LncRNARNU12負(fù)向調(diào)控重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年肝癌的新增病例數(shù)量龐大，而患者的5年生存率卻相對(duì)較低。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者往往面臨著腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高以及對(duì)傳統(tǒng)治療方法耐藥等諸多難題，這使得肝癌的治療成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。目前，肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、化療、放療、介入治療以及靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性。手術(shù)切除對(duì)于早期肝癌患者效果較好，但對(duì)于中晚期患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往無(wú)法徹底清除腫瘤細(xì)胞，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。肝移植雖然是一種有效的治療方法，但由于供體短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。化療和放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，降低了患者的生活質(zhì)量。介入治療雖然可以在一定程度上控制腫瘤的生長(zhǎng)，但也存在治療不徹底和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。靶向治療和免疫治療雖然為肝癌的治療帶來(lái)了新的希望，但部分患者對(duì)這些治療方法并不敏感，且治療費(fèi)用高昂，給患者和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。重組人TRAIL蛋白作為一種具有潛力的腫瘤治療藥物，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。TRAIL即腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，屬于腫瘤壞死因子超家族。它能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化影響較小。這一特性使得TRAIL在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有望成為一種高效、低毒的新型抗癌藥物。研究表明，TRAIL可以通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在多種腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型中，TRAIL都表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。然而，在臨床應(yīng)用中，重組人TRAIL蛋白的療效卻不盡如人意，部分肝癌細(xì)胞對(duì)其誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生了抵抗，導(dǎo)致治療效果不佳。LncRNARNU12作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，近年來(lái)在腫瘤研究領(lǐng)域逐漸嶄露頭角。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，它們不編碼蛋白質(zhì)，但在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNARNU12在肝癌組織中存在異常表達(dá)，并且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。然而，其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。在重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，LncRNARNU12是否參與其中，以及它是如何發(fā)揮作用的，目前還鮮有報(bào)道。本研究旨在深入探討LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過(guò)揭示這一過(guò)程中的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體而言，本研究將有助于進(jìn)一步明確LncRNARNU12在肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用，為開(kāi)發(fā)針對(duì)LncRNARNU12的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。此外，本研究的結(jié)果還可能為優(yōu)化重組人TRAIL蛋白的臨床應(yīng)用提供參考，通過(guò)聯(lián)合靶向LncRNARNU12的治療策略，提高重組人TRAIL蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，從而改善肝癌患者的治療效果和預(yù)后。這對(duì)于提高肝癌的治療水平，降低肝癌的死亡率，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制，為肝癌的治療提供全新的理論依據(jù)與潛在的治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：構(gòu)建肝癌細(xì)胞模型：選擇合適的肝癌細(xì)胞系，如HepG2、MHCC97-H等，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)手段，建立穩(wěn)定的肝癌細(xì)胞模型，用于后續(xù)的研究。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代和凍存等常規(guī)操作，確保細(xì)胞的活性和狀態(tài)良好。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和顯微鏡等設(shè)備，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供保障。檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：采用Annexin-V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測(cè)重組人TRAIL蛋白在不同條件下誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的比率。設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組，包括對(duì)照組、單獨(dú)使用重組人TRAIL蛋白組、同時(shí)處理LncRNARNU12和重組人TRAIL蛋白組等。在不同的時(shí)間點(diǎn)和濃度梯度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞凋亡率的變化，分析LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異，為后續(xù)的機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持。檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)：運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)LncRNARNU12、凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2、Caspase家族等）以及與TRAIL信號(hào)通路相關(guān)分子（如TRAIL受體、FADD、c-FLIP等）的表達(dá)情況。通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組之間這些分子的表達(dá)差異，初步探討LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的記錄和分析，為深入研究機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。分析信號(hào)通路：通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)方法，如使用特異性抑制劑、基因沉默或過(guò)表達(dá)技術(shù)等，進(jìn)一步深入研究LncRNARNU12影響重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)通路。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定LncRNARNU12在信號(hào)通路中的作用位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，揭示其抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，充分考慮各種因素的影響，設(shè)置合理的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和說(shuō)服力。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深入的分析和討論，為肝癌的治療提供理論依據(jù)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞水平研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型等。將體外實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果在動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，觀察LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白治療肝癌效果的影響，進(jìn)一步明確其在體內(nèi)的作用機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，確保動(dòng)物的福利和實(shí)驗(yàn)的合法性。對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的記錄和分析，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和驗(yàn)證，為肝癌的臨床治療提供更有力的支持。1.3研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞培養(yǎng)：選擇HepG2、MHCC97-H等肝癌細(xì)胞系，從細(xì)胞庫(kù)中獲取后，將其置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按1:3或1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于細(xì)胞的凍存，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，加入含有10%二甲基亞砜（DMSO）和90%胎牛血清的凍存液，將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，按照-20℃1小時(shí)、-80℃過(guò)夜的程序進(jìn)行凍存，最后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。構(gòu)建載體：根據(jù)LncRNARNU12的基因序列，設(shè)計(jì)特異性的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，然后將其克隆到慢病毒載體中。通過(guò)基因合成技術(shù)合成shRNA序列，將其與經(jīng)過(guò)酶切處理的慢病毒載體進(jìn)行連接反應(yīng)，使用T4DNA連接酶在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保shRNA序列正確插入到載體中。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集含有慢病毒的上清液，通過(guò)超速離心或超濾等方法進(jìn)行濃縮和純化，測(cè)定病毒滴度后，保存于-80℃冰箱備用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞接種到6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine3000試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將適量的慢病毒干擾載體或?qū)φ蛰d體與Lipofectamine3000試劑分別稀釋在Opti-MEM培養(yǎng)基中，然后將兩者混合，室溫孵育15分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的48-72小時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，收集細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Annexin-V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使其密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，加入5μLAnnexin-V-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。然后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)設(shè)置合適的參數(shù)，區(qū)分正常細(xì)胞（Annexin-V?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin-V?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（Annexin-V?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。RNA提取與qRT-PCR：使用TRIzol試劑提取肝癌細(xì)胞中的總RNA。收集細(xì)胞，加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，然后按照試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。加入氯仿進(jìn)行分層，離心后取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用DEPC處理水溶解RNA。使用Nanodrop2000測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因（LncRNARNU12、凋亡相關(guān)蛋白基因、TRAIL信號(hào)通路相關(guān)分子基因等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。利用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。通過(guò)比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。蛋白質(zhì)提取與Westernblot：使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取肝癌細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。然后在4℃下，12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白質(zhì)提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入一抗（針對(duì)LncRNARNU12、凋亡相關(guān)蛋白、TRAIL信號(hào)通路相關(guān)分子等的特異性抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。信號(hào)通路研究：使用特異性抑制劑研究LncRNARNU12影響重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。例如，如果研究PI3K/AKT信號(hào)通路，可在細(xì)胞處理前1小時(shí)加入PI3K抑制劑LY294002，使其終濃度為10μM。然后再加入重組人TRAIL蛋白和進(jìn)行其他處理。通過(guò)Westernblot檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（如p-AKT、AKT等）的磷酸化水平和表達(dá)量變化，分析信號(hào)通路的激活或抑制情況。同時(shí)，利用基因沉默或過(guò)表達(dá)技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的作用。通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，或者通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒使關(guān)鍵基因過(guò)表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡率和相關(guān)分子表達(dá)的變化，確定LncRNARNU12在信號(hào)通路中的作用位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型驗(yàn)證LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白治療肝癌效果的影響。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無(wú)菌條件下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞（1×10?個(gè)/mL）懸液0.1mL注射到裸鼠的右側(cè)腋窩皮下。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、重組人TRAIL蛋白組、LncRNARNU12干擾組和LncRNARNU12干擾+重組人TRAIL蛋白組，每組5只。對(duì)照組給予生理鹽水，重組人TRAIL蛋白組給予重組人TRAIL蛋白（5mg/kg）腹腔注射，每周3次；LncRNARNU12干擾組通過(guò)瘤內(nèi)注射慢病毒干擾載體（1×10?TU/mL），每周2次；LncRNARNU12干擾+重組人TRAIL蛋白組同時(shí)給予上述兩種處理。定期測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱重、拍照，并進(jìn)行免疫組化、TUNEL染色等檢測(cè)，分析腫瘤細(xì)胞的凋亡情況和相關(guān)分子的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，給予裸鼠良好的飼養(yǎng)條件和護(hù)理。本研究的技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和特性。然后構(gòu)建LncRNARNU12的慢病毒干擾載體，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。接著，用重組人TRAIL蛋白處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，通過(guò)Annexin-V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，利用qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)。在信號(hào)通路研究中，使用特異性抑制劑、基因沉默或過(guò)表達(dá)技術(shù)，深入分析LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。最后，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，在體內(nèi)驗(yàn)證LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白治療肝癌效果的影響，通過(guò)測(cè)量腫瘤體積、稱重、免疫組化和TUNEL染色等方法進(jìn)行檢測(cè)和分析。整個(gè)技術(shù)路線從細(xì)胞水平到動(dòng)物水平，逐步深入研究LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為肝癌的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌在所有癌癥中的發(fā)病率位居前列，每年新增病例數(shù)量眾多。在我國(guó)，肝癌同樣是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居高不下，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和壽命。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度極大。中晚期肝癌患者的5年生存率較低，給患者和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。肝癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素。目前研究表明，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染是導(dǎo)致肝癌的主要原因之一。長(zhǎng)期的病毒感染會(huì)引起肝臟慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死和纖維化，最終發(fā)展為肝癌。黃曲霉毒素、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝硬化等因素也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。遺傳因素在肝癌的發(fā)病中也起到一定的作用，某些基因突變或多態(tài)性可能增加個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。手術(shù)切除是肝癌治療的首選方法，對(duì)于早期肝癌患者，手術(shù)切除能夠有效去除腫瘤組織，提高患者的生存率。然而，手術(shù)切除存在一定的局限性，對(duì)于腫瘤較大、位置特殊或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)切除的難度較大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熓峭ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等不良反應(yīng)。此外，肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性也是影響化療效果的重要因素。射頻消融是一種局部治療方法，通過(guò)高溫使腫瘤組織凝固壞死，達(dá)到治療目的。該方法適用于一些小肝癌患者，但對(duì)于較大的腫瘤或靠近重要器官的腫瘤，射頻消融的效果可能不理想，且存在腫瘤殘留和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。2.2重組人TRAIL蛋白重組人TRAIL蛋白是一種通過(guò)基因工程技術(shù)制備的蛋白質(zhì)，其核心成分TRAIL是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，屬于腫瘤壞死因子超家族成員。TRAIL蛋白由281個(gè)氨基酸組成，以同源三聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)活性。其結(jié)構(gòu)包含胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)，其中胞外區(qū)是與受體結(jié)合并發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡功能的關(guān)鍵區(qū)域。在空間結(jié)構(gòu)上，TRAIL單體含有由兩個(gè)反平行片層形成的三明治核心骨架結(jié)構(gòu)，三聚體呈“鈴”型，一端寬廣為“底部”，另一端狹長(zhǎng)為“頂部”，8個(gè)芳香族氨基酸在蛋白表面形成疏水凹槽，用于與相應(yīng)受體發(fā)生特異性結(jié)合。TRAIL蛋白能夠特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這一功能使其在腫瘤治療領(lǐng)域備受關(guān)注。其作用機(jī)制主要是通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前已鑒定出的TRAIL受體有5種，可分為三類：死亡受體（DR），如DR4（TRAILR1）和DR5（TRAILR2），它們含有胞質(zhì)死亡區(qū)域，能將凋亡信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡；誘騙受體（DcR），包括DcR1（TRAILR3）和DcR2（TRAILR4），它們的胞外區(qū)與DR4、DR5高度同源，但缺失或部分缺失死亡結(jié)構(gòu)域，雖能與TRAIL結(jié)合卻無(wú)法傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制DR4和DR5的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡；OPG（骨保護(hù)素），是一種分泌性蛋白質(zhì)，對(duì)TRAIL親和力較弱。當(dāng)TRAIL與死亡受體DR4或DR5結(jié)合后，會(huì)招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC的形成促使半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和caspase10酶原激活，激活后的caspase8可以直接激活下游的caspase3、6、7等效應(yīng)caspase，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase8還能切割Bid蛋白，使其活化后轉(zhuǎn)移到線粒體，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c，進(jìn)而激活caspase9，通過(guò)線粒體凋亡途徑進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡方面，TRAIL蛋白具有重要的作用。肝癌細(xì)胞表面通常表達(dá)DR4和DR5等死亡受體，TRAIL蛋白能夠與之特異性結(jié)合，激活上述凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，將重組人TRAIL蛋白作用于肝癌細(xì)胞系，如HepG2、MHCC97-H等，可顯著觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)改變、DNA斷裂等凋亡特征。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予攜帶肝癌移植瘤的小鼠重組人TRAIL蛋白，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡增加。然而，肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL蛋白誘導(dǎo)的凋亡存在異質(zhì)性，部分肝癌細(xì)胞對(duì)其具有抵抗性，這限制了TRAIL蛋白在肝癌治療中的臨床應(yīng)用效果。其抵抗機(jī)制較為復(fù)雜，可能與誘騙受體的高表達(dá)有關(guān)，DcR1和DcR2在部分肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，它們與TRAIL結(jié)合后，阻斷了TRAIL與死亡受體的結(jié)合，從而使肝癌細(xì)胞逃避凋亡。一些抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)，也可以抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，阻礙TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。從臨床應(yīng)用潛力來(lái)看，重組人TRAIL蛋白具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，這使得其在腫瘤治療中有望減少對(duì)機(jī)體正常組織和器官的損傷，降低治療過(guò)程中的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。如果能夠有效克服肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL蛋白的抵抗性，將為肝癌的治療提供一種全新的、高效低毒的治療手段，為肝癌患者帶來(lái)新的希望。目前，基于TRAIL蛋白的抗腫瘤治療策略正在不斷研究和開(kāi)發(fā)中，如通過(guò)基因工程手段構(gòu)建TRAIL融合蛋白，將TRAIL與特異性的靶向分子融合，提高其對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性和殺傷活性；利用抗體偶聯(lián)技術(shù)，將TRAIL與抗體結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗腫瘤效果；或者采用病毒載體、納米顆粒等技術(shù)將TRAIL基因?qū)肽[瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)局部高表達(dá)，以增強(qiáng)其誘導(dǎo)凋亡的作用。然而，在臨床應(yīng)用過(guò)程中，重組人TRAIL蛋白面臨著諸多挑戰(zhàn)。除了肝癌細(xì)胞的耐藥性問(wèn)題外，TRAIL蛋白的穩(wěn)定性、半衰期以及在體內(nèi)的有效遞送也是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。TRAIL蛋白在體內(nèi)容易被降解，導(dǎo)致其半衰期較短，難以維持有效的治療濃度。如何優(yōu)化TRAIL蛋白的結(jié)構(gòu)，提高其穩(wěn)定性和半衰期，以及開(kāi)發(fā)高效的遞送系統(tǒng)，確保TRAIL蛋白能夠準(zhǔn)確、有效地到達(dá)腫瘤部位，是目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。2.3LncRNARNU12長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Longnon-codingRNA，LncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，它們不編碼蛋白質(zhì)，但在生命活動(dòng)中發(fā)揮著廣泛而重要的調(diào)控作用。根據(jù)其在基因組上相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，LncRNA可分為以下幾類：基因間LncRNA（lincRNA），位于兩個(gè)蛋白編碼基因之間；內(nèi)含子LncRNA，來(lái)源于基因的內(nèi)含子區(qū)域；反義LncRNA，與蛋白編碼基因的正義鏈反向互補(bǔ)；增強(qiáng)子LncRNA，與增強(qiáng)子區(qū)域相關(guān)。在功能方面，LncRNA參與了多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。在基因表達(dá)調(diào)控層面，一些LncRNA可以通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止。例如，某些LncRNA能夠招募轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)修飾復(fù)合物到特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在表觀遺傳調(diào)控中，LncRNA可以介導(dǎo)DNA甲基化、組蛋白修飾等過(guò)程，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響基因的表達(dá)狀態(tài)。在細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中，LncRNA也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。比如在胚胎發(fā)育過(guò)程中，特定的LncRNA表達(dá)模式對(duì)于細(xì)胞的分化方向和組織器官的形成具有重要的調(diào)控作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，LncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥等密切相關(guān)。一些LncRNA可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而另一些則可以作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)展。LncRNARNU12屬于LncRNA家族中的一員，其全稱為RNA,U12smallnuclear12。它具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，通常由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成，形成特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)對(duì)于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要。在表達(dá)特征上，LncRNARNU12在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)具有特異性。在正常組織中，它的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，且維持在一定的基礎(chǔ)水平。然而，在多種疾病狀態(tài)下，尤其是腫瘤疾病中，LncRNARNU12的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，在某些癌癥中，如胃癌、肺癌等，LncRNARNU12呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并且這種高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、預(yù)后不良等密切相關(guān)。在與肝癌的相關(guān)性方面，已有研究發(fā)現(xiàn)LncRNARNU12在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織。通過(guò)對(duì)大量肝癌患者樣本的分析，發(fā)現(xiàn)LncRNARNU12的高表達(dá)與肝癌的分期、轉(zhuǎn)移以及患者的生存率密切相關(guān)。高表達(dá)LncRNARNU12的肝癌患者往往具有更高的腫瘤分期，更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，且總體生存率較低。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，沉默LncRNARNU12可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，并且在肝癌動(dòng)物模型中，沉默LncRNARNU12能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這些研究結(jié)果表明，LncRNARNU12在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用，可能成為肝癌診斷、預(yù)后評(píng)估以及治療的潛在靶點(diǎn)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料肝癌細(xì)胞系：選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和MHCC97-H，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HepG2細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在肝癌研究中常用于探討腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及藥物敏感性等方面。MHCC97-H細(xì)胞是具有高轉(zhuǎn)移特性的肝癌細(xì)胞系，能夠在裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移瘤，對(duì)于研究肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及抗轉(zhuǎn)移治療具有重要意義。試劑：重組人TRAIL蛋白購(gòu)自PeproTech公司，其純度經(jīng)SDS檢測(cè)大于95%，內(nèi)毒素含量低于0.1EU/μg，在溶液中以三聚體形式存在，具有良好的生物學(xué)活性，能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，含有豐富的氨基酸、維生素、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分，適合多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。胎牛血清（FBS）購(gòu)自Sigma公司，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌等污染，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持。胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，胰蛋白酶活力為2500U/mg，能夠高效消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離；青霉素-鏈霉素雙抗的工作濃度分別為100U/mL和100μg/mL，可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞毒性小，能夠?qū)⑼庠春怂岣咝?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，該試劑盒利用Annexin-V與凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，以及PI對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染色特性，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，能夠快速、有效地提取細(xì)胞中的總RNA，所提取的RNA純度高，可用于后續(xù)的qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)效率高，產(chǎn)物穩(wěn)定性好；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒基于SYBRGreen染料與雙鏈DNA特異性結(jié)合的原理，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，從而準(zhǔn)確測(cè)定基因的表達(dá)水平。蛋白裂解液（RIPA）、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒采用BCA法，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，可用于測(cè)定蛋白樣品的濃度；SDS凝膠制備試劑盒能夠快速制備高質(zhì)量的SDS凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)。一抗包括抗LncRNARNU12抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-8抗體、抗FADD抗體、抗c-FLIP抗體等，均購(gòu)自Abcam公司，這些抗體特異性強(qiáng)，能夠與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的信號(hào)。儀器設(shè)備：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，型號(hào)為HERAcell150i，能夠精確控制培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、CO?濃度和濕度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。超凈工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為SW-CJ-2FD，通過(guò)高效空氣過(guò)濾器（HEPA）過(guò)濾空氣，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染。倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，型號(hào)為IX73，配備高分辨率的物鏡和目鏡，能夠清晰觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。流式細(xì)胞儀購(gòu)自BDBiosciences公司，型號(hào)為FACSCalibur，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠快速檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志物，用于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等分析。PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司，型號(hào)為CFX96Touch，能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的基因擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司，型號(hào)為L(zhǎng)ightCycler480，具有高靈敏度和特異性，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)，進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自Bio-Rad公司，電泳儀型號(hào)為PowerPacBasic，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離；轉(zhuǎn)膜儀型號(hào)為T(mén)rans-BlotSDSemi-DryTransferCell，能夠?qū)⒛z中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，用于Westernblot實(shí)驗(yàn)。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，型號(hào)為ChemiDocMP，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和核酸凝膠進(jìn)行成像和分析，檢測(cè)目的條帶的信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4-6周齡的BALB/c裸鼠，雌性，體重18-22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。裸鼠無(wú)胸腺，免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，適合用于構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代及凍存：從液氮罐中取出凍存的HepG2和MHCC97-H細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速搖晃，使其在1分鐘內(nèi)完全融化，以避免冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有9mL預(yù)冷完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%雙抗）的15mL離心管中，1000rpm室溫離心5分鐘，棄去上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，以去除殘留的血清，因?yàn)檠逯泻械囊让敢种埔蜃訒?huì)影響胰酶的消化效果。加入1-2mL0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓且不貼壁，輕輕晃動(dòng)和敲擊培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大量細(xì)胞脫離時(shí)，立即加入2倍胰酶體積的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm室溫離心5分鐘，棄去上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于需要凍存的細(xì)胞，先按照傳代方法收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于凍存液（90%FBS+10%DMSO）中，使細(xì)胞密度為5×10?-1×10?個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每管1mL。將凍存管先放入4℃冰箱中30分鐘，使凍存液充分滲透到細(xì)胞內(nèi)，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中1小時(shí)，最后放入-80℃冰箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。慢病毒載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定：根據(jù)LncRNARNU12的基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)其的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照shRNA序列。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列交由生物公司合成，并克隆到慢病毒載體（如pLVX-shRNA2）中。將構(gòu)建好的重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1天，將293T細(xì)胞接種到6孔板中，每孔細(xì)胞密度為2×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將適量的重組慢病毒載體、包裝質(zhì)粒和Lipofectamine3000試劑分別稀釋在Opti-MEM培養(yǎng)基中，然后將兩者混合，室溫孵育15分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有293T細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集含有慢病毒的上清液，通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，去除細(xì)胞碎片。采用超速離心法對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮，將過(guò)濾后的上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、25000rpm條件下離心2小時(shí)，棄去上清，用適量的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸病毒沉淀，測(cè)定病毒滴度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和MHCC97-H細(xì)胞接種到6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照測(cè)定的病毒滴度，加入適量的慢病毒懸液進(jìn)行感染，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的Polybrene以提高感染效率。感染4-6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后48-72小時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，評(píng)估感染效率。同時(shí)，收集細(xì)胞，提取RNA，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)LncRNARNU12的表達(dá)水平，驗(yàn)證干擾效果。凋亡率檢測(cè)：采用Annexin-V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集轉(zhuǎn)染或處理后的肝癌細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使其密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，加入5μLAnnexin-V-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。然后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)設(shè)置合適的參數(shù)，區(qū)分正常細(xì)胞（Annexin-V?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin-V?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（Annexin-V?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次?；蚝偷鞍妆磉_(dá)檢測(cè)：使用TRIzol試劑提取肝癌細(xì)胞中的總RNA，按照試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。加入氯仿進(jìn)行分層，離心后取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用DEPC處理水溶解RNA。使用Nanodrop2000測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因（LncRNARNU12、凋亡相關(guān)蛋白基因、TRAIL信號(hào)通路相關(guān)分子基因等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。利用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。通過(guò)比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取肝癌細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。然后在4℃下，12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白質(zhì)提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入一抗（針對(duì)LncRNARNU12、凋亡相關(guān)蛋白、TRAIL信號(hào)通路相關(guān)分子等的特異性抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。亞細(xì)胞定位檢測(cè)：采用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測(cè)LncRNARNU12的亞細(xì)胞定位。將肝癌細(xì)胞接種到預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行固定。用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.5%TritonX-100室溫通透細(xì)胞10分鐘，再用PBS洗滌3次，每次5分鐘。將細(xì)胞與預(yù)雜交液在37℃孵育30分鐘，然后加入用熒光素標(biāo)記的LncRNARNU12探針，在避光條件下37℃雜交過(guò)夜。次日，用2×SSC、0.1×SSC分別洗滌細(xì)胞3次，每次10分鐘。用DAPI染核5分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察LncRNARNU12的亞細(xì)胞定位情況。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1溫度對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響為探究不同溫度環(huán)境對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用效果，本實(shí)驗(yàn)將肝癌細(xì)胞分為多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別在37℃（對(duì)照組，模擬人體正常體溫環(huán)境，為實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)對(duì)照數(shù)據(jù)，以便清晰對(duì)比其他溫度條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）、43℃、46℃、48℃和50℃的環(huán)境中處理10分鐘，隨后均加入重組人TRAIL蛋白繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。采用Annexin-V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以評(píng)估不同溫度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在37℃條件下，加入重組人TRAIL蛋白后，肝癌細(xì)胞的凋亡率為（15.63±2.15）%。當(dāng)溫度升高至43℃時(shí)，肝癌細(xì)胞的凋亡率顯著上升至（28.45±3.02）%，與37℃對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這顯示43℃的溫度環(huán)境能夠顯著促進(jìn)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能。分析其原因，可能是在43℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的某些分子機(jī)制被激活，使得TRAIL蛋白與肝癌細(xì)胞表面死亡受體的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而更有效地激活凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)溫度處于46℃時(shí)，肝癌細(xì)胞凋亡率降至（10.25±1.86）%，與43℃組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在48℃時(shí)，凋亡率為（8.56±1.54）%；50℃時(shí)，凋亡率進(jìn)一步降低至（6.32±1.23）%。這表明46-50℃的溫度范圍對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能具有明顯的抑制作用，隨著溫度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。這種抑制作用可能是由于高溫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，或者使TRAIL蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其與受體的結(jié)合，進(jìn)而阻礙了凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)明確了不同溫度對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，43℃促進(jìn)凋亡，46-50℃抑制凋亡，為后續(xù)深入研究LncRNARNU12在不同溫度下對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步揭示肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制。4.2LncRNARNU12對(duì)熱休克蛋白72（HSP72）表達(dá)的影響為深入探究LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)熱休克蛋白72（HSP72）表達(dá)的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)以MHCC97-H細(xì)胞為研究對(duì)象，運(yùn)用qRT-PCR及Westernblot技術(shù)，對(duì)不同溫度組（37℃、43℃、46℃、50℃）轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體前后的HSP72mRNA和蛋白表達(dá)變化展開(kāi)檢測(cè)。在mRNA水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)溫度組在轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后，HSP72mRNA的表達(dá)均較干擾前顯著降低（P＜0.01）。在37℃對(duì)照組中，干擾前HSP72mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00，干擾后其相對(duì)表達(dá)量降至0.25±0.03。這表明在正常體溫條件下，LncRNARNU12的干擾能夠有效抑制HSP72mRNA的表達(dá)，暗示LncRNARNU12在基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)HSP72的轉(zhuǎn)錄具有正向調(diào)控作用。在43℃實(shí)驗(yàn)組，干擾前HSP72mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.35±0.05，干擾后降至0.30±0.04。盡管43℃時(shí)HSP72mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平高于37℃組，但干擾后的表達(dá)量同樣大幅下降，進(jìn)一步證實(shí)了LncRNARNU12對(duì)HSP72mRNA表達(dá)的上調(diào)作用在不同溫度下的一致性。在46℃實(shí)驗(yàn)組，干擾前HSP72mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.80±0.06，干擾后降至0.40±0.05。此結(jié)果顯示，隨著溫度升高至46℃，HSP72mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平進(jìn)一步上升，而LncRNARNU12干擾后的表達(dá)量仍顯著降低，再次強(qiáng)調(diào)了LncRNARNU12對(duì)HSP72轉(zhuǎn)錄水平的正向調(diào)控關(guān)系。在50℃實(shí)驗(yàn)組，干擾前HSP72mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.20±0.08，干擾后降至0.50±0.06。在高溫50℃條件下，HSP72mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)更高水平，而干擾LncRNARNU12后，其表達(dá)量明顯減少，充分表明溫度升高會(huì)促使HSP72mRNA表達(dá)增加，且LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)HSP72表達(dá)具有顯著的上調(diào)作用。在蛋白水平，37℃、46℃、50℃組轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后，HSP72蛋白的表達(dá)較干擾前均顯著降低（P＜0.05）。在37℃對(duì)照組，干擾前HSP72蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00，干擾后降至0.30±0.04，說(shuō)明在正常體溫下，LncRNARNU12干擾可有效抑制HSP72蛋白的表達(dá)，與mRNA水平的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步支持了LncRNARNU12對(duì)HSP72表達(dá)的正向調(diào)控作用。在46℃實(shí)驗(yàn)組，干擾前HSP72蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.60±0.07，干擾后降至0.50±0.06。這表明在46℃時(shí)，HSP72蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平較高，而干擾LncRNARNU12后，蛋白表達(dá)量顯著下降，再次證實(shí)了LncRNARNU12對(duì)HSP72蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。在50℃實(shí)驗(yàn)組，干擾前HSP72蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.00±0.09，干擾后降至0.60±0.07。在高溫50℃條件下，HSP72蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，干擾LncRNARNU12后，蛋白表達(dá)量明顯降低，再次驗(yàn)證了LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)HSP72表達(dá)的正向調(diào)控作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)HSP72表達(dá)具有顯著的上調(diào)作用，且這種調(diào)控作用在不同溫度條件下均較為穩(wěn)定。隨著溫度升高，HSP72的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而干擾LncRNARNU12可有效抑制HSP72在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，為深入理解LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響為了深入探究LncRNARNU12在重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)染LncRNARNU12慢病毒干擾載體后的MHCC97-H細(xì)胞在重組人TRAIL蛋白處理下的凋亡率進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)組，包括對(duì)照組（僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，未做任何特殊處理，作為基礎(chǔ)參照，以清晰呈現(xiàn)其他實(shí)驗(yàn)組與正常狀態(tài)的差異）、TRAIL組（僅加入重組人TRAIL蛋白，用于觀察在正常LncRNARNU12表達(dá)水平下，TRAIL蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用）以及干擾+TRAIL組（先轉(zhuǎn)染LncRNARNU12慢病毒干擾載體，再加入重組人TRAIL蛋白，以分析干擾LncRNARNU12表達(dá)后，對(duì)TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果的影響）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰地表明，在37℃的常規(guī)培養(yǎng)溫度下，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率處于較低水平，為（3.25±0.56）%，這體現(xiàn)了正常培養(yǎng)條件下肝癌細(xì)胞的自然凋亡狀態(tài)。TRAIL組的細(xì)胞凋亡率顯著上升至（15.63±2.15）%，這充分證明了重組人TRAIL蛋白在正常LncRNARNU12表達(dá)情況下，能夠有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。而干擾+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（22.45±3.02）%，與TRAIL組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這一結(jié)果有力地說(shuō)明，干擾LncRNARNU12的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力，初步揭示了LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。在43℃的溫度條件下，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（4.56±0.68）%，略高于37℃對(duì)照組，可能是由于溫度升高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的應(yīng)激影響。TRAIL組細(xì)胞凋亡率大幅上升至（28.45±3.02）%，表明43℃的溫度環(huán)境能夠協(xié)同重組人TRAIL蛋白，顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。干擾+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率更是高達(dá)（35.67±3.56）%，與TRAIL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了在43℃時(shí)，干擾LncRNARNU12的表達(dá)同樣能夠增強(qiáng)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，再次表明LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的抑制作用在不同溫度下具有一致性。在46℃的實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.67±0.89）%，隨著溫度升高，細(xì)胞凋亡率有所上升。TRAIL組細(xì)胞凋亡率為（10.25±1.86）%，相較于43℃時(shí)的TRAIL組，凋亡率明顯降低，這顯示46℃對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能具有抑制作用。而干擾+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率上升至（17.61±2.56）%，與TRAIL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明在46℃的抑制性溫度環(huán)境下，干擾LncRNARNU12的表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，增強(qiáng)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，進(jìn)一步凸顯了LncRNARNU12在其中的關(guān)鍵抑制作用。在50℃的高溫實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（7.89±1.23）%，高溫對(duì)細(xì)胞凋亡的影響更為顯著。TRAIL組細(xì)胞凋亡率為（6.32±1.23）%，低于對(duì)照組，說(shuō)明50℃對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的抑制作用極為明顯。干擾+TRAIL組的細(xì)胞凋亡率上升至（15.16±2.34）%，與TRAIL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這再次證明在50℃的極端抑制性溫度下，干擾LncRNARNU12的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，充分證實(shí)了LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的抑制作用在高溫條件下依然存在。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在不同溫度條件下對(duì)轉(zhuǎn)染LncRNARNU12慢病毒干擾載體的肝癌細(xì)胞進(jìn)行研究，明確了LncRNARNU12對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用在不同溫度環(huán)境下均穩(wěn)定存在。這一結(jié)果為深入研究LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)探究其具體作用途徑和潛在的治療靶點(diǎn)提供了關(guān)鍵線索。4.4LncRNARNU12的亞細(xì)胞定位為了明確LncRNARNU12在細(xì)胞內(nèi)的具體作用位點(diǎn)，本研究采用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對(duì)50℃時(shí)LncRNARNU12在MHCC97-H細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了深入探究。FISH技術(shù)能夠利用熒光標(biāo)記的核酸探針，與細(xì)胞內(nèi)的靶核酸序列進(jìn)行特異性雜交，從而直觀地顯示靶核酸在細(xì)胞內(nèi)的位置。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將MHCC97-H細(xì)胞接種到預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶幚聿襟E。用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15分鐘，以保持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，防止細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)發(fā)生降解或移位。隨后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，以去除固定液和細(xì)胞表面的雜質(zhì)。接著，用0.5%TritonX-100室溫通透細(xì)胞10分鐘，使細(xì)胞膜的通透性增加，以便后續(xù)探針能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶核酸結(jié)合。再次用PBS洗滌3次，每次5分鐘，以去除通透劑。將細(xì)胞與預(yù)雜交液在37℃孵育30分鐘，以減少非特異性雜交信號(hào)。然后加入用熒光素標(biāo)記的LncRNARNU12探針，在避光條件下37℃雜交過(guò)夜，使探針與細(xì)胞內(nèi)的LncRNARNU12充分結(jié)合。次日，用2×SSC、0.1×SSC分別洗滌細(xì)胞3次，每次10分鐘，以去除未雜交的探針。用DAPI染核5分鐘，DAPI能夠與細(xì)胞核內(nèi)的雙鏈DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光，從而清晰地顯示細(xì)胞核的位置。最后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，以防止熒光信號(hào)淬滅，便于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，LncRNARNU12主要在MHCC97-H細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)。這一結(jié)果表明，LncRNARNU12在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，可能通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，參與基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而影響重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程。其在細(xì)胞核內(nèi)的具體作用機(jī)制可能是LncRNARNU12與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，影響其與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。LncRNARNU12也可能通過(guò)與染色質(zhì)修飾復(fù)合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和修飾狀態(tài)，影響基因的表達(dá)。確定50℃時(shí)LncRNARNU12主要在細(xì)胞核中表達(dá)，為進(jìn)一步探討其在抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的線索和依據(jù)。五、分析與討論5.1LncRNARNU12與HSP72的關(guān)系在本研究中，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和精確的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)LncRNARNU12與熱休克蛋白72（HSP72）之間存在著緊密的調(diào)控關(guān)系。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在不同溫度條件下，干擾LncRNARNU12的表達(dá)均能顯著影響HSP72在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。在mRNA水平，4個(gè)溫度組（37℃、43℃、46℃、50℃）轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后，HSP72mRNA的表達(dá)均較干擾前顯著降低（P＜0.01）。這表明LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)HSP72的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，即LncRNARNU12的存在能夠促進(jìn)HSP72基因的轉(zhuǎn)錄，使其mRNA表達(dá)水平升高。在蛋白水平，37℃、46℃、50℃組轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后，HSP72蛋白的表達(dá)較干擾前均顯著降低（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了LncRNARNU12對(duì)HSP72表達(dá)的正向調(diào)控關(guān)系。LncRNARNU12上調(diào)HSP72表達(dá)的分子機(jī)制可能涉及多個(gè)層面。從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度來(lái)看，LncRNARNU12可能通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響HSP72基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，一些LncRNA能夠與轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，招募到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始。LncRNARNU12可能與某些特異性結(jié)合HSP72基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，增強(qiáng)其與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而促進(jìn)HSP72基因的轉(zhuǎn)錄。從表觀遺傳調(diào)控層面分析，LncRNARNU12可能參與染色質(zhì)修飾過(guò)程，改變HSP72基因所在區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和修飾狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。例如，某些LncRNA可以招募組蛋白修飾酶，使組蛋白發(fā)生甲基化、乙酰化等修飾，改變?nèi)旧|(zhì)的開(kāi)放性，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。LncRNARNU12可能通過(guò)招募相關(guān)的染色質(zhì)修飾復(fù)合體，使HSP72基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)處于開(kāi)放狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶的結(jié)合，從而上調(diào)HSP72的表達(dá)。LncRNARNU12與HSP72的相互作用對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了重要影響。HSP72作為一種重要的熱休克蛋白，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理?xiàng)l件下，HSP72可以維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，幫助錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊，避免蛋白質(zhì)聚集對(duì)細(xì)胞造成損傷。在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，如高溫、氧化應(yīng)激等，HSP72的表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在肝癌細(xì)胞中，高表達(dá)的HSP72可以抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，阻斷凋亡信號(hào)通路的傳導(dǎo)。HSP72可以與Caspase家族蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究中，LncRNARNU12上調(diào)HSP72的表達(dá)，可能通過(guò)增強(qiáng)HSP72的抗凋亡作用，抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)干擾LncRNARNU12的表達(dá)后，HSP72的表達(dá)降低，細(xì)胞對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)凋亡的敏感性增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升。這一結(jié)果表明，LncRNARNU12通過(guò)調(diào)控HSP72的表達(dá)，在重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮了重要的抑制作用。在不同溫度條件下，LncRNARNU12與HSP72的關(guān)系及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響存在一定的差異。在43℃時(shí)，溫度促進(jìn)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能，同時(shí)HSP72的表達(dá)也有所升高。此時(shí)，LncRNARNU12對(duì)HSP72的上調(diào)作用可能在一定程度上減弱了TRAIL蛋白的促凋亡效果，但由于TRAIL蛋白的作用較強(qiáng)，總體上細(xì)胞凋亡率仍顯著上升。而在46-50℃時(shí)，溫度抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能，HSP72的表達(dá)進(jìn)一步升高。LncRNARNU12上調(diào)HSP72的表達(dá)，可能是導(dǎo)致這一溫度范圍內(nèi)TRAIL蛋白促凋亡功能被抑制的重要原因之一。干擾LncRNARNU12后，HSP72表達(dá)降低，TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能得到恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率顯著上升。這說(shuō)明在不同溫度環(huán)境下，LncRNARNU12與HSP72的相互作用對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響具有復(fù)雜性，可能受到溫度等多種因素的調(diào)節(jié)。5.2LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制基于前面的研究結(jié)果，LncRNARNU12在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HSP72的表達(dá)，進(jìn)而抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其具體機(jī)制可能如下。LncRNARNU12主要在細(xì)胞核中表達(dá)，這為其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄提供了空間基礎(chǔ)。在細(xì)胞核內(nèi)，LncRNARNU12可能通過(guò)與特定的轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)修飾復(fù)合物相互作用，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HSP72基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。研究表明，某些LncRNA能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，改變轉(zhuǎn)錄因子的活性或其在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。LncRNARNU12可能與調(diào)控HSP72基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用，增強(qiáng)該轉(zhuǎn)錄因子與HSP72基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ的招募和轉(zhuǎn)錄起始，使得HSP72基因轉(zhuǎn)錄生成更多的mRNA。從染色質(zhì)修飾角度來(lái)看，LncRNARNU12可能招募組蛋白修飾酶到HSP72基因的啟動(dòng)子區(qū)域，改變組蛋白的修飾狀態(tài)，如使組蛋白H3的賴氨酸殘基發(fā)生甲基化（如H3K4me3）或乙酰化（如H3K9ac）等修飾，這些修飾能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加松散，增加基因的可及性，有利于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與DNA的結(jié)合，從而促進(jìn)HSP72基因的轉(zhuǎn)錄。HSP72作為一種熱休克蛋白，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)功能，尤其是在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如重組人TRAIL蛋白的作用時(shí)，正常情況下，TRAIL蛋白與肝癌細(xì)胞表面的死亡受體DR4或DR5結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），進(jìn)而激活半胱氨酸蛋白酶8（caspase8），caspase8激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase3、caspase6和caspase7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在這一過(guò)程中，高表達(dá)的HSP72可以通過(guò)多種方式抑制細(xì)胞凋亡。HSP72可以與caspase8結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，使細(xì)胞凋亡信號(hào)無(wú)法有效傳導(dǎo)。HSP72還可以與凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等線粒體相關(guān)的凋亡蛋白相互作用，阻止它們從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制線粒體途徑的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。LncRNARNU12通過(guò)上調(diào)HSP72的表達(dá)，增強(qiáng)了HSP72對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而降低了重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的效果。當(dāng)干擾LncRNARNU12的表達(dá)后，HSP72的表達(dá)水平下降，細(xì)胞內(nèi)的凋亡抑制機(jī)制減弱，肝癌細(xì)胞對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)凋亡的敏感性增加，細(xì)胞凋亡率上升。在不同溫度條件下，這一機(jī)制也受到溫度的影響。在43℃時(shí)，溫度本身可能激活了一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)了重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能。盡管LncRNARNU12上調(diào)HSP72表達(dá)，但由于溫度的促進(jìn)作用較強(qiáng)，總體上細(xì)胞凋亡率仍顯著上升。而在46-50℃時(shí)，溫度可能通過(guò)某種機(jī)制增強(qiáng)了LncRNARNU12對(duì)HSP72的上調(diào)作用，使得HSP72表達(dá)進(jìn)一步升高，從而更有效地抑制了重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。干擾LncRNARNU12后，HSP72表達(dá)降低，TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能得到恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率顯著上升。LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及LncRNARNU12對(duì)HSP72基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控以及HSP72對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的抑制，并且這一機(jī)制在不同溫度條件下存在動(dòng)態(tài)變化。深入了解這一機(jī)制，對(duì)于揭示肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及開(kāi)發(fā)新的肝癌治療策略具有重要的理論和實(shí)踐意義。5.3研究結(jié)果的臨床意義本研究的結(jié)果對(duì)于肝癌治療具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前肝癌的治療面臨諸多挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法存在局限性，重組人TRAIL蛋白雖有潛力，但部分肝癌細(xì)胞對(duì)其誘導(dǎo)凋亡存在抵抗。本研究揭示了LncRNARNU12抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，這為肝癌治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。以LncRNARNU12為靶點(diǎn)的治療策略具有一定的可行性。通過(guò)抑制LncRNARNU12的表達(dá)，可以解除其對(duì)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的抑制作用，增強(qiáng)TRAIL蛋白的療效。在臨床實(shí)踐中，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)LncRNARNU12的小分子干擾RNA（siRNA）或反義寡核苷酸（ASO），將其遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，特異性地降低LncRNARNU12的表達(dá)。利用納米技術(shù)，將siRNA或ASO包裹在納米顆粒中，提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向治療。還可以通過(guò)基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)LncRNARNU12的基因序列進(jìn)行編輯，使其失去功能，從而達(dá)到治療肝癌的目的。熱休克蛋白72（HSP72）也是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。由于LncRNARNU12通過(guò)上調(diào)HSP72來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，因此抑制HSP72的表達(dá)或活性，也可能增強(qiáng)重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的效果。可以研發(fā)HSP72的特異性抑制劑，阻斷HSP72與凋亡相關(guān)蛋白的相互作用，從而恢復(fù)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL蛋白的敏感性。還可以通過(guò)RNA干擾技術(shù)，沉默HSP72的基因表達(dá)，降低其在肝癌細(xì)胞中的含量，增強(qiáng)TRAIL蛋白的促凋亡作用。聯(lián)合治療策略可能是提高肝癌治療效果的有效途徑。將針對(duì)LncRNARNU12或HSP72的治療方法與重組人TRAIL蛋白治療相結(jié)合，有望克服肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL蛋白的抵抗，提高治療的成功率。在臨床研究中，可以開(kāi)展相關(guān)的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證聯(lián)合治療策略的安全性和有效性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)了干擾LncRNARNU12表達(dá)能夠