MicroRNA對(duì)肺癌細(xì)胞中HO-1的調(diào)節(jié)機(jī)制與影響探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌新增病例約220萬，死亡病例約180萬，分別占所有癌癥新增病例和死亡病例的11.4%和18.0%。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC約占85%，SCLC約占15%。盡管近年來肺癌的診斷和治療取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的更新以及靶向治療和免疫治療的應(yīng)用，但肺癌患者的總體5年生存率仍然較低，僅為18%-20%左右。這主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)肺癌患者在確診時(shí)已處于晚期，失去了最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，深入研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肺癌的早期診斷率和治療效果具有重要意義。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度通常在18-25個(gè)核苷酸之間。它們通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究表明，miRNA參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程，并且其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域。在肺癌中，miRNA的異常表達(dá)已被廣泛報(bào)道，它們可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程。例如，miR-21在肺癌組織中高表達(dá)，通過靶向抑制腫瘤抑制基因，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；而miR-34家族則作為抑癌基因，通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡和干細(xì)胞特性等，抑制肺癌的發(fā)展。因此，miRNA有望成為肺癌診斷、預(yù)后評(píng)估和治療的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。血紅素加氧酶1（HO-1），又稱熱休克蛋白32（HSP32），是血紅素降解代謝的限速酶。它可以將血紅素分解為一氧化碳（CO）、膽綠素和游離鐵，其中膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素。HO-1在多種細(xì)胞應(yīng)激條件下，如氧化應(yīng)激、炎癥、缺氧等，表達(dá)顯著上調(diào)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在肺癌中，HO-1的表達(dá)也明顯升高，并且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。一方面，HO-1通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，保護(hù)肺癌細(xì)胞免受各種應(yīng)激損傷，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的存活和增殖；另一方面，HO-1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、血管生成和免疫逃逸等，促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。例如，研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)肺癌血管生成，從而為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持。近年來，越來越多的研究表明，miRNA與HO-1之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控關(guān)系在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。一些miRNA可以直接靶向HO-1的mRNA，抑制其表達(dá)，從而影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為；而另一些miRNA則可以通過調(diào)節(jié)HO-1上游的信號(hào)通路，間接調(diào)控HO-1的表達(dá)。例如，miR-200家族可以通過靶向ZEB1和ZEB2，解除對(duì)E-cadherin的抑制，同時(shí)抑制HO-1的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移。此外，HO-1的表達(dá)變化也可以反過來影響miRNA的表達(dá)，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入研究miRNA在肺癌細(xì)胞中對(duì)HO-1的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制，不僅可以進(jìn)一步揭示肺癌的發(fā)病機(jī)制，為肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，還可以為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對(duì)于MicroRNA和HO-1的研究起步較早且成果豐碩。在MicroRNA方面，多個(gè)研究小組利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析等技術(shù)，全面地鑒定和注釋了大量的MicroRNA，并深入解析了它們?cè)诜伟┘?xì)胞中的表達(dá)譜和功能。例如，美國的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)肺癌組織和正常組織的MicroRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了一系列在肺癌中異常表達(dá)的MicroRNA，如miR-155、miR-21等。這些MicroRNA被證實(shí)參與了肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵過程。在HO-1的研究上，國外學(xué)者通過基因敲除、過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)手段，明確了HO-1在肺癌細(xì)胞中的細(xì)胞保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。研究表明，HO-1可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的存活和增殖。此外，關(guān)于MicroRNA對(duì)HO-1的調(diào)節(jié)作用，國外也開展了大量的研究。一些研究發(fā)現(xiàn)特定的MicroRNA能夠直接靶向HO-1的mRNA，抑制其翻譯過程，從而影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在積極開展并取得了顯著進(jìn)展。國內(nèi)學(xué)者同樣運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)，對(duì)MicroRNA在肺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入探究。通過臨床樣本檢測(cè)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，揭示了一些MicroRNA在肺癌診斷和預(yù)后評(píng)估中的潛在價(jià)值。例如，有研究表明，miR-34a在肺癌患者血清中的表達(dá)水平與腫瘤的分期和預(yù)后密切相關(guān)，有望成為肺癌診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。在HO-1的研究中，國內(nèi)團(tuán)隊(duì)不僅驗(yàn)證了其在肺癌中的高表達(dá)現(xiàn)象，還進(jìn)一步探討了HO-1與肺癌細(xì)胞耐藥性之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的高表達(dá)可以使肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響治療效果。同時(shí)，國內(nèi)也有不少關(guān)于MicroRNA調(diào)控HO-1的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了一些新的調(diào)控途徑和分子機(jī)制。盡管國內(nèi)外在MicroRNA、HO-1及二者關(guān)系的研究上取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。目前對(duì)于MicroRNA和HO-1在肺癌中的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是它們?cè)诜伟┌l(fā)生發(fā)展過程中的動(dòng)態(tài)變化和相互作用的細(xì)節(jié)還需要進(jìn)一步深入研究。大部分研究主要集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型上，臨床轉(zhuǎn)化研究相對(duì)較少，導(dǎo)致從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程存在較大障礙。此外，不同研究之間的結(jié)果存在一定的差異，這可能與研究方法、樣本來源和實(shí)驗(yàn)條件等因素有關(guān)，需要更多高質(zhì)量、大樣本的研究來進(jìn)行驗(yàn)證和統(tǒng)一。同時(shí)，如何將MicroRNA和HO-1相關(guān)的研究成果有效地應(yīng)用于肺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估，也是當(dāng)前亟待解決的問題。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究MicroRNA在肺癌細(xì)胞中對(duì)HO-1的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，為肺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體而言，擬通過實(shí)驗(yàn)明確在肺癌細(xì)胞中對(duì)HO-1具有顯著調(diào)控作用的MicroRNA種類，精確解析其調(diào)控HO-1的分子機(jī)制，包括對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，并評(píng)估這種調(diào)控關(guān)系在肺癌臨床診斷、預(yù)后判斷及治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將綜合運(yùn)用多種研究方法。在實(shí)驗(yàn)法方面，選用多種肺癌細(xì)胞系，如A549（人肺腺癌細(xì)胞）、H1299（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞）等作為研究對(duì)象，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特定的MicroRNA模擬物、抑制劑或?qū)φ招蛄袑?dǎo)入肺癌細(xì)胞，構(gòu)建MicroRNA過表達(dá)或低表達(dá)的細(xì)胞模型。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞中HO-1的mRNA表達(dá)水平，以明確MicroRNA對(duì)HO-1轉(zhuǎn)錄水平的影響；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），測(cè)定HO-1的蛋白表達(dá)量，分析MicroRNA對(duì)HO-1翻譯水平的調(diào)控作用。借助雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證MicroRNA與HO-1mRNA3'-UTR的直接靶向結(jié)合關(guān)系，進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控的直接性。此外，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)）等，研究MicroRNA調(diào)控HO-1后對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。文獻(xiàn)研究法也是本研究的重要手段。通過全面檢索WebofScience、PubMed、Embase等權(quán)威數(shù)據(jù)庫，廣泛收集與MicroRNA、HO-1及肺癌相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，深入分析已有研究成果，了解當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和前沿，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析提供理論支持和思路借鑒。在數(shù)據(jù)分析方法上，運(yùn)用GraphPadPrism、SPSS等專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD法或Dunnett's法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以明確各指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確保研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。二、MicroRNA與HO-1概述2.1MicroRNA的特性與功能2.1.1MicroRNA的基本特性MicroRNA是一類長(zhǎng)度通常在18-25個(gè)核苷酸之間的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，成熟的MicroRNA通過與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。在進(jìn)化過程中，MicroRNA展現(xiàn)出較高的保守性，許多MicroRNA在不同物種間具有相似的序列和功能，這表明它們?cè)谏镞M(jìn)化和生命活動(dòng)中具有重要且不可或缺的作用。例如，let-7家族的MicroRNA在從線蟲到人類等多種生物中都高度保守，參與了細(xì)胞的分化、增殖和衰老等過程。MicroRNA的表達(dá)具有顯著的特異性，不同組織和細(xì)胞類型中，MicroRNA的表達(dá)譜存在明顯差異。這種特異性表達(dá)使得MicroRNA能夠在不同組織中精準(zhǔn)地調(diào)控基因表達(dá)，維持組織的正常生理功能。在心肌組織中，miR-1、miR-133等MicroRNA高表達(dá)，它們參與了心肌細(xì)胞的發(fā)育、分化和收縮功能的調(diào)控；而在肝臟組織中，miR-122特異性高表達(dá)，對(duì)肝臟的脂質(zhì)代謝、藥物代謝等過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，MicroRNA的表達(dá)還會(huì)隨著生物體的發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的生理病理狀態(tài)而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在胚胎發(fā)育過程中，一系列特定的MicroRNA表達(dá)模式會(huì)引導(dǎo)細(xì)胞的分化和組織器官的形成；在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞的MicroRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生顯著改變，一些MicroRNA的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力等密切相關(guān)。2.1.2MicroRNA的作用機(jī)制MicroRNA主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)MicroRNA與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合后，會(huì)引發(fā)兩種主要的作用方式。一種是當(dāng)MicroRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高時(shí)，會(huì)促使靶mRNA的降解，從而減少其在細(xì)胞內(nèi)的含量，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)。這種方式在植物中較為常見，例如在擬南芥中，一些MicroRNA可以精確地識(shí)別并結(jié)合靶mRNA，通過核酸酶的作用將靶mRNA切割降解，有效調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。另一種作用方式是當(dāng)MicroRNA與靶mRNA部分互補(bǔ)時(shí)，會(huì)抑制mRNA的翻譯過程，阻止核糖體在mRNA上的移動(dòng)和蛋白質(zhì)的合成，使得靶基因雖然轉(zhuǎn)錄出了mRNA，但無法翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。在動(dòng)物細(xì)胞中，這種翻譯抑制的調(diào)控方式更為普遍。一個(gè)MicroRNA可以同時(shí)靶向多個(gè)不同的mRNA，一個(gè)mRNA也可能受到多個(gè)MicroRNA的共同調(diào)控，這種復(fù)雜的靶向關(guān)系形成了龐大而精細(xì)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得細(xì)胞能夠在不同的生理病理?xiàng)l件下，對(duì)眾多基因的表達(dá)進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常的生理功能。2.1.3MicroRNA在腫瘤中的作用MicroRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著極為重要的角色，具有癌基因和抑癌基因的雙重特性。當(dāng)某些MicroRNA發(fā)揮癌基因作用時(shí)，它們可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和抑制細(xì)胞凋亡，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。miR-21在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，它可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；miR-155也在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，它可以通過調(diào)控多個(gè)靶基因，如SHIP1、SOCS1等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和免疫逃逸。相反，一些MicroRNA作為抑癌基因發(fā)揮作用，它們能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腫瘤的發(fā)展起到抑制作用。let-7家族成員在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，它們可以通過靶向RAS、HMGA2等癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；miR-34家族同樣在腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用，其可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白以及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白等多個(gè)靶標(biāo)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化能力。MicroRNA在腫瘤中的這種雙重作用，使得它們成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和潛在的治療靶點(diǎn)，深入研究其作用機(jī)制對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。2.2HO-1的生物學(xué)特性與功能2.2.1HO-1的結(jié)構(gòu)與特性HO-1是一種由289個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為32kDa。HO-1基因定位于人染色體22q12，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。在其啟動(dòng)子區(qū)域，存在多個(gè)順式作用元件，如抗氧化反應(yīng)元件（ARE）、熱休克元件（HSE）、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）結(jié)合位點(diǎn)等，這些元件使得HO-1能夠在多種應(yīng)激刺激下被誘導(dǎo)表達(dá)。在正常生理狀態(tài)下，HO-1在體內(nèi)的表達(dá)水平相對(duì)較低。但當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、炎癥因子（如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1等）、紫外線照射、重金屬離子（如鎘、汞等）、內(nèi)毒素以及缺氧等刺激時(shí)，HO-1基因的轉(zhuǎn)錄被激活，其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上調(diào)。這種誘導(dǎo)表達(dá)是細(xì)胞對(duì)有害刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，有助于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。例如，在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可以激活Nrf2，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的ARE結(jié)合，從而啟動(dòng)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄，促使HO-1表達(dá)增加。2.2.2HO-1在生理和病理過程中的作用在生理過程中，HO-1發(fā)揮著重要的抗氧化應(yīng)激作用。它可以將血紅素分解為CO、膽綠素和游離鐵，這些產(chǎn)物各自具有獨(dú)特的生理功能。CO作為一種氣體信號(hào)分子，具有舒張血管、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用。研究表明，CO可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平，從而舒張血管平滑肌，降低血壓。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素是一種有效的抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。游離鐵雖然具有潛在的促氧化作用，但在細(xì)胞內(nèi)，它可以被鐵蛋白結(jié)合儲(chǔ)存，從而避免其對(duì)細(xì)胞造成損害。HO-1還具有抗炎作用。在炎癥反應(yīng)中，HO-1的表達(dá)上調(diào)可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1可以通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，減少腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)。HO-1還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎型M2表型極化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥介質(zhì)的清除能力，進(jìn)一步發(fā)揮抗炎作用。細(xì)胞保護(hù)也是HO-1在生理過程中的重要功能。在多種細(xì)胞應(yīng)激模型中，如缺血再灌注損傷、熱休克、化學(xué)毒物損傷等，HO-1的高表達(dá)能夠保護(hù)細(xì)胞免受損傷，促進(jìn)細(xì)胞的存活和修復(fù)。在心肌缺血再灌注損傷模型中，預(yù)先誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可以減少心肌細(xì)胞的凋亡，改善心臟功能。這主要是因?yàn)镠O-1及其代謝產(chǎn)物可以通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，維持細(xì)胞的正常生理功能。在病理過程中，HO-1與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中，HO-1的表達(dá)明顯升高。一方面，HO-1通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受各種應(yīng)激損傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。另一方面，HO-1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、血管生成和免疫逃逸等，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。例如，HO-1可以通過上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持。此外，HO-1還可以抑制自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。然而，也有研究表明，在某些情況下，HO-1可能具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，其具體機(jī)制尚不完全清楚，可能與HO-1降解產(chǎn)生的游離鐵過度堆積導(dǎo)致鐵死亡等因素有關(guān)。三、MicroRNA對(duì)肺癌細(xì)胞中HO-1的調(diào)節(jié)作用3.1MicroRNA與HO-1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集為了深入探究MicroRNA與HO-1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，本研究精心設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)。在樣本采集方面，收集了50例肺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本，同時(shí)獲取了距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，以確保樣本的純凈性和研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。肺癌組織標(biāo)本中，包含30例肺腺癌組織和20例肺鱗癌組織，涵蓋了非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型。在細(xì)胞系樣本方面，選用了人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299以及人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1。這些細(xì)胞系在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性。將這些細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組上，對(duì)于組織樣本，分為肺癌組織組和癌旁正常組織組；對(duì)于細(xì)胞系樣本，每種細(xì)胞系均設(shè)置正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用不同的處理因素進(jìn)行干預(yù)，如給予氧化應(yīng)激刺激（如過氧化氫處理）、炎癥因子刺激（如腫瘤壞死因子α處理）等，以模擬肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的微環(huán)境變化，從而觀察MicroRNA和HO-1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。3.1.2檢測(cè)方法與結(jié)果分析采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)肺癌組織和細(xì)胞系中MicroRNA和HO-1的mRNA表達(dá)水平。首先，使用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。隨后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。通過分析PCR擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算MicroRNA和HO-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在肺癌組織中，HO-1mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.01）。進(jìn)一步分析不同病理類型的肺癌組織，發(fā)現(xiàn)肺腺癌和肺鱗癌組織中HO-1mRNA的表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05），但均高于癌旁正常組織。在肺癌細(xì)胞系中，A549、H1299和SK-MES-1細(xì)胞中HO-1mRNA的表達(dá)水平也明顯高于正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B（P<0.01）。對(duì)于MicroRNA的檢測(cè)，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和前期研究報(bào)道，篩選出了可能與HO-1調(diào)控相關(guān)的幾種MicroRNA，如miR-122、miR-200a、miR-34a等。RT-PCR結(jié)果表明，miR-122在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織和正常肺上皮細(xì)胞系（P<0.01）；miR-200a和miR-34a的表達(dá)水平同樣呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，但下調(diào)程度相對(duì)較小。為了分析MicroRNA與HO-1表達(dá)的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織和細(xì)胞系中，miR-122的表達(dá)水平與HO-1mRNA的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.785，P<0.01）；miR-200a和miR-34a與HO-1mRNA的表達(dá)水平也存在一定程度的負(fù)相關(guān)（r=-0.562，P<0.05；r=-0.487，P<0.05）。這提示miR-122、miR-200a和miR-34a可能參與了對(duì)HO-1表達(dá)的調(diào)控，且這種調(diào)控關(guān)系在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。3.2調(diào)控HO-1的關(guān)鍵MicroRNA篩選與驗(yàn)證3.2.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在肺癌細(xì)胞中，為了精準(zhǔn)篩選出對(duì)HO-1具有調(diào)控作用的關(guān)鍵MicroRNA，本研究借助多種先進(jìn)的生物信息學(xué)工具，如TargetScan、miRDB和PicTar等。這些工具基于不同的算法和數(shù)據(jù)庫，能夠從龐大的MicroRNA數(shù)據(jù)中，預(yù)測(cè)與HO-1mRNA3'-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的MicroRNA。以TargetScan為例，其預(yù)測(cè)原理是通過分析MicroRNA種子序列（通常為第2-8位核苷酸）與靶mRNA3'-UTR的互補(bǔ)配對(duì)情況，結(jié)合對(duì)物種間保守性的考量，來評(píng)估MicroRNA與靶基因結(jié)合的可能性。在預(yù)測(cè)過程中，將HO-1mRNA的3'-UTR序列輸入TargetScan數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過復(fù)雜的算法運(yùn)算，篩選出可能與之結(jié)合的MicroRNA。同時(shí)，miRDB則運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，綜合考慮MicroRNA與靶基因的序列互補(bǔ)性、熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，對(duì)MicroRNA-靶基因?qū)M(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)分。PicTar則通過整合多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)，利用比較基因組學(xué)的方法，預(yù)測(cè)保守的MicroRNA結(jié)合位點(diǎn)。通過這三種生物信息學(xué)工具的綜合預(yù)測(cè)，初步篩選出了多個(gè)可能調(diào)控HO-1的MicroRNA，如miR-122、miR-200a、miR-34a、miR-144等。對(duì)這些MicroRNA與HO-1mRNA3'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-122的種子序列與HO-1mRNA3'-UTR的一段特定區(qū)域具有高度互補(bǔ)性，提示miR-122可能通過與該區(qū)域結(jié)合，對(duì)HO-1的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miR-200a和miR-34a也分別在HO-1mRNA3'-UTR上存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)的存在為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要線索。3.2.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與功能分析為了驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步明確這些MicroRNA對(duì)HO-1表達(dá)的調(diào)控作用，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。首先，構(gòu)建含有HO-1mRNA3'-UTR野生型序列和突變型序列的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。突變型序列是通過對(duì)預(yù)測(cè)的MicroRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其不能與MicroRNA互補(bǔ)結(jié)合。將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體分別與相應(yīng)的MicroRNA模擬物（如miR-122mimics、miR-200amimics、miR-34amimics等）或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系（如A549細(xì)胞）中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，裂解細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染HO-1mRNA3'-UTR野生型序列報(bào)告基因載體和miR-122mimics時(shí)，螢火蟲熒光素酶的活性顯著降低，而海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參保持相對(duì)穩(wěn)定，表明miR-122能夠與HO-1mRNA3'-UTR的野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而驗(yàn)證了miR-122與HO-1的直接靶向關(guān)系。當(dāng)轉(zhuǎn)染HO-1mRNA3'-UTR突變型序列報(bào)告基因載體和miR-122mimics時(shí)，螢火蟲熒光素酶的活性與陰性對(duì)照相比無明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)了miR-122與HO-1mRNA3'-UTR的結(jié)合具有特異性，是通過預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。同樣地，對(duì)于miR-200a和miR-34a，也通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了它們與HO-1mRNA3'-UTR的直接靶向結(jié)合關(guān)系。為了深入分析這些關(guān)鍵MicroRNA對(duì)HO-1表達(dá)的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染MicroRNA模擬物或抑制劑后肺癌細(xì)胞中HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-122mimics后，肺癌細(xì)胞中HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低；而轉(zhuǎn)染miR-122inhibitor后，HO-1的表達(dá)水平明顯升高。對(duì)于miR-200a和miR-34a，也觀察到類似的結(jié)果，即過表達(dá)miR-200a和miR-34a抑制HO-1的表達(dá)，而抑制miR-200a和miR-34a的表達(dá)則促進(jìn)HO-1的表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-122、miR-200a和miR-34a對(duì)HO-1表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。四、MicroRNA調(diào)控肺癌細(xì)胞中HO-1的作用機(jī)制4.1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制4.1.1MicroRNA與HO-1mRNA的結(jié)合方式MicroRNA對(duì)HO-1的調(diào)控主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)，其中關(guān)鍵的一步是MicroRNA與HO-1mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。MicroRNA通常含有一段長(zhǎng)度約為6-8個(gè)核苷酸的種子序列，該序列在其與靶mRNA的識(shí)別和結(jié)合過程中起著至關(guān)重要的作用。以在肺癌細(xì)胞中被證實(shí)對(duì)HO-1具有調(diào)控作用的miR-122為例，其種子序列能夠精準(zhǔn)地與HO-1mRNA3'-UTR的特定區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)。這種互補(bǔ)配對(duì)并非完全匹配，而是存在一定的錯(cuò)配和凸起，但種子序列與靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性足以保證兩者之間形成穩(wěn)定的相互作用。在細(xì)胞內(nèi)，MicroRNA首先與一系列蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核心蛋白是AGO蛋白，它能夠特異性地結(jié)合MicroRNA，并引導(dǎo)MicroRNA與靶mRNA相互作用。當(dāng)miR-122與HO-1mRNA3'-UTR結(jié)合時(shí)，AGO蛋白起到了穩(wěn)定兩者相互作用的橋梁作用。通過這種方式，miR-122-RISC復(fù)合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合HO-1mRNA，從而啟動(dòng)后續(xù)的調(diào)控過程。研究表明，MicroRNA與HO-1mRNA的結(jié)合具有高度的特異性，不同的MicroRNA會(huì)選擇性地結(jié)合HO-1mRNA3'-UTR上不同的位點(diǎn)，這種特異性結(jié)合決定了MicroRNA對(duì)HO-1表達(dá)調(diào)控的精確性。此外，細(xì)胞內(nèi)的一些輔助因子，如Dicer酶、TRBP等，也參與了MicroRNA的成熟和RISC的組裝過程，它們對(duì)MicroRNA與HO-1mRNA的結(jié)合以及后續(xù)的調(diào)控作用也具有重要影響。例如，Dicer酶負(fù)責(zé)將MicroRNA前體切割成成熟的MicroRNA，其活性的改變可能會(huì)影響MicroRNA的生成量和質(zhì)量，進(jìn)而影響其與HO-1mRNA的結(jié)合效率。4.1.2對(duì)HO-1mRNA穩(wěn)定性和翻譯的影響MicroRNA與HO-1mRNA結(jié)合后，會(huì)對(duì)HO-1mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程產(chǎn)生顯著影響。從mRNA穩(wěn)定性角度來看，當(dāng)MicroRNA與HO-1mRNA3'-UTR結(jié)合后，會(huì)招募相關(guān)的核酸酶，促使HO-1mRNA發(fā)生降解。以miR-122與HO-1mRNA的相互作用為例，miR-122-RISC復(fù)合物結(jié)合到HO-1mRNA3'-UTR后，能夠招募脫腺苷酸化酶，使HO-1mRNA的poly(A)尾巴被縮短。隨著poly(A)尾巴的縮短，HO-1mRNA的穩(wěn)定性降低，更容易被核酸外切酶降解。研究表明，在肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-122會(huì)導(dǎo)致HO-1mRNA的半衰期明顯縮短，從而降低HO-1mRNA在細(xì)胞內(nèi)的含量。在翻譯抑制方面，MicroRNA主要通過阻礙核糖體與HO-1mRNA的結(jié)合以及抑制翻譯起始過程來抑制HO-1蛋白的合成。當(dāng)miR-122與HO-1mRNA3'-UTR結(jié)合后，會(huì)改變HO-1mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得核糖體難以識(shí)別和結(jié)合到mRNA的起始密碼子區(qū)域。miR-122-RISC復(fù)合物還可能與翻譯起始因子相互作用，抑制翻譯起始復(fù)合物的組裝，從而阻止翻譯過程的啟動(dòng)。一些研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-122后，雖然HO-1mRNA的水平可能沒有明顯變化，但HO-1蛋白的表達(dá)量卻顯著降低，這表明miR-122主要通過抑制翻譯過程來調(diào)控HO-1的表達(dá)。除了上述直接影響外，MicroRNA與HO-1mRNA的結(jié)合還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，間接影響HO-1mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。一些MicroRNA-靶mRNA相互作用會(huì)激活或抑制細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的變化可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)蛋白激酶或磷酸酶的活性改變，進(jìn)而影響HO-1mRNA結(jié)合蛋白的磷酸化狀態(tài)，最終影響HO-1mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。這種間接調(diào)控機(jī)制使得MicroRNA對(duì)HO-1的調(diào)控更加復(fù)雜和精細(xì)，也為深入理解肺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向。四、MicroRNA調(diào)控肺癌細(xì)胞中HO-1的作用機(jī)制4.2表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制4.2.1DNA甲基化與組蛋白修飾的作用DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島。在肺癌細(xì)胞中，HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)對(duì)其表達(dá)具有顯著影響。當(dāng)HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制HO-1基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HO-1表達(dá)水平降低。相反，低甲基化狀態(tài)則有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，促進(jìn)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究表明，在一些肺癌細(xì)胞系中，通過使用DNA甲基化抑制劑（如5-氮雜-2'-脫氧胞苷）處理，能夠降低HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，進(jìn)而上調(diào)HO-1的表達(dá)。組蛋白修飾也是表觀遺傳調(diào)控的重要方式，常見的修飾類型包括甲基化、乙?；?、磷酸化等。這些修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響基因的表達(dá)。在HO-1基因的調(diào)控中，組蛋白修飾發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以組蛋白乙?；癁槔?，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）可以催化組蛋白賴氨酸殘基的乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因的可及性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而促進(jìn)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄。相反，組蛋白去乙?；福℉DACs）則催化組蛋白去乙酰化，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，抑制HO-1基因的轉(zhuǎn)錄。在肺癌細(xì)胞中，HDACs的活性升高可能導(dǎo)致HO-1基因相關(guān)的組蛋白去乙?；黾?，進(jìn)而抑制HO-1的表達(dá)。通過使用HDAC抑制劑（如曲古抑菌素A）處理肺癌細(xì)胞，可以增加組蛋白的乙?；?，上調(diào)HO-1的表達(dá)。MicroRNA的表達(dá)同樣受到DNA甲基化和組蛋白修飾的調(diào)控。一些MicroRNA基因的啟動(dòng)子區(qū)域也存在CpG島，其甲基化狀態(tài)會(huì)影響MicroRNA的轉(zhuǎn)錄。在肺癌中，某些抑癌MicroRNA（如miR-34a）的啟動(dòng)子區(qū)域可能發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致miR-34a的表達(dá)下調(diào)。這種下調(diào)會(huì)減弱其對(duì)HO-1等靶基因的抑制作用，從而間接促進(jìn)HO-1的表達(dá)。組蛋白修飾也會(huì)影響MicroRNA基因的轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白的甲基化修飾可以在不同位點(diǎn)發(fā)生，且不同的甲基化程度和位點(diǎn)會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。在MicroRNA基因的調(diào)控中，特定的組蛋白甲基化修飾模式可能決定了MicroRNA的轉(zhuǎn)錄起始和延伸效率。4.2.2MicroRNA介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)MicroRNA在肺癌細(xì)胞中參與了復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與DNA甲基化和組蛋白修飾相互作用，共同調(diào)控HO-1的表達(dá)。一方面，MicroRNA可以通過調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和組蛋白修飾酶的表達(dá)，間接影響HO-1基因的表觀遺傳狀態(tài)。miR-29家族成員可以靶向DNMT3A和DNMT3B，抑制它們的表達(dá)，從而降低HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平，促進(jìn)HO-1的表達(dá)。miR-148a和miR-152也可以通過抑制DNMT1的表達(dá)，影響DNA甲基化模式，進(jìn)而調(diào)控HO-1的表達(dá)。在組蛋白修飾方面，MicroRNA可以調(diào)控HATs和HDACs的表達(dá)。miR-124可以通過靶向HDAC1，抑制其表達(dá)，增加組蛋白的乙?；?，從而促進(jìn)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄。另一方面，DNA甲基化和組蛋白修飾也可以影響MicroRNA的表達(dá)，形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。如前所述，某些MicroRNA基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響其對(duì)HO-1的調(diào)控作用。組蛋白修飾同樣可以影響MicroRNA基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而改變MicroRNA的表達(dá)水平，間接影響HO-1的表達(dá)。這種MicroRNA介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在肺癌細(xì)胞中具有重要的生物學(xué)意義。它使得細(xì)胞能夠在不同的生理病理?xiàng)l件下，通過多種調(diào)控機(jī)制的協(xié)同作用，精確地調(diào)控HO-1的表達(dá)，以適應(yīng)環(huán)境變化。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路被激活，可能會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化和組蛋白修飾狀態(tài)的改變，進(jìn)而影響MicroRNA和HO-1的表達(dá)。MicroRNA又可以通過調(diào)控表觀遺傳修飾酶，對(duì)這種變化進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。4.3信號(hào)通路介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制4.3.1相關(guān)信號(hào)通路的篩選與驗(yàn)證為了深入探究MicroRNA調(diào)控HO-1過程中涉及的信號(hào)通路，本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，借助DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）等數(shù)據(jù)庫和工具，對(duì)MicroRNA的靶基因進(jìn)行功能富集分析。通過對(duì)與HO-1調(diào)控相關(guān)的MicroRNA（如miR-122、miR-200a、miR-34a等）的靶基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因在多條信號(hào)通路中顯著富集，其中包括PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Nrf2/ARE信號(hào)通路等。基于生物信息學(xué)分析結(jié)果，本研究選取了PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Nrf2/ARE信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)肺癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，以評(píng)估信號(hào)通路的激活狀態(tài)。以PI3K/AKT信號(hào)通路為例，當(dāng)在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-122mimics后，檢測(cè)到PI3K的催化亞基p110α的磷酸化水平降低，AKT的磷酸化水平也明顯下降，這表明miR-122可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控HO-1的表達(dá)。在MAPK信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)染miR-200amimics后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平均發(fā)生改變，其中ERK的磷酸化水平降低較為明顯，提示miR-200a可能通過影響MAPK信號(hào)通路中ERK的激活，對(duì)HO-1的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些信號(hào)通路在MicroRNA調(diào)控HO-1中的作用，本研究使用了信號(hào)通路特異性抑制劑。在肺癌細(xì)胞中，加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002后，HO-1的表達(dá)水平明顯降低，且這種降低作用與轉(zhuǎn)染miR-122mimics后的效果具有相似性。當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-122mimics和加入LY294002時(shí)，HO-1的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，表明PI3K/AKT信號(hào)通路在miR-122調(diào)控HO-1的過程中發(fā)揮了重要作用。同樣地，對(duì)于MAPK信號(hào)通路，使用ERK抑制劑U0126處理肺癌細(xì)胞后，HO-1的表達(dá)受到抑制，且與miR-200a對(duì)HO-1的調(diào)控具有協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了MAPK信號(hào)通路參與了miR-200a對(duì)HO-1的調(diào)控。在Nrf2/ARE信號(hào)通路中，使用Nrf2激活劑叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）處理肺癌細(xì)胞，可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)。而當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-34amimics抑制HO-1表達(dá)后，再加入tBHQ，HO-1的表達(dá)上調(diào)幅度明顯減弱，表明miR-34a可能通過干擾Nrf2/ARE信號(hào)通路，影響HO-1的表達(dá)。4.3.2信號(hào)通路與MicroRNA-HO-1軸的交互作用信號(hào)通路與MicroRNA-HO-1軸之間存在著復(fù)雜的交互作用，這種交互作用在肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中具有重要意義。一方面，MicroRNA可以通過調(diào)控信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，影響信號(hào)通路的激活，進(jìn)而間接調(diào)控HO-1的表達(dá)。如前文所述，miR-122通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路中p110α和AKT的磷酸化，抑制該信號(hào)通路的激活，從而下調(diào)HO-1的表達(dá)。這種調(diào)控作用可能是通過miR-122與PI3K/AKT信號(hào)通路中相關(guān)基因的mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程實(shí)現(xiàn)的。研究表明，miR-122可以靶向PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85α，抑制其表達(dá)，從而減少PI3K的活性，進(jìn)一步抑制AKT的磷酸化，最終導(dǎo)致HO-1表達(dá)下調(diào)。另一方面，信號(hào)通路的激活或抑制也可以反過來影響MicroRNA的表達(dá)。在PI3K/AKT信號(hào)通路激活的情況下，通過轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，可能會(huì)導(dǎo)致某些MicroRNA的表達(dá)發(fā)生改變。當(dāng)肺癌細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子刺激，PI3K/AKT信號(hào)通路被激活時(shí)，miR-122的表達(dá)水平會(huì)明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路激活后，下游的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB被激活，NF-κB可以結(jié)合到miR-122基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致miR-122表達(dá)下調(diào)。這種MicroRNA表達(dá)的改變又會(huì)影響其對(duì)HO-1的調(diào)控作用，形成一個(gè)復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。在MAPK信號(hào)通路中，ERK的激活可以調(diào)控一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)影響MicroRNA的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)肺癌細(xì)胞受到紫外線照射等應(yīng)激刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，ERK磷酸化水平升高。激活的ERK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，使其與DNA結(jié)合能力增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，Elk-1可以結(jié)合到miR-200a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR-200a的轉(zhuǎn)錄。miR-200a表達(dá)上調(diào)后，會(huì)抑制HO-1的表達(dá)，從而對(duì)肺癌細(xì)胞在應(yīng)激條件下的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。Nrf2/ARE信號(hào)通路與MicroRNA-HO-1軸之間同樣存在交互作用。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激等條件下，Nrf2被激活并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)HO-1等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，Nrf2的激活也可能影響MicroRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可以調(diào)控miR-34a的表達(dá)，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2的激活會(huì)導(dǎo)致miR-34a表達(dá)下調(diào)。miR-34a表達(dá)下調(diào)后，對(duì)HO-1的抑制作用減弱，從而使得HO-1表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。這種交互作用使得細(xì)胞能夠在不同的生理病理?xiàng)l件下，通過信號(hào)通路和MicroRNA-HO-1軸的協(xié)同調(diào)控，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。五、MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響5.1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響5.1.1體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為深入探究MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，本研究選用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299作為研究對(duì)象。將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組、miR-122mimics組、miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組、miR-122inhibitor組、miR-122inhibitor+HO-1siRNA組。其中，miR-122mimics組轉(zhuǎn)染miR-122模擬物以過表達(dá)miR-122；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組在轉(zhuǎn)染miR-122模擬物的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HO-1過表達(dá)質(zhì)粒；miR-122inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑以抑制miR-122的表達(dá)；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組在轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑的同時(shí)，轉(zhuǎn)染HO-1siRNA以沉默HO-1的表達(dá)。正常對(duì)照組則轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值），以此反映細(xì)胞的增殖情況。后續(xù)每隔24小時(shí)檢測(cè)一次OD值，連續(xù)檢測(cè)5天。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，miR-122mimics組細(xì)胞的OD值顯著降低，表明過表達(dá)miR-122能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖。在miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組中，HO-1過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-122對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，細(xì)胞的OD值有所升高，但仍低于正常對(duì)照組。miR-122inhibitor組細(xì)胞的OD值明顯高于正常對(duì)照組，說明抑制miR-122的表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。而在miR-122inhibitor+HO-1siRNA組中，沉默HO-1的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，OD值降低，甚至低于正常對(duì)照組。通過繪制細(xì)胞增殖曲線，可以更直觀地看出各組細(xì)胞的增殖趨勢(shì)。正常對(duì)照組細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，增殖迅速；miR-122mimics組細(xì)胞增殖緩慢，曲線斜率明顯低于正常對(duì)照組；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組細(xì)胞的增殖曲線斜率介于miR-122mimics組和正常對(duì)照組之間；miR-122inhibitor組細(xì)胞增殖加快，曲線斜率大于正常對(duì)照組；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，曲線斜率最小。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各組間OD值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.1.2體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，本研究構(gòu)建了小鼠移植瘤模型。選取6-8周齡的BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為5組，每組6只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每只1×10?個(gè)的數(shù)量懸浮于100μLPBS中，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開始進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分組與體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)一致，分別為正常對(duì)照組、miR-122mimics組、miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組、miR-122inhibitor組、miR-122inhibitor+HO-1siRNA組。miR-122mimics組通過瘤內(nèi)注射miR-122模擬物脂質(zhì)體復(fù)合物（100pmol/μL，50μL）；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組在注射miR-122模擬物脂質(zhì)體復(fù)合物的同時(shí)，瘤內(nèi)注射HO-1過表達(dá)質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物（10μg/μL，50μL）；miR-122inhibitor組注射miR-122抑制劑脂質(zhì)體復(fù)合物（100pmol/μL，50μL）；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組在注射miR-122抑制劑脂質(zhì)體復(fù)合物的同時(shí)，瘤內(nèi)注射HO-1siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物（10μg/μL，50μL）；正常對(duì)照組注射陰性對(duì)照序列脂質(zhì)體復(fù)合物（100pmol/μL，50μL）。每隔3天進(jìn)行一次注射，共注射5次。從接種腫瘤細(xì)胞開始，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，正常對(duì)照組腫瘤體積迅速增大。miR-122mimics組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，體積顯著小于正常對(duì)照組。miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組腫瘤體積較miR-122mimics組有所增大，但仍小于正常對(duì)照組。miR-122inhibitor組腫瘤生長(zhǎng)加速，體積明顯大于正常對(duì)照組。miR-122inhibitor+HO-1siRNA組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，體積小于miR-122inhibitor組，甚至小于正常對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織并稱重。結(jié)果與腫瘤體積測(cè)量結(jié)果一致，miR-122mimics組腫瘤重量明顯低于正常對(duì)照組，miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組腫瘤重量介于miR-122mimics組和正常對(duì)照組之間，miR-122inhibitor組腫瘤重量顯著高于正常對(duì)照組，miR-122inhibitor+HO-1siRNA組腫瘤重量低于miR-122inhibitor組，且低于正常對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各組間腫瘤體積和重量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.2對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響5.2.1凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)為深入探究MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。選用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299作為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、miR-122mimics組、miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組、miR-122inhibitor組、miR-122inhibitor+HO-1siRNA組。其中，miR-122mimics組轉(zhuǎn)染miR-122模擬物以過表達(dá)miR-122；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組在轉(zhuǎn)染miR-122模擬物的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HO-1過表達(dá)質(zhì)粒；miR-122inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑以抑制miR-122的表達(dá)；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組在轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑的同時(shí)，轉(zhuǎn)染HO-1siRNA以沉默HO-1的表達(dá)。正常對(duì)照組則轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞重懸于100μL1×AnnexinV結(jié)合緩沖液中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinV結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)光波長(zhǎng)488nm下檢測(cè)，通過分析AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，區(qū)分出正?；罴?xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，miR-122mimics組早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著增加，表明過表達(dá)miR-122能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。在miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組中，HO-1過表達(dá)部分抑制了miR-122誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例較miR-122mimics組有所降低，但仍高于正常對(duì)照組。miR-122inhibitor組早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例明顯低于正常對(duì)照組，說明抑制miR-122的表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞凋亡。而在miR-122inhibitor+HO-1siRNA組中，沉默HO-1的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞凋亡明顯增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著高于miR-122inhibitor組，甚至高于正常對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各組間早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.2.2凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化為進(jìn)一步探究MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達(dá)水平。將各組細(xì)胞裂解，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后，分別加入抗Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9和β-actin的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，miR-122mimics組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高。在miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組中，HO-1過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-122對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，Bcl-2蛋白表達(dá)有所升高，Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)有所降低，但仍與正常對(duì)照組存在差異。miR-122inhibitor組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)降低。而在miR-122inhibitor+HO-1siRNA組中，沉默HO-1的表達(dá)后，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9的mRNA表達(dá)水平。提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。通過分析PCR擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果與蛋白水平檢測(cè)結(jié)果一致，miR-122mimics組Bcl-2mRNA表達(dá)降低，Bax、caspase-3和caspase-9mRNA表達(dá)升高；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組Bcl-2mRNA表達(dá)有所升高，Bax、caspase-3和caspase-9mRNA表達(dá)有所降低；miR-122inhibitor組Bcl-2mRNA表達(dá)升高，Bax、caspase-3和caspase-9mRNA表達(dá)降低；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組Bcl-2mRNA表達(dá)顯著降低，Bax、caspase-3和caspase-9mRNA表達(dá)顯著升高。綜合上述結(jié)果，表明MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1可以通過影響凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，調(diào)控肺癌細(xì)胞的凋亡過程。miR-122通過抑制HO-1的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡；而抑制miR-122的表達(dá)或過表達(dá)HO-1則抑制肺癌細(xì)胞凋亡。5.3對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響5.3.1侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果為深入探究MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。選用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299作為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、miR-122mimics組、miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組、miR-122inhibitor組、miR-122inhibitor+HO-1siRNA組。其中，miR-122mimics組轉(zhuǎn)染miR-122模擬物以過表達(dá)miR-122；miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組在轉(zhuǎn)染miR-122模擬物的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HO-1過表達(dá)質(zhì)粒；miR-122inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑以抑制miR-122的表達(dá)；miR-122inhibitor+HO-1siRNA組在轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑的同時(shí)，轉(zhuǎn)染HO-1siRNA以沉默HO-1的表達(dá)。正常對(duì)照組則轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列。Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的各組細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，上室預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被，以模擬細(xì)胞外基質(zhì)；對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，上室則不包被Matrigel基質(zhì)膠。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)（遷移實(shí)驗(yàn)）或48小時(shí)（侵襲實(shí)驗(yàn)）后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。然后將小室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，miR-122mimics組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明過表達(dá)miR-122能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在miR-122mimics+HO-1過表達(dá)組中，HO-1過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-122對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量較miR-122mimics組有所增加，但仍低于正常對(duì)照組。miR-122inhibitor組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，說明抑制miR-122的表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。而在miR-122inhibitor+HO-1siRNA組中，沉默HO-1的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到明顯抑制，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著低于miR-122inhibitor組，甚至低于正常對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各組間穿過膜的細(xì)胞數(shù)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.3.2相關(guān)分子機(jī)制探討MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1影響肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在此過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。研究表明，HO-1的表達(dá)變化可以調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)HO-1表達(dá)上調(diào)時(shí)，會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。HO-1可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和ZEB1等的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而使E-cadherin的表達(dá)降低。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞間的黏附力減弱，細(xì)胞極性喪失。HO-1還可以下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和細(xì)胞角蛋白等上皮標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白（Vimentin）、N-cadherin等的表達(dá)。這些變化使得肺癌細(xì)胞逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。而當(dāng)miR-122過表達(dá)抑制HO-1表達(dá)時(shí)，會(huì)抑制肺癌細(xì)胞的EMT過程。miR-122可以通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，減少Snail、Slug和ZEB1等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這使得E-cadherin的表達(dá)得以維持，上皮細(xì)胞間的黏附力增強(qiáng)，細(xì)胞極性保持穩(wěn)定。miR-122還可以直接靶向Vimentin和N-cadherin等間質(zhì)標(biāo)志物的mRNA，抑制其翻譯過程，從而降低這些間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。這些作用共同導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的EMT過程受到抑制，侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。MicroRNA調(diào)節(jié)HO-1還可能通過影響細(xì)胞外基質(zhì)降解酶和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，進(jìn)一步影響肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-2和MMP-9是兩種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件