常表達(dá)的EphA2可以干擾生長(zhǎng)因子受體與接頭蛋白GRB2的結(jié)合，使得GRB2無法有效地招募鳥苷酸交換因子Sos，從而阻止Ras蛋白上的GDP被GTP替換，抑制Ras蛋白的活化。這就意味著Ras無法激活下游的Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，進(jìn)而削弱了PDGF、EGF、VEGF等多種生長(zhǎng)因子對(duì)MAPK的活化，最終抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。EphA2還可以通過激活一些負(fù)調(diào)控因子，對(duì)Ras/MAPK信號(hào)通路進(jìn)行反饋抑制。例如，EphA2激活后可以上調(diào)Sprouty蛋白的表達(dá)，Sprouty蛋白能夠與Sos蛋白相互作用，抑制其鳥苷酸交換因子活性，從而減少Ras-GTP的生成，抑制Ras/MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)。這種抑制作用對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。它可以防止細(xì)胞過度增殖，確保細(xì)胞按照正常的生理程序進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)育。在胚胎發(fā)育過程中，EphA2對(duì)Ras/MAPK信號(hào)通路的抑制作用可以精確地調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，保證各個(gè)器官和組織的正常形成。當(dāng)EphA2表達(dá)異常時(shí)，其對(duì)Ras/MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制作用就會(huì)被打破，轉(zhuǎn)而激活這一信號(hào)通路。在許多腫瘤細(xì)胞中，EphA2常常出現(xiàn)過表達(dá)或異常定位的情況。這種異常使得EphA2不僅無法正常抑制Ras/MAPK信號(hào)通路，反而會(huì)通過一些機(jī)制激活該通路。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，EphA2可以與一些促進(jìn)Ras激活的蛋白相互作用，增強(qiáng)Ras的活性。EphA2可以與一種名為Src的非受體酪氨酸激酶結(jié)合，激活的Src能夠磷酸化Ras信號(hào)通路中的一些關(guān)鍵分子，促進(jìn)Ras-GTP的形成，從而激活Ras/MAPK信號(hào)通路。異常表達(dá)的EphA2還可以通過改變細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)微環(huán)境，間接激活Ras/MAPK信號(hào)通路。EphA2的異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞間連接的破壞，使得細(xì)胞更容易受到外界生長(zhǎng)因子的刺激。當(dāng)細(xì)胞受到大量生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，即使存在正常的EphA2抑制機(jī)制，也可能無法完全阻止Ras/MAPK信號(hào)通路的激活。腫瘤細(xì)胞中EphA2的異常表達(dá)還可能影響其他信號(hào)通路，這些信號(hào)通路之間的相互作用最終導(dǎo)致Ras/MAPK信號(hào)通路的異?；罨?。PI3K/Akt信號(hào)通路與Ras/MAPK信號(hào)通路存在著密切的交互作用，EphA2異常表達(dá)時(shí)，可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，間接促進(jìn)Ras/MAPK信號(hào)通路的活化。EphA2在正常表達(dá)和異常表達(dá)時(shí)，對(duì)Ras/MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)有著截然不同的作用。這種作用的轉(zhuǎn)變?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，深入研究它們之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制，對(duì)于理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)針對(duì)性的治療策略具有重要意義。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1臨床標(biāo)本來源本研究共收集了[X]例胃癌組織標(biāo)本，均來源于[醫(yī)院名稱]20[開始年份]-20[結(jié)束年份]期間行胃癌根治術(shù)的患者。同時(shí)，選取了距離癌組織邊緣至少5cm的癌旁組織標(biāo)本[X]例，以及因其他胃部良性疾?。ㄈ缥笣?、胃息肉等）行胃部分切除術(shù)患者的正常胃黏膜標(biāo)本[X]例作為對(duì)照。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后，立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫源_保標(biāo)本的生物活性和分子完整性。納入研究的患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。其中男性患者[X]例，女性患者[X]例。患者的臨床病理特征詳細(xì)記錄如下：根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期患者[X]例，Ⅱ期患者[X]例，Ⅲ期患者[X]例，Ⅳ期患者[X]例；腫瘤分化程度方面，高分化腺癌[X]例，中分化腺癌[X]例，低分化腺癌及未分化腺癌[X]例；腫瘤浸潤(rùn)深度方面，侵犯黏膜層及黏膜下層（T1）的患者[X]例，侵犯肌層（T2）的患者[X]例，侵犯漿膜層及漿膜外組織（T3、T4）的患者[X]例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）的患者[X]例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1-N3）的患者[X]例。在收集標(biāo)本前，均已獲得患者及其家屬的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，確保研究符合倫理規(guī)范。3.1.2細(xì)胞系及培養(yǎng)條件選用人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。AGS細(xì)胞購自[細(xì)胞庫名稱1]，SGC-7901細(xì)胞購自[細(xì)胞庫名稱2]。兩種細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（美國Gibco公司），以防止細(xì)胞污染。細(xì)胞傳代時(shí)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline，PBS）沖洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸，EDTA，美國Gibco公司）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫落時(shí)，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器主要實(shí)驗(yàn)試劑如下：兔抗人EphA2多克隆抗體（美國Abcam公司）、鼠抗人Ras單克隆抗體（美國SantaCruzBiotechnology公司）、兔抗人MAPK多克隆抗體（美國CellSignalingTechnology公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（美國JacksonImmunoResearchLaboratories公司）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、RNA提取試劑盒（美國Qiagen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（美國ThermoFisherScientific公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）相關(guān)試劑（美國Bio-Rad公司）、蛋白裂解液（RIPA，北京碧云天生物技術(shù)有限公司）、蛋白酶抑制劑（PMSF，北京碧云天生物技術(shù)有限公司）等。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：PCR儀（美國AppliedBiosystems公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）等。這些試劑和儀器均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和校準(zhǔn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)將胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織標(biāo)本制成4μm厚的石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟和水化處理。脫蠟時(shí)，將切片放入二甲苯Ⅰ中浸泡10分鐘，再放入二甲苯Ⅱ中浸泡10分鐘；水化過程為，依次將切片放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次3分鐘。采用高溫高壓抗原修復(fù)法對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片置于0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后持續(xù)2-3分鐘，然后自然冷卻。冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除殘留的緩沖液。用3%過氧化氫溶液室溫孵育切片10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。孵育結(jié)束后，再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。接著，在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，以減少非特異性染色。孵育后，傾去封閉液，不洗，直接在切片上滴加稀釋好的兔抗人EphA2多克隆抗體（1:200）、鼠抗人Ras單克隆抗體（1:150）和兔抗人MAPK多克隆抗體（1:200），4℃孵育過夜。陰性對(duì)照則用PBS代替一抗。次日，將切片從4℃冰箱取出，室溫復(fù)溫30分鐘，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。隨后，滴加生物素標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，1:200），室溫孵育30-45分鐘。孵育結(jié)束后，再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。孵育后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。采用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)。脫水、透明后，用中性樹膠封片。結(jié)果判定方法為，采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下獨(dú)立觀察每張切片。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；陽性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)1分，11%-50%計(jì)2分，51%-80%計(jì)3分，＞80%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞百分比得分相乘，得到最終評(píng)分：0-2分為陰性（-），3-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。3.2.2熒光定量RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)使用RNA提取試劑盒提取胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的總RNA。具體步驟如下：將組織標(biāo)本剪碎，放入含有1mlTrizol試劑的無RNA酶離心管中，用勻漿器充分勻漿。室溫靜置5分鐘后，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。然后在4℃、12000g條件下離心15分鐘，此時(shí)勻漿液會(huì)分為三層，小心吸取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，再次在4℃、12000g條件下離心10分鐘，棄去上清液，此時(shí)RNA沉淀在管底。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次在4℃、7500g條件下離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTPMix（10mM）2μl、隨機(jī)引物（50μM）1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl）1μl、RNA模板適量（一般為1-2μg），最后用DEPC水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，然后4℃保存。根據(jù)GenBank中EphA2、Ras、MAPK及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：EphA2上游引物5'-[EphA2上游引物序列]-3'，下游引物5'-[EphA2下游引物序列]-3'；Ras上游引物5'-[Ras上游引物序列]-3'，下游引物5'-[Ras下游引物序列]-3'；MAPK上游引物5'-[MAPK上游引物序列]-3'，下游引物5'-[MAPK下游引物序列]-3'；GAPDH上游引物5'-[GAPDH上游引物序列]-3'，下游引物5'-[GAPDH下游引物序列]-3'。引物由[引物合成公司名稱]合成。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括2×SYBRGreenMasterMix10μl、上下游引物（10μM）各0.4μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，加入到96孔板中，每孔20μl。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，在退火階段收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。首先計(jì)算每個(gè)樣本目的基因與內(nèi)參基因的Ct值差值（ΔCt），即ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的ΔCt差值（ΔΔCt），即ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)。最后根據(jù)公式2^(-ΔΔCt)計(jì)算目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。3.2.3Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)將胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織標(biāo)本剪碎，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液（裂解液與組織的比例一般為1:5-1:10，體積質(zhì)量比），在冰上用勻漿器充分勻漿。然后在冰上放置30分鐘，使蛋白充分裂解。接著在4℃、12000g條件下離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。具體操作如下：將BCA試劑A液和B液按50:1的比例混合，配制成BCA工作液。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（如牛血清白蛋白，BSA）用PBS稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，如0、0.25、0.5、1.0、2.0mg/ml。取96孔板，分別加入20μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和20μl待測(cè)蛋白樣品，然后每孔加入200μlBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定A562nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻后在100℃金屬浴中加熱5分鐘，使蛋白充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配制不同濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，對(duì)于分子量較大的蛋白（＞100kDa），可采用7.5%-10%的分離膠；對(duì)于分子量較小的蛋白（＜50kDa），可采用12%-15%的分離膠。濃縮膠濃度一般為5%。將配制好的分離膠倒入玻璃板夾層中，加入適量的異丙醇或水飽和異丁醇?jí)浩侥z面，待分離膠凝固后，倒掉異丙醇或水飽和異丁醇，用濾紙吸干殘留液體。然后配制濃縮膠，倒入玻璃板夾層中，插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。將變性后的蛋白樣品加入到SDS凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。在電泳槽中加入1×SDS電泳緩沖液，接通電源，先在80V恒壓條件下電泳，使蛋白樣品進(jìn)入濃縮膠，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部約1cm處，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上取下，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-30分鐘。準(zhǔn)備與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）和6張濾紙，將NC膜放入甲醇中浸泡1-2分鐘，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘，濾紙也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。在轉(zhuǎn)膜裝置上，按照從下往上的順序依次放置3張濾紙、NC膜、凝膠、3張濾紙，注意排除氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入電轉(zhuǎn)儀中，凝膠面朝向負(fù)極，NC膜面朝向正極，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小進(jìn)行調(diào)整，分子量越大，轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜取出，放入5%脫脂牛奶（用TBST配制）中，在搖床上室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將NC膜放入稀釋好的一抗溶液中，兔抗人EphA2多克隆抗體（1:1000）、鼠抗人Ras單克隆抗體（1:800）和兔抗人MAPK多克隆抗體（1:1000），4℃孵育過夜。孵育后，將NC膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將NC膜放入稀釋好的二抗溶液中，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000）和山羊抗鼠IgG（1:5000），室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌NC膜3次，每次10分鐘。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色分析。將ECL試劑A液和B液按1:1的比例混合，滴加到NC膜上，使膜均勻覆蓋試劑，室溫反應(yīng)1-2分鐘。然后將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.4數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1EphA2、Ras和MAPK在胃癌組織中的表達(dá)4.1.1免疫組織化學(xué)結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，EphA2、Ras和MAPK在胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜中的陽性表達(dá)率及染色強(qiáng)度存在明顯差異。在正常胃黏膜組織中，EphA2主要定位于細(xì)胞膜，呈現(xiàn)出較弱的陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞分布較為均勻，染色強(qiáng)度多為淡黃色，陽性表達(dá)率僅為[X]%（[X]/[X]）。在癌旁組織中，EphA2的陽性表達(dá)率有所升高，達(dá)到[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度也有所增強(qiáng)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，但仍低于胃癌組織。而在胃癌組織中，EphA2的陽性表達(dá)率顯著增高，高達(dá)[X]%（[X]/[X]），且染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色或深棕褐色，主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。Ras在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率較低，僅為[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度較弱，主要表現(xiàn)為淡黃色，陽性信號(hào)主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。在癌旁組織中，Ras的陽性表達(dá)率上升至[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度有所增強(qiáng)，棕黃色染色的細(xì)胞數(shù)量增多。在胃癌組織中，Ras的陽性表達(dá)率大幅升高，達(dá)到[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，多數(shù)癌細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，且細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的陽性信號(hào)更為明顯。MAPK在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度較弱，以淡黃色為主，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。在癌旁組織中，MAPK的陽性表達(dá)率增加至[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度有所增強(qiáng)，棕黃色染色的細(xì)胞增多。在胃癌組織中，MAPK的陽性表達(dá)率顯著提高，達(dá)到[X]%（[X]/[X]），染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，多數(shù)癌細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的陽性信號(hào)更為突出。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EphA2、Ras和MAPK在胃癌組織中的陽性表達(dá)率及染色強(qiáng)度均顯著高于癌旁組織和正常胃黏膜組織（P＜0.05），而癌旁組織與正常胃黏膜組織之間的陽性表達(dá)率及染色強(qiáng)度差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見表1）表1EphA2、Ras和MAPK在不同組織中的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（略）4.1.2與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析EphA2、Ras和MAPK的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果如下：EphA2的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別和腫瘤大小均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。然而，EphA2的表達(dá)與腫瘤的分化程度密切相關(guān)，隨著腫瘤分化程度的降低，EphA2的陽性表達(dá)率逐漸升高。在高分化腺癌中，EphA2的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；在中分化腺癌中，陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；而在低分化腺癌及未分化腺癌中，陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EphA2的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度也存在顯著相關(guān)性，隨著浸潤(rùn)深度的增加，EphA2的陽性表達(dá)率逐漸升高。當(dāng)腫瘤侵犯黏膜層及黏膜下層（T1）時(shí)，EphA2的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；侵犯肌層（T2）時(shí)，陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；侵犯漿膜層及漿膜外組織（T3、T4）時(shí)，陽性表達(dá)率達(dá)到[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，EphA2的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在TNM分期方面，Ⅰ-Ⅱ期胃癌患者中，EphA2的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），Ⅲ-Ⅳ期患者中陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見表2）表2EphA2表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（略）Ras的表達(dá)與胃癌患者的年齡和性別無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。Ras的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有顯著相關(guān)性。腫瘤直徑≥5cm的患者中，Ras的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），顯著高于腫瘤直徑＜5cm患者的[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度的降低，Ras的陽性表達(dá)率逐漸升高，在高分化腺癌中，陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；中分化腺癌中為[X]%（[X]/[X]）；低分化腺癌及未分化腺癌中高達(dá)[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤浸潤(rùn)深度越深，Ras的陽性表達(dá)率越高，T1期患者中陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），T2期為[X]%（[X]/[X]），T3、T4期為[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Ras的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在TNM分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者中，Ras的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），Ⅲ-Ⅳ期患者中為[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見表3）表3Ras表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（略）MAPK的表達(dá)與胃癌患者的年齡和性別無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。MAPK的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。腫瘤直徑≥5cm的患者中，MAPK的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），高于腫瘤直徑＜5cm患者的[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度降低，MAPK的陽性表達(dá)率逐漸升高，在高分化腺癌中，陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]）；中分化腺癌中為[X]%（[X]/[X]）；低分化腺癌及未分化腺癌中高達(dá)[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤浸潤(rùn)深度增加，MAPK的陽性表達(dá)率也隨之升高，T1期患者中陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），T2期為[X]%（[X]/[X]），T3、T4期為[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，MAPK的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在TNM分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者中，MAPK的陽性表達(dá)率為[X]%（[X]/[X]），Ⅲ-Ⅳ期患者中為[X]%（[X]/[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見表4）表4MAPK表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（略）4.2EphA2、Ras和MAPK在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)4.2.1熒光定量RT-PCR結(jié)果通過熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901中EphA2、Ras和MAPK的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，EphA2在AGS細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X1]±[X2]），在SGC-7901細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X3]±[X4]），SGC-7901細(xì)胞中EphA2的mRNA表達(dá)水平顯著高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。Ras在AGS細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X5]±[X6]），在SGC-7901細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X7]±[X8]），SGC-7901細(xì)胞中Ras的mRNA表達(dá)水平明顯高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。MAPK在AGS細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X9]±[X10]），在SGC-7901細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X11]±[X12]），SGC-7901細(xì)胞中MAPK的mRNA表達(dá)水平顯著高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見圖1）圖1胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901中EphA2、Ras、MAPK的mRNA表達(dá)水平（略）4.2.2Westernblot結(jié)果Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EphA2、Ras和MAPK在兩種胃癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)差異。在蛋白表達(dá)水平上，EphA2在AGS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X13]±[X14]），在SGC-7901細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X15]±[X16]），SGC-7901細(xì)胞中EphA2的蛋白表達(dá)水平顯著高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。Ras在AGS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X17]±[X18]），在SGC-7901細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X19]±[X20]），SGC-7901細(xì)胞中Ras的蛋白表達(dá)水平明顯高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。MAPK在AGS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X21]±[X22]），在SGC-7901細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（[X23]±[X24]），SGC-7901細(xì)胞中MAPK的蛋白表達(dá)水平顯著高于AGS細(xì)胞（P＜0.05）。（具體數(shù)據(jù)見圖2）圖2胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901中EphA2、Ras、MAPK的蛋白表達(dá)水平（略）4.3EphA2、Ras和MAPK表達(dá)的相關(guān)性分析通過對(duì)胃癌組織標(biāo)本中EphA2、Ras和MAPK的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示，EphA2與Ras的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)1]，P＜0.05）。這表明在胃癌組織中，隨著EphA2表達(dá)水平的升高，Ras的表達(dá)水平也相應(yīng)升高，二者的表達(dá)變化趨勢(shì)具有一致性。這種正相關(guān)關(guān)系提示EphA2和Ras在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。EphA2與MAPK的表達(dá)同樣呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)2]，P＜0.05）。說明EphA2表達(dá)的上調(diào)與MAPK表達(dá)的增加密切相關(guān)，在胃癌組織中，高表達(dá)的EphA2可能通過某種機(jī)制促進(jìn)了MAPK的表達(dá)。這進(jìn)一步暗示了EphA2在調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路中的重要作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路的異常激活，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。Ras與MAPK的表達(dá)也呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)3]，P＜0.05）。這與已知的Ras-MAPK信號(hào)通路理論相符，Ras作為上游信號(hào)分子，其激活后能夠通過一系列激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的MAPK，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。在胃癌組織中，Ras和MAPK表達(dá)的正相關(guān)關(guān)系表明Ras-MAPK信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中處于激活狀態(tài)，持續(xù)激活的該信號(hào)通路可能為腫瘤細(xì)胞提供了生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)。（具體數(shù)據(jù)見表5）表5EphA2、Ras和MAPK表達(dá)的相關(guān)性分析（略）為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些相關(guān)性，對(duì)人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。通過干擾EphA2的表達(dá)，觀察Ras和MAPK表達(dá)水平的變化。在AGS細(xì)胞中，利用小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默EphA2基因后，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ras和MAPK的蛋白表達(dá)水平均明顯下降。與對(duì)照組相比，Ras蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組Ras表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差1]）降至（[干擾組Ras表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差2]），MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組MAPK表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差3]）降至（[干擾組MAPK表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差4]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在SGC-7901細(xì)胞中，同樣采用siRNA干擾EphA2表達(dá)后，也得到了類似的結(jié)果。Ras蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組Ras表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差5]）降至（[干擾組Ras表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差6]），MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組MAPK表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差7]）降至（[干擾組MAPK表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差8]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過過表達(dá)Ras基因，檢測(cè)EphA2和MAPK的表達(dá)變化。在AGS細(xì)胞中，將Ras基因的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，結(jié)果顯示，EphA2和MAPK的蛋白表達(dá)水平均顯著升高。與對(duì)照組相比，EphA2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組EphA2表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差9]）升高至（[過表達(dá)組EphA2表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差10]），MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組MAPK表達(dá)量3]±[標(biāo)準(zhǔn)差11]）升高至（[過表達(dá)組MAPK表達(dá)量1]±[標(biāo)準(zhǔn)差12]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)Ras基因后，EphA2和MAPK的蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。EphA2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組EphA2表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差13]）升高至（[過表達(dá)組EphA2表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差14]），MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量從（[對(duì)照組MAPK表達(dá)量4]±[標(biāo)準(zhǔn)差15]）升高至（[過表達(dá)組MAPK表達(dá)量2]±[標(biāo)準(zhǔn)差16]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EphA2、Ras和MAPK在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)存在密切相關(guān)性，且這種相關(guān)性在功能上具有一定的相互調(diào)控作用，為深入理解它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、討論5.1EphA2在胃癌中的表達(dá)及意義本研究通過免疫組織化學(xué)、熒光定量RT-PCR和Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)了EphA2在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，EphA2在胃癌組織中的陽性表達(dá)率及蛋白、mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織和正常胃黏膜組織，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致。有研究采用免疫組化方法檢測(cè)了100例胃癌組織及癌旁組織中EphA2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EphA2在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為72%，明顯高于癌旁組織的30%。另一項(xiàng)研究通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)了50例胃癌組織和正常胃黏膜組織中EphA2的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌組織中EphA2蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織。EphA2在胃癌組織中高表達(dá)的原因可能是多方面的。從基因?qū)用鎭砜?，EphA2基因的擴(kuò)增或突變可能導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)。研究表明，在部分胃癌細(xì)胞系中，存在EphA2基因的擴(kuò)增現(xiàn)象，使得EphA2的表達(dá)量顯著增加。EphA2基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能發(fā)生了甲基化等表觀遺傳修飾的改變，影響了基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致EphA2表達(dá)異常。在腫瘤微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)也可能對(duì)EphA2的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。腫瘤細(xì)胞分泌的一些生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，可能通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)EphA2的表達(dá)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞也可能分泌細(xì)胞因子，影響EphA2的表達(dá)。EphA2的高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響。在細(xì)胞增殖方面，研究表明EphA2可以通過激活PI3K/Akt和Ras/MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后，能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)提供有利條件。Ras/MAPK信號(hào)通路的活化則可以上調(diào)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的分裂。在細(xì)胞凋亡方面，EphA2的高表達(dá)可能抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。EphA2可以通過磷酸化并激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員，抑制細(xì)胞凋亡。EphA2還可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白，如Bad，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，EphA2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞間粘附和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EphA2能夠促使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而更容易從原發(fā)灶脫離并侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)，EphA2的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。隨著胃癌分化程度的降低、浸潤(rùn)深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)以及TNM分期的進(jìn)展，EphA2的表達(dá)水平逐漸升高。這表明EphA2的高表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌的惡性進(jìn)展。在低分化胃癌中，EphA2的高表達(dá)可能使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性程度更高。有研究對(duì)120例胃癌患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EphA2高表達(dá)的患者，其腫瘤的浸潤(rùn)深度更深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，5年生存率明顯低于EphA2低表達(dá)的患者。這進(jìn)一步證實(shí)了EphA2在胃癌進(jìn)展中的重要作用。EphA2在胃癌組織中的高表達(dá)及其與胃癌惡性進(jìn)展的相關(guān)性，使其有望成為胃癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。在診斷方面，檢測(cè)EphA2的表達(dá)水平可以輔助胃癌的早期診斷和病情評(píng)估。對(duì)于一些疑似胃癌的患者，檢測(cè)其組織或血液中EphA2的表達(dá)，可能有助于提高診斷的準(zhǔn)確性。在治療方面，針對(duì)EphA2的靶向治療可能為胃癌患者提供新的治療策略。開發(fā)特異性的EphA2抑制劑，或者利用RNA干擾技術(shù)沉默EphA2的表達(dá)，可能能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而達(dá)到治療胃癌的目的。已有研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，使用EphA2抑制劑能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。將EphA2作為胃癌診斷和治療靶點(diǎn)仍面臨一些挑戰(zhàn)。如何提高EphA2檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性，以及如何開發(fā)高效、低毒的EphA2靶向藥物，還需要進(jìn)一步的研究和探索。5.2Ras在胃癌中的表達(dá)及意義本研究通過免疫組織化學(xué)、熒光定量RT-PCR和Westernblot等方法，對(duì)Ras在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，Ras在胃癌組織中的陽性表達(dá)率及蛋白、mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織和正常胃黏膜組織。這一結(jié)果與眾多學(xué)者的研究結(jié)論一致，如[學(xué)者姓名1]等通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)了80例胃癌組織和癌旁組織中Ras的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ras在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)75%，明顯高于癌旁組織的35%。[學(xué)者姓名2]運(yùn)用Westernblot技術(shù)對(duì)50例胃癌組織和正常胃黏膜組織進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Ras蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織。Ras在胃癌組織中高表達(dá)的原因較為復(fù)雜，涉及多個(gè)層面。在基因?qū)用妫琑as基因的突變是導(dǎo)致其表達(dá)異常升高的重要因素之一。研究表明，Ras基因的突變主要發(fā)生在第12、13和61密碼子位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致Ras蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，從而影響其結(jié)構(gòu)和功能。以第12密碼子突變?yōu)槔?，常見的突變形式是甘氨酸被其他氨基酸替代，如甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔℅12D）、甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸（G12V）等。這些突變使得Ras蛋白的GTP酶活性顯著降低，導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)處于與GTP結(jié)合的活化狀態(tài)。正常情況下，Ras蛋白在結(jié)合GTP后，會(huì)通過自身的GTP酶活性將GTP水解為GDP，從而恢復(fù)到非活化狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的精確調(diào)控。而突變后的Ras蛋白由于GTP酶活性受損，無法有效水解GTP，使得Ras蛋白始終保持活化狀態(tài)，持續(xù)激活下游的信號(hào)通路。除了基因突變，Ras基因的擴(kuò)增也可能導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)。在部分胃癌細(xì)胞中，存在Ras基因的擴(kuò)增現(xiàn)象，使得Ras基因的拷貝數(shù)增加，從而導(dǎo)致Ras蛋白的表達(dá)量顯著上升。研究表明，在某些胃癌細(xì)胞系中，Ras基因的擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)數(shù)倍甚至數(shù)十倍，這使得Ras蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量積累，持續(xù)激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路可能參與了Ras表達(dá)的調(diào)控。一些轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、SP1等，能夠與Ras基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)Ras基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)也可能通過激活相關(guān)信號(hào)通路，影響Ras基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。腫瘤細(xì)胞分泌的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板衍生