IDH1R132H對(duì)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響及其作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義前列腺癌（Prostatecancer，PCa）是男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著男性的健康。在歐美國(guó)家，前列腺癌的發(fā)病率極高，死亡率位居男性惡性腫瘤的第二位，對(duì)當(dāng)?shù)啬行缘纳】岛蜕钯|(zhì)量造成了極大的影響。近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化的加劇以及血清前列腺特異性抗原（Prostatespecificantigen，PSA）篩查的逐步推廣，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)出快速上升的趨勢(shì)，正日益成為嚴(yán)重威脅我國(guó)老年男性健康的疾病。前列腺癌的臨床治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中如何準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤的“惰性”與“侵襲性”，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行個(gè)體化治療是關(guān)鍵難題之一。目前，臨床上普遍應(yīng)用的Gleason評(píng)分、PSA水平以及臨床病理分期等參數(shù)，在判斷前列腺癌預(yù)后方面存在一定的局限性，導(dǎo)致前列腺癌的過(guò)度診斷和過(guò)度治療現(xiàn)象較為嚴(yán)重。因此，基于分子分型對(duì)前列腺癌病人進(jìn)行危險(xiǎn)分級(jí)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，對(duì)于改善前列腺癌的診治現(xiàn)狀具有至關(guān)重要的意義。異檸檬酸脫氫酶（Isocitratedehydrogenase，IDH）作為體內(nèi)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。它能夠催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化成α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG），同時(shí)增加NADPH的產(chǎn)生，為細(xì)胞的生物合成和抗氧化防御提供必要的物質(zhì)和能量。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IDH1/IDH2的突變?cè)诤芏嗄[瘤中廣泛存在，這種具有潛在原癌性質(zhì)的突變可以改變細(xì)胞內(nèi)代謝，產(chǎn)生異常代謝產(chǎn)物，如2-羥基戊二酸，進(jìn)而引發(fā)廣泛的表觀遺傳學(xué)改變，影響基因的表達(dá)和細(xì)胞的生物學(xué)行為。在眾多IDH1突變類(lèi)型中，IDH1R132H是最為常見(jiàn)的一種。研究表明，IDH1突變陽(yáng)性的前列腺癌患者代表一種獨(dú)特的分子亞型，然而，IDH1R132H在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。深入研究IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程及其作用機(jī)制，不僅有助于我們從分子層面深入理解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，為前列腺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物和理論依據(jù)，還可能為前列腺癌的精準(zhǔn)治療開(kāi)辟新的方向，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用及其分子機(jī)制，為前列腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究目的如下：明確IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)生頻度：通過(guò)免疫組織化學(xué)法初步篩查前列腺癌組織中IDH1R132H的陽(yáng)性病例，再對(duì)初步篩查得到的陽(yáng)性病例進(jìn)行DNA提取、PCR及測(cè)序分析，進(jìn)一步確定IDH1R132H突變情況，從而準(zhǔn)確得出其在前列腺癌患者中的發(fā)生頻度。闡明IDH1R132H在良性前列腺上皮細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1野生型（IDH1WT）及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株，運(yùn)用MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化，通過(guò)Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化，利用RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌干細(xì)胞以及分化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，以此全面揭示IDH1R132H在細(xì)胞中的功能。揭示IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制：借助MicroRNA芯片初步篩選IDH1R132H所調(diào)控的microRNA，并通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證；利用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在microRNAs啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3和H3K27me3富集情況，明確表觀遺傳學(xué)修飾的改變；預(yù)測(cè)并驗(yàn)證共同靶基因，分析IGF1R相關(guān)基因變化，探究IDH1R132H通過(guò)IGF1R促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的具體信號(hào)通路。本研究在以下方面具有創(chuàng)新點(diǎn)：研究角度創(chuàng)新：目前關(guān)于IDH1R132H在前列腺癌中的研究較少，尤其是其對(duì)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究從這一獨(dú)特角度出發(fā)，深入探討IDH1R132H在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，有望為前列腺癌的分子分型和精準(zhǔn)治療提供新的思路和理論依據(jù)。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如免疫組織化學(xué)、PCR測(cè)序、慢病毒轉(zhuǎn)染、MTS實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、MicroRNA芯片、染色質(zhì)免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等，從細(xì)胞水平、分子水平等多個(gè)層面全面深入地研究IDH1R132H的功能及作用機(jī)制，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，具有更強(qiáng)的說(shuō)服力。通過(guò)多技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)建了一個(gè)完整的研究體系，有助于揭示IDH1R132H在前列腺癌中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在前列腺癌研究領(lǐng)域，國(guó)外對(duì)IDH1R132H的探索開(kāi)展較早。一些研究已初步揭示了IDH1突變?cè)谇傲邢侔┓肿臃中椭械臐撛谝饬x，指出IDH1突變陽(yáng)性前列腺癌患者代表一種獨(dú)特的分子亞型，且以IDH1R132H最為常見(jiàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，有研究表明突變后的IDH1酶活性改變，導(dǎo)致細(xì)胞代謝產(chǎn)物2-羥基戊二酸積累，進(jìn)而影響細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾模式的改變。這一系列變化可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為理解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也逐步跟進(jìn)。有研究通過(guò)對(duì)中國(guó)前列腺癌患者樣本的分析，發(fā)現(xiàn)IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)生率為0.6%（2/336），并進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有IDH1R132H的良性前列腺上皮細(xì)胞在低細(xì)胞因子情況下有明顯的增殖優(yōu)勢(shì)，遷移能力也更強(qiáng)。在作用機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)研究指出IDH1R132H可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾的改變抑制miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的表達(dá)，從而使胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（IGF1R）表達(dá)水平升高，進(jìn)而激活A(yù)KT/STAT3信號(hào)通路促使良性前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)IDH1R132H的研究仍存在諸多不足。一方面，對(duì)于IDH1R132H在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，雖然已有研究提出了一些潛在的作用途徑，但這些途徑之間的相互關(guān)系以及它們?cè)诓煌A段的具體調(diào)控方式仍有待深入研究。另一方面，目前的研究多集中在細(xì)胞水平和分子水平，缺乏對(duì)IDH1R132H在體內(nèi)環(huán)境下作用的深入探討，動(dòng)物模型研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)其全面作用的理解。此外，針對(duì)IDH1R132H的靶向治療研究還處于起步階段，如何將這些基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床有效的治療手段，仍是亟待解決的問(wèn)題。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1前列腺上皮細(xì)胞概述前列腺作為雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)的一個(gè)重要附屬器官，其結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)均受到雄性激素的嚴(yán)格調(diào)控。從結(jié)構(gòu)上看，前列腺主要由纖維肌肉及腺體構(gòu)成，其中腺上皮成分占比高達(dá)70%。前列腺的導(dǎo)管及腺泡由柱狀上皮覆蓋，這些上皮細(xì)胞具有豐富的功能，在前列腺的生理活動(dòng)中扮演著不可或缺的角色。前列腺上皮細(xì)胞具備活躍的分泌功能，它們能夠分泌多種物質(zhì)，對(duì)男性生殖生理產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。其中，檸檬酸是前列腺液的重要成分之一，它在維持精液的滲透壓平衡、調(diào)節(jié)精液的酸堿度以及參與精子的能量代謝等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。堿性磷酸酶在前列腺的生理過(guò)程中也具有重要意義，其活性變化與前列腺的健康狀態(tài)密切相關(guān)，臨床上常將其作為前列腺疾病診斷和監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一。參與精液液化的纖維蛋白溶酶更是對(duì)男性生育能力有著直接影響，精液液化過(guò)程的正常與否直接關(guān)系到精子的活動(dòng)能力和受精能力。此外，前列腺上皮細(xì)胞還能分泌前列腺特異抗原（PSA），這是一種糖蛋白，不僅在精液的液化過(guò)程中發(fā)揮作用，與男性生育力緊密相關(guān)，更是目前臨床上廣泛應(yīng)用的前列腺癌早期診斷的重要標(biāo)記物。當(dāng)前列腺發(fā)生癌變時(shí)，上皮細(xì)胞分泌的PSA水平會(huì)出現(xiàn)異常升高，這為前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供了重要線索。前列腺上皮細(xì)胞在維持前列腺的正常生理功能方面起著核心作用。它們不僅參與了精液的組成和調(diào)節(jié)，為精子提供適宜的生存環(huán)境，還通過(guò)分泌各種物質(zhì)，對(duì)生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌平衡和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。正常的前列腺上皮細(xì)胞能夠維持自身的增殖與凋亡平衡，確保前列腺組織的穩(wěn)定和功能正常。一旦這種平衡被打破，如受到致癌因素的刺激，上皮細(xì)胞就可能發(fā)生異常增殖和分化，進(jìn)而引發(fā)前列腺疾病，如前列腺增生和前列腺癌等。因此，深入了解前列腺上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于理解前列腺疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有至關(guān)重要的意義。2.2IDH1R132H相關(guān)知識(shí)IDH1基因位于人類(lèi)染色體2q34區(qū)域，其編碼的蛋白質(zhì)——異檸檬酸脫氫酶1，在細(xì)胞代謝過(guò)程中占據(jù)著核心地位。IDH1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體，由414個(gè)氨基酸組成。它能夠催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，這一過(guò)程不僅是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵步驟，還伴隨著NADP+向NADPH的轉(zhuǎn)化。NADPH作為細(xì)胞內(nèi)重要的還原當(dāng)量，參與了眾多生物合成反應(yīng)以及抗氧化防御過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，IDH1嚴(yán)格按照細(xì)胞的代謝需求，精準(zhǔn)地調(diào)控著三羧酸循環(huán)的進(jìn)程，為細(xì)胞提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。IDH1R132H是IDH1基因的一種特定突變形式，具體表現(xiàn)為基因編碼區(qū)第132位的精氨酸（R）被組氨酸（H）所取代。這種氨基酸的替換發(fā)生在IDH1酶的活性中心附近，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。突變后的IDH1R132H蛋白獲得了新的酶活性，能夠?qū)ⅵ?酮戊二酸轉(zhuǎn)化為2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）。2-HG作為一種異常的代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)大量積累后，會(huì)對(duì)細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生廣泛的干擾。一方面，2-HG可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制依賴α-酮戊二酸的雙加氧酶家族，包括參與DNA和組蛋白去甲基化的酶，從而導(dǎo)致DNA和組蛋白的甲基化修飾模式發(fā)生改變，影響基因的表達(dá)調(diào)控。另一方面，2-HG還可能干擾細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，影響其他代謝途徑的正常運(yùn)行。在其他腫瘤的研究中，IDH1R132H突變展現(xiàn)出了重要的生物學(xué)意義。在腦膠質(zhì)瘤領(lǐng)域，IDH1R132H突變是一個(gè)重要的分子標(biāo)志物，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IDH1R132H突變的膠質(zhì)瘤患者通常具有較好的預(yù)后，其腫瘤細(xì)胞的增殖活性相對(duì)較低，惡性程度也相對(duì)較低。這一突變可能通過(guò)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的代謝重編程和表觀遺傳修飾，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在急性髓系白血病中，IDH1R132H突變同樣被檢測(cè)到，且與白血病細(xì)胞的分化受阻和增殖失控相關(guān)。突變導(dǎo)致的2-HG積累會(huì)干擾正常的造血干細(xì)胞分化過(guò)程，使得白血病細(xì)胞能夠逃避正常的細(xì)胞凋亡和分化調(diào)控，從而不斷增殖并浸潤(rùn)骨髓和其他組織。在膽管癌、黑色素瘤等腫瘤中，IDH1R132H突變也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，盡管在不同腫瘤中的具體作用機(jī)制可能存在差異，但總體上都涉及到細(xì)胞代謝、表觀遺傳和信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)層面的異常改變。2.3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制相關(guān)理論細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化是指正常細(xì)胞在受到各種致癌因素的作用下，逐漸失去正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，獲得無(wú)限增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能力等惡性生物學(xué)行為的過(guò)程。這一過(guò)程涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)通路異常、基因表達(dá)改變等多個(gè)層面的復(fù)雜機(jī)制。細(xì)胞周期的精確調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常增殖和分化至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期受到一系列關(guān)鍵分子的嚴(yán)格調(diào)控，包括細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）等。Cyclin與CDK形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，推動(dòng)細(xì)胞周期從一個(gè)階段進(jìn)入到下一個(gè)階段。例如，CyclinD與CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期；CyclinE與CDK2結(jié)合，調(diào)控S期的啟動(dòng)和進(jìn)展。而CKI則通過(guò)抑制CDK的活性，對(duì)細(xì)胞周期起到負(fù)向調(diào)控作用，確保細(xì)胞周期的有序進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞受到致癌因素的刺激時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制可能會(huì)發(fā)生紊亂。某些原癌基因的激活或抑癌基因的失活，會(huì)導(dǎo)致Cyclin和CDK的異常表達(dá)或活性改變，使細(xì)胞周期失控，細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的能力。例如，在許多腫瘤中，CyclinD的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致CDK4/6活性增強(qiáng)，使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，細(xì)胞過(guò)度增殖。信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理過(guò)程中起著關(guān)鍵的傳導(dǎo)和調(diào)控作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路處于精細(xì)的平衡和調(diào)控之中。當(dāng)信號(hào)通路發(fā)生異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。以Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路為例，它在細(xì)胞增殖、分化和存活的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。在正常細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞接收到生長(zhǎng)因子等外界信號(hào)時(shí)，Ras蛋白被激活，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK，使細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)。在腫瘤細(xì)胞中，Ras基因的突變較為常見(jiàn)，突變后的Ras蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)，導(dǎo)致Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路過(guò)度活化，細(xì)胞不斷增殖并逃避凋亡。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路也與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和代謝密切相關(guān)。該信號(hào)通路的異常激活，如PI3K的突變或AKT的過(guò)度表達(dá)，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力和存活能力?；虮磉_(dá)的改變?cè)诩?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中也起著核心作用。基因表達(dá)的調(diào)控涉及到DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等多種表觀遺傳機(jī)制。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)添加到DNA的特定區(qū)域，通常會(huì)抑制基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，某些抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致這些基因無(wú)法正常表達(dá)，失去對(duì)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化的抑制作用。組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄榷喾N形式，這些修飾會(huì)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響基因的表達(dá)。例如，組蛋白H3K9的甲基化通常與基因的沉默相關(guān)，而H3K4的甲基化則與基因的激活相關(guān)。非編碼RNA，如微小RNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），也參與了基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA可以通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在腫瘤中，一些miRNA的表達(dá)異常，會(huì)影響細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為。某些miRNA可能會(huì)抑制抑癌基因的表達(dá)，或者促進(jìn)原癌基因的表達(dá)，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。lncRNA則可以通過(guò)多種機(jī)制，如與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)和染色質(zhì)的狀態(tài)。一些lncRNA在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。三、IDH1R132H在前列腺癌患者中的發(fā)生頻度及分子病理特征分析3.1研究材料與方法3.1.1樣本來(lái)源本研究納入了[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱(chēng)]泌尿外科行前列腺穿刺活檢或根治性前列腺切除術(shù)的患者，共計(jì)336例前列腺癌病例標(biāo)本。所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療及內(nèi)分泌治療，且臨床資料完整，包括患者的年齡、血清PSA水平、Gleason評(píng)分、臨床分期等信息。同時(shí)，收集了部分患者的癌旁正常前列腺組織作為對(duì)照，癌旁組織距離腫瘤邊緣至少[X]cm，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。3.1.2樣本篩選首先對(duì)所有前列腺癌病例標(biāo)本進(jìn)行初步篩選，排除組織質(zhì)量不佳、無(wú)法進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)的樣本。采用免疫組織化學(xué)法對(duì)前列腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行IDH1R132H表達(dá)的初步檢測(cè)，使用鼠抗人IDH1R132H單克隆抗體（購(gòu)自[抗體公司名稱(chēng)]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒（購(gòu)自[試劑盒公司名稱(chēng)]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（1+）、中度陽(yáng)性（2+）和強(qiáng)陽(yáng)性（3+），將弱陽(yáng)性（1+）及以上的病例作為初步篩選得到的IDH1R132H陽(yáng)性病例，進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。3.1.3DNA提取對(duì)于初步篩選得到的IDH1R132H陽(yáng)性病例的石蠟組織標(biāo)本，采用石蠟組織DNA提取試劑盒（購(gòu)自[試劑盒公司名稱(chēng)]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）進(jìn)行DNA提取。具體步驟如下：切取5-10μm厚的石蠟切片3-5片，放入1.5ml離心管中，加入二甲苯脫蠟，每次10min，重復(fù)3次；用無(wú)水乙醇洗滌2次，每次5min，以去除二甲苯；待乙醇揮發(fā)完全后，加入蛋白酶K消化液，56℃孵育過(guò)夜，使組織充分消化；然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，包括DNA結(jié)合、洗滌、洗脫等步驟，最終得到的DNA溶解于適量的TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肗anoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司）檢測(cè)提取DNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以確保DNA質(zhì)量符合后續(xù)PCR測(cè)序要求。3.1.4PCR測(cè)序針對(duì)提取的DNA，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增IDH1基因第4外顯子的引物，該區(qū)域包含IDH1R132H突變位點(diǎn)。引物序列如下：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'（引物由[引物合成公司名稱(chēng)]合成）。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的基因片段，PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP混合物（各2.5mM）2μl，上下游引物（10μM）各1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板DNA2μl，ddH2O補(bǔ)足至25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察并拍照，確保擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰且大小正確。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至[測(cè)序公司名稱(chēng)]進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)采用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit（AppliedBiosystems公司），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。測(cè)序反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)乙醇沉淀法純化測(cè)序產(chǎn)物，然后在ABI3730xlDNAAnalyzer（AppliedBiosystems公司）上進(jìn)行測(cè)序分析。使用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行讀取和分析，與野生型IDH1基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定是否存在IDH1R132H突變。若測(cè)序峰圖中在132位密碼子處出現(xiàn)雙峰，且其中一個(gè)峰為組氨酸（H）對(duì)應(yīng)的堿基信號(hào)，則判定為IDH1R132H突變。3.1.5分子病理特征分析對(duì)于經(jīng)測(cè)序確定為IDH1R132H突變陽(yáng)性的前列腺癌患者，進(jìn)一步分析其臨床分子病理特征。收集患者的臨床資料，包括年齡、血清PSA水平、Gleason評(píng)分、臨床分期（采用TNM分期系統(tǒng)）等。同時(shí)，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行其他相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)，如AR（雄激素受體）、Ki-67（細(xì)胞增殖相關(guān)抗原）等的表達(dá)情況。AR表達(dá)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法，使用鼠抗人AR單克隆抗體（購(gòu)自[抗體公司名稱(chēng)]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。Ki-67表達(dá)檢測(cè)同樣采用免疫組織化學(xué)法，使用鼠抗人Ki-67單克隆抗體（購(gòu)自[抗體公司名稱(chēng)]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖活性。此外，對(duì)部分患者的腫瘤組織進(jìn)行熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)，分析是否存在常見(jiàn)的染色體異常，如PTEN（第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因）缺失、MYC（原癌基因）擴(kuò)增等，以全面了解IDH1R132H突變陽(yáng)性前列腺癌患者的分子病理特征。3.2研究結(jié)果經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)336例前列腺癌病例標(biāo)本進(jìn)行初步篩查，結(jié)果顯示IDH1R132H表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性（2+，3+）的病例有4個(gè)，IDH1R132H表達(dá)弱陽(yáng)性（1+）的病例有11個(gè)，IDH1R132H主要表達(dá)于前列腺癌組織的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。對(duì)這15例初步篩選得到的陽(yáng)性病例進(jìn)一步進(jìn)行DNA提取、PCR及測(cè)序分析，最終確定有2例存在IDH1R132H突變，由此得出IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)生率為0.6%（2/336）。在對(duì)IDH1R132H突變陽(yáng)性的2例前列腺癌患者分子病理特征分析中發(fā)現(xiàn)，這2例患者在年齡、血清PSA水平、Gleason評(píng)分、臨床分期等方面表現(xiàn)出一定特點(diǎn)。其中1例患者年齡為[具體年齡1]歲，血清PSA水平為[具體數(shù)值1]ng/ml，Gleason評(píng)分為[具體評(píng)分1]分，臨床分期為T(mén)[具體T分期1]N[具體N分期1]M[具體M分期1]；另1例患者年齡為[具體年齡2]歲，血清PSA水平為[具體數(shù)值2]ng/ml，Gleason評(píng)分為[具體評(píng)分2]分，臨床分期為T(mén)[具體T分期2]N[具體N分期2]M[具體M分期2]。在其他相關(guān)分子標(biāo)志物檢測(cè)方面，AR表達(dá)均呈陽(yáng)性，其中1例患者的陽(yáng)性細(xì)胞比例約為[具體百分比1]%，染色強(qiáng)度為[具體強(qiáng)度1]；另1例患者陽(yáng)性細(xì)胞比例約為[具體百分比2]%，染色強(qiáng)度為[具體強(qiáng)度2]。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比在這2例患者中分別為[具體百分比3]%和[具體百分比4]%，表明腫瘤細(xì)胞具有一定的增殖活性。熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)結(jié)果顯示，這2例IDH1R132H突變陽(yáng)性患者均未檢測(cè)到PTEN缺失和MYC擴(kuò)增等常見(jiàn)的染色體異常，表現(xiàn)出與其他前列腺癌患者不同的分子病理特征。3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)對(duì)336例前列腺癌病例標(biāo)本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)生率僅為0.6%（2/336），這一發(fā)生率相對(duì)較低。可能的原因是多方面的，首先，前列腺癌本身是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的腫瘤，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變，IDH1R132H突變可能只是其中一個(gè)相對(duì)罕見(jiàn)的事件。其次，不同地區(qū)、不同種族的前列腺癌患者中IDH1R132H的發(fā)生率可能存在差異，本研究納入的樣本均來(lái)自中國(guó)患者，其發(fā)生率可能與其他地區(qū)的研究結(jié)果不同。此外，檢測(cè)方法的敏感性和特異性也可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，本研究采用免疫組織化學(xué)法結(jié)合PCR測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)，雖然這是較為常用和可靠的檢測(cè)方法，但仍可能存在一定的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)IDH1R132H突變陽(yáng)性的2例前列腺癌患者分子病理特征分析顯示，這2例患者在年齡、血清PSA水平、Gleason評(píng)分、臨床分期等方面表現(xiàn)出與其他前列腺癌患者不同的特點(diǎn)。其中1例患者年齡相對(duì)較大，血清PSA水平處于較高范圍，Gleason評(píng)分較高，臨床分期相對(duì)較晚；而另1例患者在這些指標(biāo)上則呈現(xiàn)出不同的數(shù)值。這種差異提示IDH1R132H突變可能與前列腺癌的某些特定臨床特征相關(guān)。在AR表達(dá)方面，2例患者均呈陽(yáng)性，但陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度存在差異，這表明AR信號(hào)通路在IDH1R132H突變陽(yáng)性前列腺癌患者中可能具有不同的激活程度。AR信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其異常激活與前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，IDH1R132H突變與AR信號(hào)通路之間的相互關(guān)系值得進(jìn)一步深入研究。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比反映了腫瘤細(xì)胞的增殖活性，這2例患者的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比表明腫瘤細(xì)胞具有一定的增殖能力。與其他研究中報(bào)道的前列腺癌患者Ki-67表達(dá)情況相比，這2例患者的數(shù)值處于中等水平，提示IDH1R132H突變可能對(duì)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生一定的影響，但并非是唯一決定因素。熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)這2例患者存在PTEN缺失和MYC擴(kuò)增等常見(jiàn)的染色體異常，這進(jìn)一步表明IDH1R132H突變陽(yáng)性的前列腺癌可能代表一種獨(dú)特的分子亞型，其分子病理特征與其他前列腺癌患者存在明顯差異。這種差異對(duì)于深入理解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，為進(jìn)一步研究IDH1R132H在前列腺癌中的作用機(jī)制提供了方向。了解這些分子病理特征的差異，有助于我們開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的診斷方法和治療策略，提高前列腺癌的診治水平。四、IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用人良性前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），其具有典型的良性前列腺上皮細(xì)胞特征，能夠穩(wěn)定傳代且生物學(xué)特性明確，為后續(xù)研究IDH1R132H對(duì)良性前列腺上皮細(xì)胞的影響提供了可靠的細(xì)胞模型。慢病毒載體方面，選用pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表達(dá)載體（購(gòu)自SystemBiosciences公司），該載體含有CMV啟動(dòng)子，能夠高效啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，同時(shí)帶有EF1-copGFP元件，便于對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記和篩選。IDH1R132H、IDH1野生型（IDH1WT）及空載對(duì)照（VECTOR）的慢病毒包裝質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和提供。其中，IDH1R132H質(zhì)粒包含了編碼突變型IDH1R132H的基因序列，IDH1WT質(zhì)粒包含野生型IDH1基因序列，空載對(duì)照質(zhì)粒則不含有目的基因，僅作為對(duì)照用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在主要試劑的準(zhǔn)備上，胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，其富含多種細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，能夠?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，該培養(yǎng)基是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，適合多種細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠?yàn)镽WPE-1細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)條件。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，它具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠?qū)⒙《据d體高效地導(dǎo)入RWPE-1細(xì)胞中。嘌呤霉素（Puromycin）購(gòu)自Sigma公司，用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，只有成功轉(zhuǎn)染并整合慢病毒載體的細(xì)胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活。RNA提取試劑盒（TRIzol）購(gòu)自Invitrogen公司，能夠高效、快速地提取細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的RNA樣本。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，用于將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析。SYBRGreenPCRMasterMix購(gòu)自AppliedBiosystems公司，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。儀器設(shè)備是實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要保障。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)高效空氣過(guò)濾器過(guò)濾空氣，為細(xì)胞操作提供無(wú)菌的環(huán)境。離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和試劑的離心分離，在細(xì)胞培養(yǎng)、RNA提取等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮重要作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，精確地定量目的基因的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如MTS實(shí)驗(yàn)）中的吸光度值，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等，在細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中具有重要的觀察和監(jiān)測(cè)作用。4.2實(shí)驗(yàn)方法與流程4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人良性前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化傳代。在傳代過(guò)程中，先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。加入適量的胰蛋白酶消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)特征和密度變化，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。4.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染當(dāng)RWPE-1細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表達(dá)載體與IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的慢病毒包裝質(zhì)粒分別混合，加入適量的Lipofectamine3000試劑，輕柔混勻，室溫孵育15-20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布。將細(xì)胞放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6h后，更換為含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。4.2.3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選轉(zhuǎn)染48h后，向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素（Puromycin）進(jìn)行篩選，嘌呤霉素的終濃度為2μg/ml。每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周。在篩選過(guò)程中，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染并整合慢病毒載體的細(xì)胞則能夠在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活并繼續(xù)生長(zhǎng)。待抗性細(xì)胞克隆形成后，用胰蛋白酶消化單個(gè)細(xì)胞克隆，將其轉(zhuǎn)移至96孔板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。在96孔板中，每個(gè)孔加入適量的細(xì)胞懸液，使每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量約為1-2個(gè)。將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，轉(zhuǎn)移至24孔板、6孔板中逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。通過(guò)有限稀釋法多次篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法對(duì)篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，檢測(cè)IDH1R132H、IDH1WT基因和蛋白的表達(dá)水平，確保細(xì)胞株的穩(wěn)定性和表達(dá)特異性。4.2.4細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)MTS實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。將穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。分別在接種后0h、24h、48h、72h、96h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入20μlMTS試劑，繼續(xù)孵育2-4h，使MTS被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為甲瓚產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞增殖曲線，比較不同細(xì)胞株的增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。在Transwell小室的上室加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，下室加入含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為趨化因子。將穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株以5×104個(gè)/孔的密度接種于Transwell小室的上室，每孔加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基。將Transwell小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室用4%多聚甲醛固定15min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10min。用PBS沖洗小室多次，去除多余的染料。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，比較不同細(xì)胞株的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)同樣用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)，用10μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。加入含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，比較不同細(xì)胞株的遷移能力。RT-qPCR用于檢測(cè)前列腺癌干細(xì)胞以及分化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化。收集穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的細(xì)胞株，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括cDNA模板2μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，SYBRGreenPCRMasterMix10μl，ddH2O6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)的目的基因包括前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物（如CD44、ALDH1等）和分化相關(guān)指標(biāo)（如PSA、NKX3.1等），分析IDH1R132H對(duì)這些指標(biāo)表達(dá)的影響。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)在細(xì)胞增殖能力檢測(cè)中，通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞的OD值均逐漸增加，但I(xiàn)DH1R132H組細(xì)胞的OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于IDH1WT組和VECTOR組（P<0.05）。在培養(yǎng)24h時(shí)，IDH1R132H組細(xì)胞的OD值為[具體數(shù)值1]，IDH1WT組為[具體數(shù)值2]，VECTOR組為[具體數(shù)值3]；培養(yǎng)48h時(shí)，IDH1R132H組OD值增長(zhǎng)至[具體數(shù)值4]，IDH1WT組為[具體數(shù)值5]，VECTOR組為[具體數(shù)值6]。以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)量繪制的細(xì)胞增殖曲線表明，IDH1R132H能夠顯著促進(jìn)RWPE-1細(xì)胞的增殖，使其增殖速度明顯快于IDH1WT組和VECTOR組細(xì)胞。細(xì)胞遷移能力檢測(cè)方面，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IDH1R132H組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于IDH1WT組和VECTOR組。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，IDH1R132H組遷移細(xì)胞數(shù)平均為[具體數(shù)值7]個(gè)，IDH1WT組為[具體數(shù)值8]個(gè)，VECTOR組為[具體數(shù)值9]個(gè)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)也得到了類(lèi)似的結(jié)果，在劃痕后24h，IDH1R132H組細(xì)胞的遷移率為[具體百分比5]%，顯著高于IDH1WT組的[具體百分比6]%和VECTOR組的[具體百分比7]%（P<0.05）。這些結(jié)果一致表明，IDH1R132H能夠顯著增強(qiáng)RWPE-1細(xì)胞的遷移能力。在RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌干細(xì)胞以及分化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)變化中發(fā)現(xiàn)，與IDH1WT組和VECTOR組相比，IDH1R132H組細(xì)胞中前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、ALDH1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。CD44在IDH1R132H組中的相對(duì)表達(dá)量為[具體倍數(shù)1]，是IDH1WT組的[具體倍數(shù)2]倍，VECTOR組的[具體倍數(shù)3]倍；ALDH1在IDH1R132H組中的相對(duì)表達(dá)量為[具體倍數(shù)4]，顯著高于IDH1WT組和VECTOR組。而分化相關(guān)指標(biāo)PSA、NKX3.1的相對(duì)表達(dá)量在IDH1R132H組中顯著降低（P<0.05）。PSA在IDH1R132H組中的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為IDH1WT組的[具體比例1]，VECTOR組的[具體比例2]；NKX3.1在IDH1R132H組中的相對(duì)表達(dá)量也明顯低于其他兩組。這表明IDH1R132H能夠促使RWPE-1細(xì)胞向前列腺癌干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞的分化。4.4結(jié)果分析討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，全面地揭示了IDH1R132H對(duì)良性前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1的生物學(xué)功能產(chǎn)生的顯著影響，有力地證明了IDH1R132H能夠促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞增殖能力方面，MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IDH1R132H組細(xì)胞的增殖速度明顯快于IDH1WT組和VECTOR組。這表明IDH1R132H突變賦予了細(xì)胞更強(qiáng)的增殖能力，使其能夠在相同的培養(yǎng)條件下更快地生長(zhǎng)和分裂。細(xì)胞的增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，IDH1R132H促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用可能與突變導(dǎo)致的細(xì)胞代謝改變有關(guān)。IDH1R132H突變使IDH1酶獲得了新的功能，能夠催化生成大量的2-HG，2-HG的積累可能干擾了細(xì)胞內(nèi)正常的代謝通路，為細(xì)胞的增殖提供了更多的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。2-HG還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如激活某些促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)分子，抑制細(xì)胞周期抑制因子的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)結(jié)果同樣顯示出IDH1R132H的顯著作用。Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)均表明，IDH1R132H組細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要步驟。IDH1R132H可能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞遷移。從細(xì)胞骨架重塑角度來(lái)看，2-HG的積累可能影響了細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)和修飾，改變了細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。2-HG還可能影響細(xì)胞間的黏附分子表達(dá)，降低細(xì)胞間的黏附力，使細(xì)胞更容易脫離原有的組織，發(fā)生遷移。IDH1R132H可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造有利的環(huán)境。在前列腺癌干細(xì)胞以及分化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化上，IDH1R132H也表現(xiàn)出了獨(dú)特的影響。IDH1R132H組細(xì)胞中前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、ALDH1的表達(dá)顯著升高，而分化相關(guān)指標(biāo)PSA、NKX3.1的表達(dá)顯著降低。這說(shuō)明IDH1R132H能夠促使RWPE-1細(xì)胞向前列腺癌干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞的分化。前列腺癌干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。IDH1R132H促進(jìn)細(xì)胞向干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，可能是其促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。這種轉(zhuǎn)化可能與IDH1R132H導(dǎo)致的表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，2-HG作為一種異常代謝產(chǎn)物，能夠抑制依賴α-酮戊二酸的雙加氧酶家族，包括參與DNA和組蛋白去甲基化的酶，從而導(dǎo)致DNA和組蛋白的甲基化修飾模式發(fā)生改變，影響與干細(xì)胞特性和分化相關(guān)基因的表達(dá)。五、IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制探究5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路基于前期研究結(jié)果，我們推測(cè)IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化可能通過(guò)miRNA-IGF1R-AKT/STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：miRNA層面：利用MicroRNA芯片對(duì)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，初步篩選出IDH1R132H所調(diào)控的miRNA。隨后，采用RT-qPCR對(duì)芯片篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，確保結(jié)果的可靠性。運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在這些miRNA啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3和H3K27me3的富集情況，以明確IDH1R132H是否通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控miRNA的表達(dá)。IGF1R層面：使用Targetscan軟件預(yù)測(cè)篩選出的miRNA的共同靶基因，重點(diǎn)關(guān)注胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（IGF1R）。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）及免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及VECTOR后，IGF1R的蛋白表達(dá)水平變化。在穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞中加入篩選出的miRNA的mimic和陰性對(duì)照，利用Westernblot檢測(cè)其靶基因IGF1R的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)IGF1R的調(diào)控作用。構(gòu)建IGF1R-3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，將miRNA的mimic以及報(bào)告基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性，從分子水平驗(yàn)證miRNA與IGF1R的靶向關(guān)系。利用mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)IDH1R132H及VECTOR的差異性基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析IGF1R相關(guān)基因的變化，全面了解IDH1R132H對(duì)IGF1R相關(guān)基因表達(dá)的影響。信號(hào)通路層面：運(yùn)用Westernblot檢測(cè)IGF1R下游信號(hào)通路AKT、STAT3及磷酸化活性形式的變化，明確IDH1R132H是否通過(guò)激活I(lǐng)GF1R進(jìn)而激活A(yù)KT/STAT3信號(hào)通路。采用siRNA干擾IGF1R的表達(dá)，然后檢測(cè)AKT、STAT3以及其磷酸化活性形式的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證IGF1R在該信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。在干擾IGF1R表達(dá)后，通過(guò)MTS及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖遷移能力的變化，從細(xì)胞功能層面驗(yàn)證IGF1R及AKT/STAT3信號(hào)通路在IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。5.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程與方法5.2.1miRNA芯片篩選收集穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株，每株細(xì)胞收集量不少于1×107個(gè)。使用TRIzol試劑按照說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞總RNA，提取過(guò)程中注意避免RNA酶的污染，確保RNA的完整性和純度。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和完整性，以判斷RNA的質(zhì)量。使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。將提取的總RNA送至專(zhuān)業(yè)的生物芯片公司進(jìn)行MicroRNA芯片檢測(cè)。芯片采用AgilentmiRNA微陣列芯片（AgilentTechnologies公司），該芯片能夠同時(shí)檢測(cè)人類(lèi)基因組中已知的多種miRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用Cy3-CTP對(duì)RNA進(jìn)行標(biāo)記，使miRNA帶上熒光信號(hào)。標(biāo)記后的RNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交，在42℃恒溫條件下雜交17h，使miRNA與互補(bǔ)的探針充分結(jié)合。雜交結(jié)束后，用洗滌緩沖液對(duì)芯片進(jìn)行嚴(yán)格洗滌，去除未結(jié)合的RNA和雜質(zhì)。最后，使用AgilentScannerG2505C芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。利用AgilentFeatureExtraction軟件對(duì)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)比較IDH1R132H組與IDH1WT組、VECTOR組之間miRNA表達(dá)的差異倍數(shù)，篩選出差異表達(dá)的miRNA。設(shè)定差異倍數(shù)≥2.0且P<0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)，初步確定IDH1R132H所調(diào)控的miRNA。5.2.2miRNA驗(yàn)證（RT-qPCR）從MicroRNA芯片篩選出的差異表達(dá)miRNA中，選取部分具有代表性的miRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。使用TaKaRa公司的miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。該試劑盒采用獨(dú)特的加A尾和反轉(zhuǎn)錄一步法，能夠高效地將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體步驟如下：在0.2mlPCR管中加入5μl總RNA、1μlmiRNA特異性莖環(huán)引物、1μl10mMdNTPMix、4μl5×PrimeScriptBuffer、0.5μlPrimeScriptRTEnzymeMixI和4.5μlRNase-FreedH2O，輕柔混勻。將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照37℃60min，85℃5s的程序進(jìn)行反應(yīng)，完成反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TaKaRa公司的miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBRGreen）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括10μl2×miRcutePlusmiRNAPremix、0.4μl上下游引物（10μM）、2μlcDNA模板和7.6μlRNase-FreedH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)與芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證芯片篩選出的差異表達(dá)miRNA的真實(shí)性。5.2.3染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)使用SimpleChIP?PlusEnzymaticChromatinIPKit（CellSignalingTechnology公司）進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)在篩選出的miRNA啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3和H3K27me3的富集情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下：收集穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株，每株細(xì)胞收集量約為1×107個(gè)。用1%甲醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)，使蛋白質(zhì)與DNA之間形成共價(jià)鍵，固定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行10min，然后加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)。將交聯(lián)后的細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，釋放細(xì)胞核。使用微球菌核酸酶對(duì)細(xì)胞核中的染色質(zhì)進(jìn)行酶切，將染色質(zhì)切割成合適長(zhǎng)度的片段。將酶切后的染色質(zhì)超聲處理，進(jìn)一步打斷染色質(zhì)，使其成為平均長(zhǎng)度約為200-500bp的片段。取適量的染色質(zhì)片段作為Input對(duì)照，其余染色質(zhì)片段分別與抗H3K4me3抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：9751S）和抗H3K27me3抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：9733S）在4℃下孵育過(guò)夜，進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置IgG抗體作為陰性對(duì)照。孵育結(jié)束后，加入ProteinA/GMagneticBeads，在4℃下繼續(xù)孵育1h，使抗體-染色質(zhì)復(fù)合物與磁珠結(jié)合。將磁珠-抗體-染色質(zhì)復(fù)合物用洗滌緩沖液洗滌多次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。使用洗脫緩沖液洗脫免疫沉淀的染色質(zhì)片段，然后進(jìn)行交聯(lián)逆轉(zhuǎn)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)與DNA分離。最后，使用酚-氯仿法提取DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物根據(jù)miRNA啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶亮度，分析H3K4me3和H3K27me3在miRNA啟動(dòng)子區(qū)的富集情況。5.2.4共同靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證使用Targetscan軟件（/vert_72/）預(yù)測(cè)篩選出的miRNA的共同靶基因。該軟件基于miRNA與靶基因3'UTR的互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)對(duì)大量生物信息數(shù)據(jù)的分析，預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因。在預(yù)測(cè)過(guò)程中，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如最小自由能、種子配對(duì)等，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。從預(yù)測(cè)結(jié)果中篩選出與細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)的靶基因，重點(diǎn)關(guān)注胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（IGF1R）。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）及免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及VECTOR后，IGF1R的蛋白表達(dá)水平變化。Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟如下：收集細(xì)胞，用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使各組蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。加入兔抗人IGF1R多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：3027S），4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：7074S），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。使用化學(xué)發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司）進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）上觀察并拍照，分析IGF1R蛋白的表達(dá)水平。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟如下：將細(xì)胞接種于玻片上，培養(yǎng)至合適密度。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，然后用0.1%TritonX-100透化細(xì)胞10min。用5%BSA封閉細(xì)胞1h。加入兔抗人IGF1R多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用DAPI染細(xì)胞核5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析IGF1R蛋白的表達(dá)和定位情況。在穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞中加入篩選出的miRNA的mimic和陰性對(duì)照。miRNAmimic是一種人工合成的雙鏈RNA，其序列與成熟miRNA相同，能夠模擬內(nèi)源性miRNA的功能。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將miRNAmimic和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，使用Westernblot檢測(cè)其靶基因IGF1R的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)IGF1R的調(diào)控作用。5.2.5熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)構(gòu)建IGF1R-3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增IGF1R基因的3'UTR序列，引物設(shè)計(jì)時(shí)在兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。將酶切后的IGF1R-3'UTR片段與同樣經(jīng)過(guò)酶切的pGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因載體（Promega公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，使用T4DNA連接酶在16℃下孵育過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保插入的IGF1R-3'UTR序列正確無(wú)誤。將miRNA的mimic以及報(bào)告基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中。HEK293T細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞系，具有易于轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)的特點(diǎn)。轉(zhuǎn)染前1天，將HEK293T細(xì)胞接種于24孔板中，使細(xì)胞密度達(dá)到50%-60%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將miRNAmimic、報(bào)告基因表達(dá)載體和內(nèi)參載體pRL-TK（Promega公司，用于校正轉(zhuǎn)染效率）混合，加入適量的Lipofectamine3000試劑，輕柔混勻，室溫孵育15-20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布。將細(xì)胞放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，使用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（Promega公司）檢測(cè)熒光素酶活性。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，首先吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入100μl1×PLB裂解緩沖液，室溫振蕩裂解細(xì)胞15min。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5min，取上清液。分別加入熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ和海腎熒光素酶檢測(cè)試劑，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光素酶活性，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以反映miRNA與IGF1R的靶向關(guān)系。如果miRNA與IGF1R存在靶向結(jié)合，那么miRNAmimic轉(zhuǎn)染后會(huì)導(dǎo)致熒光素酶活性降低，反之則熒光素酶活性無(wú)明顯變化。5.2.6mRNA表達(dá)譜芯片及生物信息學(xué)分析使用AffymetrixGeneChipHumanGene2.0STArray芯片（ThermoFisherScientific公司）對(duì)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株進(jìn)行mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。收集細(xì)胞，提取總RNA，方法同miRNA芯片篩選中的RNA提取步驟。提取的RNA經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行cRNA擴(kuò)增和生物素標(biāo)記。標(biāo)記后的cRNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交，在45℃、60rpm條件下雜交16h。雜交結(jié)束后，用洗滌緩沖液對(duì)芯片進(jìn)行嚴(yán)格洗滌，去除未結(jié)合的cRNA和雜質(zhì)。使用GeneChipScanner30007G芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。利用AffymetrixExpressionConsole軟件對(duì)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)比較IDH1R132H組與VECTOR組之間mRNA表達(dá)的差異倍數(shù)，篩選出差異表達(dá)的基因。設(shè)定差異倍數(shù)≥2.0且P<0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)，得到IDH1R132H及VECTOR的差異性基因。利用生物信息學(xué)方法對(duì)篩選出的差異性基因進(jìn)行分析，重點(diǎn)關(guān)注IGF1R相關(guān)基因的變化。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)（/）進(jìn)行基因功能富集分析（GOanalysis）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析。在GO分析中，從生物學(xué)過(guò)程（BiologicalProcess）、細(xì)胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個(gè)方面對(duì)差異基因進(jìn)行注釋和富集分析，了解這些基因參與的主要生物學(xué)過(guò)程和分子功能。在KEGG分析中，確定差異基因顯著富集的信號(hào)通路，分析IDH1R132H對(duì)IGF1R相關(guān)信號(hào)通路的影響。通過(guò)生物信息學(xué)分析，全面了解IDH1R132H對(duì)IGF1R相關(guān)基因表達(dá)的影響，為深入探究其作用機(jī)制提供線索。5.2.7信號(hào)通路檢測(cè)（Westernblot）運(yùn)用Westernblot檢測(cè)IGF1R下游信號(hào)通路AKT、STAT3及磷酸化活性形式的變化。收集穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株，用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使各組蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。分別加入兔抗人AKT多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：4691S）、兔抗人p-AKT（Ser473）多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：4060S）、兔抗人STAT3多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：12640S）和兔抗人p-STAT3（Tyr705）多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)：9145S），4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，分析AKT、STAT3及磷酸化活性形式的表達(dá)水平，明確IDH1R132H是否通過(guò)激活I(lǐng)GF1R進(jìn)而激活A(yù)KT/STAT3信號(hào)通路。如果IDH1R132H能夠激活I(lǐng)GF1R，那么IGF1R下游的AKT和STAT3的磷酸化水平會(huì)升高，表現(xiàn)為p-AKT和p-STAT3的蛋白條帶亮度增強(qiáng)。5.2.8siRNA干擾實(shí)驗(yàn)采用siRNA干擾IGF1R的表達(dá)，以進(jìn)一步驗(yàn)證IGF1R在IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。設(shè)計(jì)針對(duì)IGF1R的siRNA序列（si-IGF1R），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA（si-NC），其序列與任何已知基因均無(wú)同源性。將穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50%-60%。按照LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將si-IGF1R和si-NC分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，使用Westernblot檢測(cè)IGF1R的表達(dá)水平，驗(yàn)證干擾效果。如果si-IGF1R轉(zhuǎn)染成功，那么IGF1R的蛋白表達(dá)水平會(huì)明顯降低。在干擾IGF1R表達(dá)后，再次使用Westernblot檢測(cè)AKT、STAT3以及其磷酸化活性形式的變化。如果IGF1R在IDH1R132H激活A(yù)KT/STAT3信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，那么干擾IGF1R表達(dá)后，AKT和STAT3的磷酸化水平會(huì)降低，表現(xiàn)為p-AKT和p-STAT3的蛋白條帶亮度減弱。同時(shí)，通過(guò)MTS及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖遷移能力的變化。MTS實(shí)驗(yàn)步驟同4.2.4節(jié)中的細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)步驟同4.2.4節(jié)中的細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。如果IGF1R及AKT/STAT3信號(hào)通路在IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，那么干擾IGF1R表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和遷移能力會(huì)受到抑制，表現(xiàn)為MTS實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的OD值降低，Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量減少。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞功能層面驗(yàn)證IGF1R及AKT/STAT5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在miRNA芯片篩選中，通過(guò)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H、IDH1WT及空載對(duì)照（VECTOR）的RWPE-1細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，共篩選出[X]個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中[X1]個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，[X2]個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p等在IDH1R132H組中的表達(dá)顯著低于IDH1WT組和VECTOR組（P<0.05），與芯片篩選結(jié)果一致。染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的啟動(dòng)子區(qū)，IDH1R132H組中H3K27me3的富集程度顯著高于IDH1WT組和VECTOR組，而H3K4me3的富集程度顯著低于IDH1WT組和VECTOR組（P<0.05）。這表明IDH1R132H可能通過(guò)改變miRNA啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)修飾，抑制miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的表達(dá)。在共同靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證方面，使用Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的共同靶基因，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（IGF1R）為潛在的共同靶基因。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）及免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IDH1R132H組中IGF1R的蛋白表達(dá)水平顯著高于IDH1WT組和VECTOR組（P<0.05）。在穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞中加入miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的mimic后，IGF1R的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p的mimic與IGF1R-3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），證實(shí)了miR-141-3p、miR-7-5p、miR-223-3p與IGF1R之間的靶向關(guān)系。mRNA表達(dá)譜芯片及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，IDH1R132H組與VECTOR組相比，篩選出[X3]個(gè)差異表達(dá)的基因，其中與IGF1R相關(guān)的基因有[X4]個(gè)。GO分析表明這些基因主要參與細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)過(guò)程，KEGG分析顯示它們主要富集在PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路，進(jìn)一步表明IDH1R132H對(duì)IGF1R相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。在信號(hào)通路檢測(cè)中，Westernblot結(jié)果顯示，IDH1R132H組中p-AKT（Ser473）和p-STAT3（Tyr705）的蛋白表達(dá)水平顯著高于IDH1WT組和VECTOR組（P<0.05），表明IDH1R132H能夠激活I(lǐng)GF1R下游的AKT/STAT3信號(hào)通路。siRNA